膜蛋白的实时测量：受体相互作用使用表面等离子体共振（SPR）

以下实验的总体目标是证明使用表面等离子体和共振的蛋白质受体相互作用。这是通过将镍离子注入硝基三乙酸或 NT a 基质来实现的。接下来，在空白注射后，将一种称为配体的蛋白质固定在传感器芯片上。

将第二种称为分析物的蛋白质注射到固定化配体上。为了检测两种蛋白质之间的相互作用，结果表明，两种蛋白质瞬时相互作用，分析物结合，并从配体上解离。相互作用的亲和力可以根据测量的两种蛋白质的解离和解离速率来计算。

与现有方法（如 Pull Down 或免疫沉淀）相比，该技术的主要优点是它可以识别通常具有重大生物学后果的瞬时或低亲和力相互作用。这种方法可以帮助回答生物化学中的关键问题，例如感兴趣的蛋白质是否与另一种蛋白质或另一种小分子结合，可以确定相互作用的性质并可以测量亲和力。要制备样品，请按照文本方案中的说明从纯化的蛋白质中去除所有聚集体。

准备电泳缓冲液，并使用零点 22 微米过滤器过滤所有缓冲液和蛋白质样品。在将正在运行的缓冲液瓶连接到泵入口之前，提前确保过滤器与蛋白质兼容。将 10 毫升电泳缓冲液放在单独的试管中。

然后用电泳缓冲液稀释样品，以避免缓冲液不匹配。根据经验，为了实现稳定的配体松动，使用低配体浓度和低流速较长的进样时间，而不是高配体浓度 在高流速下进行较短的进样时间 将浓缩的配体原液稀释到电泳缓冲液中，最终浓度约为 20 μg/mL。最后将分析物稀释到电泳缓冲液中至所需浓度。

对于亲和力未知的系统，以 10 倍稀释度测试从 10 微摩尔到 10 阿诺摩尔的分析物浓度范围。在本演示中，重复使用了适用于捕获带有 oli 组氨酸标签的蛋白质的 NTA 偶联芯片。从缓冲液中取出储存的芯片后，用双蒸水彻底冲洗，轻轻晾干，然后放入其原始护套中。

要将芯片对接到 SPR 仪器上，请打开传感器芯片门并将芯片放入护套中。关上门并按下 dock chip（基座芯片）。将芯片单元温度设置为 25 摄氏度。

将样品室设置为 7 摄氏度，以在整个实验过程中保持蛋白质稳定。按照文本方案中的说明制备用于上样和剥离的溶液后，用电泳缓冲液灌注 SPR 仪器。下一步，将流速设置为 50 μL/min。

定义流径和参考减法以获得此处描述的结果。将路径设置为 1 号流通池、2 号流通池和 1 号流通池，从 2 号流通池中减去，选择合适的样品架后，在开始实验之前保存结果文件，以便在运行期间保存数据。每个实验都由周期组成。

清楚地记录每个循环中完成的进样，并将上样缓冲液空白进样和分析物进样的配体分到不同的循环中。第一个周期是切屑准备和镍加载。确保流路和路径已设置，然后注入 350 毫摩尔 EDTA 1 分钟以洗去剩余的分子。

接下来，将流速设置为每分钟 10 微升。然后注射 0.5 毫摩尔氯化镍 2 分钟。现在，芯片树脂被镍离子涂覆。

第二周期是配体固定。将流速设置为 15 μL/min，并将流路设置为流通池。第二步，注射配体 A，直到达到配体分子量 10 至 20 倍的反应单位或 R ru 值。

例如，将 50 道尔顿的配体加载到 501， 000 rus 之间。记录所达到的 RU 值。然后将流速设置为每分钟 15 微升，流路到 1 号流通池，注射对照配体 B 至与配体 A 相同的 RU 值，监测减法，sensori Graham 在线帮助控制注射长度。

接下来，将流速设置为 50 μL/min，并将流路设置为 1 号流通池和流通池。第二，继续清洗系统 5 到 20 分钟，直到基线稳定下来。第三周期是空白注射。

此注入将用于空白减法。因此，包括将要注入分析物的所有组分，但分析物本身除外。进样时长可能因达到平衡所需的时间而异。

将流速设置为 15 μL/min，并将流路设置为 1 号流通池和 2 号流通池，以及 1 号流通池，从流通池中减去。第二，插入 weight 命令 30 秒以实现稳定的基线。然后注入电泳缓冲液 13 秒。

等待 120 到 600 秒以记录解离阶段。此步骤的长度根据 kd 而变化。解离越慢，此步骤需要的时间就越长。

第四个周期是分析物进样。复制并粘贴循环 3 中使用的确切条件，以便稍后可以减去这两次进样。将机架中插槽的位置从存放对照溶液的插槽更改为存放分析物溶液的插槽。

选择略高于预期平衡解离常数的浓度。如果没有可用的先验知识，请选择一种微摩尔作为良好的起点。在第二次执行缓冲液进样和分析物进样后，执行第 7 个循环的芯片脱扣。

将流速设置为 50 μL/min，然后注入 350 mmol EDTA，持续 1 分钟。再重复此步骤两次。请勿使用一次注射 3 分钟，因为这可能会损坏芯片。

接下来，注入 0.25% 硫酸钠 1 分钟。重复此步骤两次。请勿使用单次进样 3 分钟，因为这可能会在镍负载后损坏芯片，目标转运蛋白被固定在 2 号流通池上，最高可达 3 500 R rus。

然后使用相同的流速和注射持续时间，将对照配体注射到 1 号流动槽上，最初仅达到 3000 R，以确保在两个流动槽上固定相似的蛋白质量。对照配体通过更短的进样时间进一步加载，同时监测高达 3， 500 RDU 的负载。阶梯形状表示每次进样时 1 号流通池质量的逐渐增加，此处显示的是从流通池中减去的 1 号流通池。

第二，重要的是要改变配体注射的持续时间以实现相等的负载。相反，对于用于获得定量数据的所有浓度，分析物进样的持续时间必须保持恒定。注入一系列分析物浓度。

此处显示的是进样长度恒定的不同分析物浓度的进样。以随机顺序进样不同浓度的分析物，并在分析前将双空白 sensori gram 进行 x 轴对齐，以获得亲和力和速率常数。应用模型拟合。

计算出的 mod BCA 相互作用的平衡解离常数大约是负 6 摩尔的 10 倍的三倍，一旦掌握，就会出现中等快的 KA 和快的 KD。这个技术可以在 Hit 观看此视频后的几个小时内完成。您应该对如何使用目标蛋白设计和进行 SPR 实验有很好的了解。