利用表面等离子共振（SPR）实时测量膜蛋白与受体的相互作用

以下实验的总体目标是利用表面等离子共振技术演示蛋白质受体相互作用。该过程通过将镍离子注入至亚硝基三乙酸（NTA）基质上实现。随后，在进行空白注射后，将一种称为配体的蛋白质固定在传感器芯片上。

第二种被称为分析物的蛋白质被注入到固定的配体上。为了检测这两种蛋白质之间的相互作用，结果表明，这两种蛋白质发生瞬时相互作用，即分析物与配体结合后又解离。根据测得的两种蛋白质的解离和结合速率，可计算出它们相互作用的亲和力。

与现有的下拉法或免疫共沉淀等方法相比，该技术的主要优势在于能够鉴定那些通常具有重要生物学意义的瞬时性或低亲和力的相互作用。该方法有助于回答生物化学领域的一些关键问题，例如目标蛋白是否与另一个蛋白或小分子发生结合，可确定相互作用的性质，并测量其亲和力。在样品制备过程中，需按照文本方案所述，从纯化的蛋白中去除所有聚集体。

配制电泳缓冲液，并使用0.22微米滤器过滤所有缓冲液和蛋白质样品。在将电泳缓冲液瓶连接至泵入口前，务必预先确认滤器与蛋白质相容。另取10毫升电泳缓冲液置于单独的离心管中备用。

然后用流动相缓冲液稀释样品，以避免缓冲液不匹配。一般原则是，为了实现稳定的配体解离，应采用较低的配体浓度、较长的注入时间以及较低的流速，而不是使用高配体浓度、较短的注入时间及高流速。将浓缩的配体储备液用流动相缓冲液稀释至终浓度约为每毫升20微克。最后，将分析物用流动相缓冲液稀释至所需浓度。

对于亲和力未知的系统，应测试从 10 微摩尔到 10 阿摩尔的分析物浓度范围，按十倍梯度稀释进行。在本演示中，重复使用一种适合捕获带有寡组氨酸标签蛋白的 NTA 耦合芯片。从缓冲液中取出保存的芯片后，用双蒸水充分冲洗，轻柔干燥，并放回其原始护套中。

将芯片装入 SPR 仪器时，打开传感器芯片门，将芯片放入其鞘套中。关闭舱门并点击“dock chip”（装入芯片）。将芯片池温度设置为 25 摄氏度。

将样品室温度设置为七摄氏度，以在整个实验过程中保持蛋白质的稳定性。按照文本方案中的描述准备好上样和清洗溶液后，用运行缓冲液对表面等离子共振（SPR）仪器进行预平衡。下一步，将流速设置为每分钟50微升。

设定流路并定义参考扣除，以获得此处所述的结果。选择合适的样品架后，设置流路为一号流路单元和二号流路单元，并将一号流路单元从二号流路单元中扣除，然后在开始实验前保存结果文件，以便在运行过程中自动保存数据。每个实验由多个循环组成。

详细记录每个循环中完成的注射操作，并将配体、缓冲液空白注射和分析物注射分别安排在不同的循环中。第一个循环用于芯片准备和镍离子加载。确保流路和通道设置正确后，注入350毫摩尔的EDTA持续一分钟，以洗去残留分子。

接下来，将流速设置为每分钟10微升。然后注入0.5毫摩尔的氯化镍，持续两分钟。此时，芯片树脂已由镍离子包被。

第二步是配体固定化。将流速设置为15微升每分钟，并将流路设置为流通池。第二步，注入配体A，直至响应单位（RU值）达到配体分子量的10至20倍。

例如，将分子量为50千道尔顿的配体加载至501,000响应单位（RU）之间，并记录达到的RU值。然后将流速设置为每分钟15微升，流路设置为流通池1号，注入对照配体B，使其达到与配体A相同的RU值，同时监测减法过程，通过在线传感器图谱监控以控制注射时长。

接下来，将流速设置为 50 微升每分钟，流路设置为流通池一和流通池二，继续清洗系统 5 到 20 分钟，直至基线稳定。第三步循环为空白进样。

该注射用于空白扣除。因此，应包含除分析物本身外所有将与分析物一同注入的组分。注射时长可根据达到平衡所需时间进行调整。

将流速设置为每分钟15微升，并将流路设置为流池一和流池二，以及流池一减去流池二。输入持续30秒的称重指令以获得稳定的基线。然后注入运行缓冲液13秒。

等待 120 至 600 秒以记录解离相。此步骤的时长取决于 kd 值。解离越慢，此步骤所需时间越长。

第四次循环为分析物注入。复制并粘贴第三次循环中使用的完全相同的条件，以便后续对这两次注入进行减法处理。将样品架中槽位的位置从盛有对照溶液的更换为盛有分析物溶液的槽位。

选择一个略高于预期平衡解离常数的浓度。若无先前知识，可选择一微摩尔作为合适的起始点。在重复进行一次缓冲液注射和分析物注射后，对第七个芯片进行三次循环冲洗。

将流速设置为 50 微升每分钟，然后注入 350 毫摩尔 EDTA 持续一分钟。重复此步骤两次。请勿使用一次三分钟的连续注入，因为这可能会损坏芯片。

接下来，注入 0.25% 十二烷基硫酸钠持续一分钟。重复此步骤两次。切勿使用一次三分钟的注入，因为这可能在镍负载后损坏芯片。目标转运蛋白在镍负载后被固定至第二号流动池，直至达到 3,500 R.U.。

然后采用相同的流速和注入时间，将对照配体注入到第一号流动池中，初始注入量仅达到3000 R，以确保两个流动池上固定的蛋白量相近。随后通过较短时间的多次注入继续加载对照配体，同时监测其加载量直至达到3,500共振单位（RDU）。阶梯状曲线表示每轮注入后第一号流动池上质量的逐步增加，此处显示的是第一号流动池减去参比流动池后的信号。

第二，为了实现均等的结合量，必须调整配体注射的持续时间。相比之下，为了获得定量数据，分析物注射的持续时间必须在所有使用的浓度下保持恒定。需依次注射一系列不同浓度的分析物。

此处展示的是在固定注射时长下，不同分析物浓度的注射结果。不同浓度的分析物以随机顺序进行注射，在分析前将双空白传感图沿x轴对齐，以确定亲和力和速率常数。随后应用模型拟合。

mod BCA 相互作用的计算平衡解离常数约为 3×10⁻⁶ M，具有中等快速的 KA 和快速的 KD。掌握该技术后，观看本视频后可在数小时内完成实验。您应能够充分理解如何设计并开展以目标蛋白为基础的 SPR 实验。