Fioriniae水和氯蓝莓和越橘花提取物的研究进展

该协议提供了一个廉价和适应性强的系统，以评估氟化学线索的时间动力学对科勒托特里克鲁姆菲奥尼亚和其他植物病原体感染术语开花。新型地板雨水收集设备使用户能够以近乎实时的场地特定方式监测影响病原体发育的自然兴奋剂和条件。从自然受感染的宿主的 Colletotrichum fiorniae 区域性开始此过程，如文本协议中所述。

当菌落开始孢子，条纹锥形到另一个V8果汁加糖含有细胞培养皿，以产生高密度孢子培养。经过七天的生长，使用标准的无菌回路，通过轻轻触摸环到同质质量，从高密度培养中收集少量锥形。搅拌到含有10毫升无菌去化水的15毫升离心管中。

漩涡这个样品10秒。使用标准移液器，多次上下俯冲，以进一步混合样品。然后将涡旋样品的一滴放在血细胞计上，并估计孢子浓度。

将浓度调整为每毫升无菌蒸馏水10万锥度，最终体积为5毫升。这被称为孢子悬浮液，仅在使用任何一种生物测定之前立即进行。要进行氯仿花卉萃取，用 95%乙醇清洁所有组件两次。

然后用氯仿清洁部件两次，防止每次萃取受到污染。不要用氯仿清洁 PTFE 衬里盖，因为会损坏它们。清洁后，将部件放在一边，倒置干燥。

将一部分加工的花与烧杯中的九部分氯仿混合，加入花，然后加入氯仿。轻轻旋转 30 秒，通过不锈钢屏幕将应变到第二个烧杯中。将第二杯烧杯中的氯仿提取物倒入玻璃培养管中，并贴上PTFE盖。

用副膜包裹盖子以防止蒸发。将由此产生的氯仿花卉提取物储存在黑暗中，以减少四摄氏度的光降解，直到实验使用。使用多个样本重复提取以提供复制。

要为每个选定位置创建收集设备，请使用连接到钻头压上的步长位在喷杯底部钻孔。然后从孔顶部切一条直线到喷杯口。现在钻四个等距孔，大到足以在喷雾杯口螺纹塑料涂层线。

连接塑料涂层导线的一端，使一端自由。钻一个足够大的孔，将喷漆或杯适配器螺纹入 50 毫升离心机盖中。用准膜密封适配器螺纹，以防止泄漏。

将其连接到喷雾器杯的离心机盖和螺纹部分。然后连接配合的50毫米离心管。每个采样位置创建四个收集设备。

通过弯曲喷雾器杯在选定位置部署设备，以适合茎。使用连接到其他茎的塑料涂层导线向上定向喷雾器杯的切割侧。这确保了通过花朵的水被捕获。

为了从蔓越莓花中收集雨水，首先使用金属探针在漏斗口周围热穿刺八个等距孔。将扭曲领带插入四个孔中。将另一端连接到该孔的对面位置，形成整齐的交叉图案。

用副膜将漏斗向下包裹蒸汽并放在一边。钻一个足够大的孔，将漏斗向下插入 50 毫升离心机盖中，并带一步位。将准备好的漏斗插入离心机盖中。

降雨或架空灌溉后，拆下并更换离心管的底管部分。雨水收集管应在湿润事件后迅速改变，因为它们容易因径流中产生的自然污染物（如细菌和其他真菌）而降解。将两层纸盘放在培养皿中，用两毫升无菌蒸馏水浸泡。

接下来，将同等体积的无菌蒸馏水和水性花卉提取物混合到两毫升微离心管中。然后将等量的孢子悬浮液添加到准备好的两毫升微离心管中。所得制剂称为水处理混合物。

对于控制，省略花卉提取物部分，代之以无菌蒸馏水，以保持凝结浓度的一致性。现在，将预清洁的玻璃盖玻片放在浸泡的纸巾上，放在细胞培养皿内。将水处理混合物的 40 微升液滴放在盖玻片的中心。

重复此操作，以进行所需的治疗，包括控制。然后关闭细胞培养皿。一旦所有治疗和复制被分配，将所有复制的细胞培养皿放入一个密封的塑料容器中，并在25摄氏度的黑暗中孵育。

在预先确定的时间点，在液滴上添加 10 微升的固定剂，停止生长并半保留安装。添加固定液后，小心地反转盖玻片，将每个盖玻片的液滴侧向下放在玻璃显微镜幻灯片上，以便于显微检查。当所有盖玻片都放在玻璃显微镜玻片上时，让它们在流罩中沉淀并部分干燥 20 分钟。

数一数封面上出现的所有锥形， 包括初级锥形， 发芽的锥形， 和新形成的二次锥形， 以及压印。以 400 倍的放大倍率或 200 倍的放大率工作，总面积为 3.808 平方毫米。在层流罩中，将两个相等体积的无菌蒸馏水和一卷孢子悬浮液添加到两毫升微离心管中。

将这种水处理混合物放在一边，用于氯仿基花卉提取物生物测定。在烟罩中，将 Van T 细胞放在准备好的塑料细胞培养盘中的玻璃盖玻片上。将 33 微升所需的氯仿花卉提取物分配到细胞中心，并允许干燥。

不要触摸单元格的墙壁。对于控制处理，添加原始氯仿。一旦氯仿为基础的花卉提取物干燥，将99微升的预制水处理混合物与标准移液器进入Van T细胞的中心。

然后关闭所有细胞培养皿并孵育。在预先确定的时间点，在 Van T 细胞中加入 15 微升固定剂，让它至少坐 5 分钟，以确保足够的真菌染色。之后，小心地取出范T细胞。

执行盖玻片反转和数据采集步骤。在接种后24小时对C.fiorniae进行微观评估后，在无菌蒸馏水与水性花卉提取物存在的情况下，锥形图的比较显示二次结膜和压血形成显著增加。然而，在比较氯仿生物测定无菌蒸馏水对照与氯仿基提取物时，二次一次凝结并不明显。

相反，C.fiorniae生长转向压抑形成。在这项检测中，在接种后零、六、十二和二十四小时对无菌蒸馏水控制和基于蔓越莓氯仿的花卉萃取物进行了目视检查。在氯仿基花卉提取物中，从六小时开始形成，并在随后的时间点稳步增加。

这一结果支持了花减少形成感染结构所需时间这一发现。水果腐烂真菌的疾病管理往往涉及开花时间杀菌剂的应用。在这里，从蔓越莓的多个生长阶段的蔓越莓氯仿提取物在接种后24小时被目视地评估为C.fiorniae上的有效表面蜡。

6月收集的卵巢，7月收集的未成熟水果，8月采集的水果在10月采集，并检查了无菌蒸馏水控制，以进行压榨形成。基于卵巢氯仿的提取物具有最大的压层形成，表明在C.fiorniae的生命周期中开花的重要性。病原体是该协议最重要的组成部分。

真菌应定期转移到新介质上，以保持试验之间的一致性。出于安全原因，使用氯仿的任何工作都必须在烟罩中进行。这包括材料和玻璃器皿的制备、提取程序以及氯仿基生物测定的传导。

可以使用时间点、病原体、花卉雨水收集或宿主提取的组合来评估各种宿主-病原体相互作用。雨水收集装置和相关生物测定将使其他人能够与许多路径系统中的降雨活动期间调动的宿主兴奋剂一起工作。