激光微辐照在哺乳动物细胞单、双链断裂修复中的应用

该程序的总体目标是使用共聚焦荧光显微镜激光器在细胞的亚核区域诱导 DNA 损伤。这种方法可以帮助回答 DNA 修复的关键问题，例如蛋白质如何在 DNA 损伤位点募集和保留。该技术的主要优点是它允许实时可视化感兴趣的蛋白质，因此可以构建募集和保留的概况。

通过将包含感兴趣细胞的腔室载玻片置于保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的载物台顶部培养箱中来开始此过程。使用编码的自动显微镜载物台配准图像场。选择培养容器的可识别特征，例如孔之间的屏障。

收集图像并记录 X-Y 位置。这将允许在样品制备后对齐和配准所选字段的 X-Y 位置。图像配准完成后，选择微照射区域并聚焦样品。

对于表达荧光标记蛋白的细胞，在感兴趣的荧光通道中选择具有最大核横截面的焦平面。关注细胞核的最大横截面至关重要，因为它确保焦点以细胞核为中心，以监测目标蛋白质募集到诱导损伤部位的情况。在细胞核内选择一个清晰的特征，例如核仁，并在观察这种外观变化的同时上下移动焦平面。

真正的焦平面将位于从明到暗的过渡范围内。要聚焦样本，请选择所选特征具有最清晰对比度的焦平面。下一步是注册感兴趣字段的位置。

在显微镜软件中创建一个 3 x 3 像素的正方形感兴趣区域 （ROI）。将此 ROI 放在要受损的细胞核上，并将此 ROI 设置为受损的 ROI。收集损伤前图像，包括损伤 ROI 的位置。

获取在目标蛋白质的荧光通道中包含明场的图像。这些细胞现在已准备好进行激光微照射。在本演示中，405 纳米激光器将以 100% 的功率使用。

405 纳米激光剂量是通过调制扫描速率并对选定的损伤 ROI 执行一次扫描来控制的。在这个实验中，使用每秒 8 帧和 0.5 帧进行 405 纳米的微照射。选择合适的激光功率来破坏细胞对于分离不同的 DNA 修复途径至关重要。

对损伤后的明场和荧光通道进行延时图像采集。调整延时摄影的持续时间和频率以优化数据收集，理想情况下捕获荧光蛋白在损伤 ROI 下的积累及其在实验过程中的解离。时间过程完成后，选择一个新的损伤细胞区域，并继续显微照射和延时成像，直到达到所需的受损细胞数量。

建议每个选定条件 10 到 25 个细胞。为了增加免疫荧光分析的总细胞数量，损伤培养容器内的其他区域，以产生损伤后反应的多区域时间进程。记录每个字段的 X-Y 位置和损坏发生的时间。

细胞可以在损伤后立即修复，也可以在固定前修复选定的时间增量。要开始此分析，请在图像分析应用程序（如 NIS-Elements）中打开采集的图像。对于每个要测量的细胞，首先生成代表细胞核的参考 ROI。

对包含构成细胞核的像素的荧光信号使用阈值算法，然后将该区域转换为 ROI。接下来，创建一个 6 x 6 像素的 ROI 并将其置于损害 ROI 之上。这个更大的 ROI 现在是分析的损害 ROI。

对于每个要测量的细胞，记录参考和损伤 ROI 的平均荧光强度。对于时间过程的每一帧，调整参考 ROI 以确保 ROI 准确覆盖核区域，并调整损伤 ROI 以确保覆盖受损点。记录时间过程每一帧的每个 ROI 内荧光信号的平均荧光强度。

对于每个细胞，将平均损伤 ROI 荧光强度标准化为延时每一帧中其相应的参考 ROI 的荧光强度。在这里，平均核荧光强度用作参考 ROI，并通过从平均损伤 ROI 荧光强度中减去平均参考 ROI 荧光强度来进行归一化。对所有受损细胞以及至少两个未受损的对照细胞重复标准化。

最后，绘制随时间标准化强度值的图表，以显示募集动力学的变化作为实验治疗的函数。在损伤诱导前后对稳定表达 XRCC1-GFP 的细胞进行照射和成像。观察 XRCC1-GFP 对损伤 ROI 的募集并测量募集的动力学。

使用两个标记检查双链断裂的形成。对于这两个标志物，在 355 纳米处的两次低剂量刺激在照射后 5 分钟和 20 分钟没有反应，在照射后 10 分钟引起微弱且可变的反应。在 355 纳米处进行 10 秒高剂量微照射，在照射后 5 分钟、10 分钟和 20 分钟，损伤 ROI 内的荧光信号增加，在 40 分钟时降低。

这些结果表明，DNA 双链断裂标记物在 355 纳米微照射下以剂量依赖性方式响应。相比之下，无论施加的剂量如何，405 纳米激光刺激都导致两个标志物在损伤 ROI 内显着积累。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 4 小时内对 10 个细胞进行。

在执行此技术时，重要的是要根据被监测的修复过程定制激光波长和施加的功率。在此程序之后，可以进行免疫荧光以回答有关募集额外蛋白质或磷酸化状态变化或其他翻译后修饰的问题。该技术使研究人员能够探索 DNA 修复蛋白的动态募集，并更好地确定蛋白质结构域和突变如何影响对 DNA 损伤的识别和反应。

看完这个视频，你应该对如何使用激光扫描共聚焦显微镜诱导 DNA 损伤和监测 DNA 修复蛋白的募集有一个很好的了解。不要忘记，使用激光和甲醛等化学品可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护设备。