Name: 膜蛋白的实时测量：受体相互作用使用表面等离子体共振（SPR） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用表面等离子体共振技术实时检测膜蛋白受体相互作用的方法。本实验演示配体固定、分析物注入及结合动力学测定过程，帮助研究人员无标记研究蛋白质结合亲和力。

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Lewinson 实验室的研究工作得到了以色列科学学院、Rappaport 生物医学研究所、MerieuX 研究基金会以及 Marie Curie 职业回归资助（OL）的资助。EV 获得了 Fine 奖学金和以色列理工学院医学院的资助。NLL 得到了以色列科学学院资助项目的资助。

1. 蛋白质样品与缓冲液的制备
<ol>
	<li>样品制备：纯化目标蛋白，并通过在实验前将蛋白上样至凝胶过滤柱或进行超速离心（通常在100,000 × g下离心10分钟即可）以确保去除所有聚集体。 
	注意：尽管高纯度的蛋白质样品是理想选择，但并非必需。表面等离子共振（SPR）技术已成功应用于纯度不够理想的情况，甚至可直接使用总提取物。8,9.</li>
	<li>缓冲液制备：
	<ol>
		<li>准备实验缓冲液（称为“运行缓冲液”或 RB）。对于本方案中描述的实验，使用 50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl 和 0.05% (w/v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltoside)。需注意，缓冲液成分的选择可根据所研究的体系进行相应调整。</li>
		<li>使用 0.22 µm 滤膜过滤所有缓冲液和蛋白质样品。务必提前确认滤膜适用于蛋白质。通常情况下，近期上市的 SPR 平台均配备在线脱气装置；若无此装置，则在使用前对缓冲液进行脱气处理。</li>
		<li>过夜透析或用RB稀释样品，以避免缓冲液不匹配。当使用高黏度化学试剂时，尤其建议进行透析（或其他缓冲液置换方法）。例如，蔗糖、甘油、DMSO）。在将RB瓶连接至泵入口之前，先另取10 ml RB置于单独的离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将浓缩的配体储备液用RB缓冲液稀释至终浓度约为20 µg/ml。作为经验法则，为实现稳定的配体固定化，应采用较低的配体浓度、较低的流速和较长的注入时间，而不是高浓度、高流速和短时间注入。</li>
	<li>将待测物用RB稀释至所需浓度。通常，对于亲和力未知的体系，以十倍梯度稀释法测试从10 µM到10 nM范围内的浓度。始终从较低浓度开始。</li>
</ol>
2. 传感器芯片
<ol>
	<li>芯片选择：使用偶联了亚氨二乙酸（NTA）的芯片，适用于捕获带有寡聚组氨酸标签的蛋白质。</li>
	<li>芯片使用：
	<ol>
		<li>使用新芯片时，从护套中取出芯片，用双蒸水（DDW）轻轻冲洗，用精密擦拭纸小心吸干残留液体，注意不要触碰金层表面。将芯片按正确方向放回护套中（方向正确时插入顺畅）。</li>
		<li>重复使用芯片时，从保存缓冲液中取出芯片，用双蒸水（DDW）彻底冲洗，并如上所述轻轻干燥后，放回原护套中。 
		注意：芯片表面非特异性杂质的积累可能影响其“可用性”。可通过比较配体固定化前与解离后的响应单位（RUs）来监测此情况。尽管同一块NiNTA芯片可进行多次检测，但其使用寿命并无明确界限，不同芯片之间差异较大。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>芯片装载：打开传感器芯片舱门，将带护套的芯片放入。使用新芯片时，输入芯片序列号以记录使用信息。关闭舱门并点击“装载芯片”。</li>
</ol>
3. 温度设置
<ol>
	<li>将芯片细胞温度设置为 25 °C（或实验所需的其他温度）。</li>
	<li>可选：将样品室设置为 7 °C，以在整个实验过程中保持蛋白质的稳定性。</li>
</ol>
4. 上样与洗脱溶液
配制以下用于上样和洗脱的溶液：含 0.5 mM NiCl2 的 RB 溶液、含 350 mM EDTA 的 RB 溶液（向 EDTA 溶液中加入去垢剂，使其终浓度与 RB 中一致）、0.25% SDS 的 H2O 溶液，以及 100 mM HCl 的 H2O 溶液。当使用微型离心管而非 SPR 专用管时，切记剪去管盖顶部。
5. 使用 RB 缓冲液对 SPR 仪器进行预处理
6. 开始新运行
<ol>
	<li>设置实验过程中将使用的流速。为获得此处描述的结果，请将流速设为 50 µl/min。 
	注意：该参数可在实验过程中修改。</li>
	<li>定义流路及参考扣除方式。为获得此处描述的结果，请设置流路 Fc=1 和 Fc=2，扣除方式为 Fc=2-1。 
	注意：程序将实时显示两个测量池的差值信号。请注意，该参数在实验过程中无法更改。</li>
	<li>选择合适的样品架（这可能影响样品体积消耗量）。</li>
	<li>保存结果文件。</li>
</ol>
7. 实验循环
每个实验由多个循环组成，需清晰记录每个循环中完成的进样操作，并将配体的加载、缓冲液的空白进样以及分析物的进样分在不同的循环中进行。
<ol>
	<li>循环 1：芯片准备与镍离子加载
	<ol>
		<li>确保流路和路径设置符合步骤 6.1 和 6.2 的要求。</li>
		<li>注入 350 mM EDTA 持续 1 分钟，以洗去残留物。</li>
		<li>将流速设为 10 µl/min。</li>
		<li>注入 0.5 mM NiCl2 持续 2 分钟。 
		注意：此时芯片树脂已结合镍离子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 2：配体固定
	<ol>
		<li>将流速设为 15 µl/min，流路设为 Fc=2。</li>
		<li>注入配体 A，直至达到其分子量的 10–20 倍的响应单位（RU）值。例如，对于分子量为 50 kDa 的配体，应加载至 500–1,000 RU。记录所达到的 RU 值。</li>
		<li>将流速设为 15 µl/min，流路设为 Fc=1。</li>
		<li>注入配体 B（对照）至与配体 A 相同的 RU 值。在线监测差减传感图（Fc=2-1），以帮助控制注入时间。</li>
		<li>将流速设为 50 µl/min，流路设为 Fc=1 和 Fc=2，清洗系统 5–20 分钟，直至基线（Fc=2-1）稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 3：空白注入。该注入用于空白差减，因此应包含除分析物本身外，后续与分析物共注入的所有组分。 
	注意：注入时长可根据达到平衡所需时间（信号趋于平稳）而调整。
	<ol>
		<li>将流速设为 15 µl/min，流路设为 Fc=1 和 Fc=2，进行 Fc=2-1 差减。</li>
		<li>插入“等待”命令（以下简称“等待”）30 秒（以获得稳定基线）。</li>
		<li>注入 15 秒运行缓冲液（RB）。 
		注意：注入持续时间因系统而异，取决于其预平衡动力学常数（主要是 ka）。</li>
		<li>等待 120–600 秒以记录解离相。 
		注意：此步骤时长取决于 kd：解离越慢，所需时间越长。对于解离极慢的复合物（kd &#60;10-4 sec-1），等待 10–15 分钟后进入表面再生步骤（见后文）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 4：分析物注入
	<ol>
		<li>复制/粘贴参考注入（循环 3）中使用的完全相同条件，以便后续进行差减。将样品槽在支架上的位置从对照溶液更换为分析物溶液。选择略高于预期 KD 的浓度。若无先验知识，可选择 1 µM 作为合适的起始浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 5：缓冲液注入
	<ol>
		<li>重复循环 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 6：分析物注入
	<ol>
		<li>重复循环 4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环 7：芯片剥离
	<ol>
		<li>将流速设为 50 µl/min。</li>
		<li>注入 350 mM EDTA 持续 1 分钟，重复此步骤两次。请勿使用单次 3 分钟注入，以免损坏芯片。</li>
		<li>注入 0.25% SDS 持续 1 分钟，重复此步骤两次。请勿使用单次 3 分钟注入，以免损坏芯片。</li>
		<li>若未恢复至基线水平，可额外注入 100 mM HCl 持续 1 分钟作为进一步剥离步骤。</li>
		<li>插入“结束运行”命令，使仪器进入待机模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>芯片储存
	<ol>
		<li>将传感器芯片卸下并从仪器中取出。</li>
		<li>将传感器从护套中取出，避免触碰表面，用去离子水（DDW）冲洗后，置于含有运行缓冲液（RB）的 50 ml 离心管中。于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 使用指定评估软件进行数据分析
<ol>
	<li>在推导动力学参数之前，执行以下步骤处理 SPR 获得的原始数据。
	<ol>
		<li>使用评估软件打开结果文件，选择第3至第6个循环，Fc = 2-1（已减去参考信号的数据）。</li>
		<li>轴偏移：
		<ol>
			<li>显示第3至第6个循环。</li>
			<li>将所有四条曲线的基线（每个循环中最初的30秒等待时间）的Y轴值归零。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将四条曲线的 X 轴对齐。选择明显的特征点（例如，注射开始或结束的尖峰）使四条曲线在X轴上完全对齐。将分析物（或对照缓冲液）开始的时间设为零。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参考扣除
	<ol>
		<li>通过从第4个循环的曲线中减去第3个循环的曲线，以及从第6个循环的曲线中减去第5个循环的曲线，来扣除背景响应。使用Y轴偏移菜单中的曲线相减功能进行操作。 
		注意：执行此步骤非常重要，因为它可消除可能影响表面折射率的任何非特异性组分（与分析物无关的成分）。
		<ol>
			<li>将相减后的曲线以不同的名称保存在项目的表格中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将这些曲线称为“双重减法曲线”：第一次减法是对两次注射均进行的2-1减法，第二次减法是将一条曲线从另一条曲线中减去。 
		注意：这种双重参照是表面等离子共振（SPR）实验的金标准。</li>
		<li>通过如前所述的轴向平移对相减后的曲线进行叠加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动力学常数的测定与模型拟合
	<ol>
		<li>进行动力学实验
		<ol>
			<li>注射6-7个不同浓度的分析物，以获得可靠的数据用于动力学常数的测定。分析物浓度的选择范围应为估计值的10倍以上至10倍以下 KD，进行2-3倍稀释。包括“零”浓度样本，后续用于双参考减法（见上文）。每一样本设三个重复，并按随机顺序进样。</li>
			<li>在尝试模型拟合之前，需先对所有曲线进行Y轴和X轴方向的对齐与减法处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>模型拟合
		<ol>
			<li>选择一个合适的分析程序。 
			注意：大多数现有的拟合程序提供了多种模型，可用于拟合数据并确定动力学常数。</li>
			<li>采用最简单的模型（Langmuir 模型）进行拟合，该模型假设分析物与配体之间存在可逆的 1:1 相互作用。除非有其他实验方法提供的充分数据证明存在更复杂的相互作用，否则应始终使用简单的 Langmuir 模型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+a+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161(2012).</li>
<li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+RNA%E2%80%93protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li>
<li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
<li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li>
<li>Mol, N., Fischer, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMol%2C+N+%22Surface+Plasmon+Resonance+Vol.+627+Methods+in+Molecular+Biology%22">Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology</a>. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).</li>
<li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Merwe%2C+PA+%22Surface+plasmon+resonance.+Protein%E2%80%93+ligand+interactions%3A+hydrodynamics+and+calorimetry%22">Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry</a>. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
</ol>

所有作者声明均无竞争性经济利益。

表面等离子体共振（SPR）是一种研究分子相互作用的高度敏感方法，通常是唯一能够实时监测瞬时（但重要）相互作用的技术。本文所展示的瞬时相互作用即为一例，该相互作用无法通过其他任何方法（如pull-down实验、脂质体沉降实验6）检测到。此外，尽管其他方法仅限于平衡状态的测量（无论是定量还是定性），SPR却是少数能够同时测量平衡前动力学的实验技术之一。
其高灵敏度同时也是其需要注意的局限性。假阳性传感图谱很容易被记录下来。因此，建议在进行 SPR 测量之前，先使用其他方法验证相互作用的存在。事先了解系统的特性（如对 KD 的粗略评估、稳定结合与瞬时相互作用的区别）对于设计 SPR 实验以及评估所获得数据的功能相关性非常有帮助。在开始 SPR 测量前需要特别注意的一个问题是蛋白质样品的质量。SPR 对聚集物高度敏感，因此必须从配体和分析物的制备物中去除聚集物（尽可能通过凝胶过滤层析或超速离心法）。另一个噪声和假信号的来源可能是运行缓冲液（RB）与分析物缓冲液之间的不匹配。这一问题可通过将分析物对运行缓冲液进行...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）；蛋白质复合物的形成与解离，是多种生物过程中的关键事件例如复制、转录、翻译、信号传导、细胞间通讯）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的半定量研究通常通过下拉实验（pull-down）或免疫共沉淀实验（immuno-precipitation）进行。然而，由于这些（及类似）技术本身包含洗涤步骤，其可检测的亲和力范围受限（通常仅限于低微摩尔及更高亲和力），因而无法识别那些虽为瞬时或低亲和力、却常具有重要生物学意义的相互作用。此外，此类“终点法”技术的时间分辨率极低，通常比反应实际速率慢数个数量级。表面等离子共振（SPR）技术因其更高的灵敏度和优异的时间分辨率，能够克服上述局限性。1,2表面等离子体共振（SPR）是一种无标记检测方法，因此只要能够检测到质量变化，即可用于测量分子间相互作用。除了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）外，该技术还被广泛用于表征蛋白质-配体、蛋白质-药物（或小分子）、蛋白质-DNA以及蛋白质-RNA相互作用。 3-5结果被实时记录并绘制成图，从而能够快速调整实验条件并灵活设计实验方案。
基于表面等离子共振（SPR）技术的仪器所依据的物理原理是利用光学系统检测传感器表面因质量变化引起的折射率改变2。其中一个相互作用的分子（以下简称配体）被固定在聚合物基质芯片上，另一个分子（以下简称分析物）则流经该表面。分析物与配体的结合会改变芯片表面的质量，这种质量变化与表面折射率的变化呈直接且正比关系。结果以响应单位（RU）随时间变化的形式实时绘出，此类曲线称为传感图（例如，图1）。由于SPR可监测整个相互作用的时间进程，因此除了可测定平衡亲和力外，还能获得平衡前的动力学速率常数。如下文所述，特定系统的平衡前行为包含大量信息，能够提供与仅分析平衡状态截然不同的视角。一旦系统完成校准，实验过程非常迅速，仅需微量蛋白质材料（微克至纳克量级）。获取特定系统的完整动力学信息可在数天内完成。SPR的高灵敏度使其能够实现其他任何技术都无法完成的测量6。然而，这种高灵敏度也是一把“双刃剑”，可能成为假阳性数据的主要来源。任何影响折射率的因素都会被记录并呈现在传感图上。因此，必须设置适当的对照以排除假阳性结果，同时强烈建议结合其他互补性方法加以验证。
图1展示了使用NTA包被的传感器芯片进行SPR实验的进程。A图中的传感图显示了镍离子注入NTA基质的过程（未减去背景数据），而B-D图显示的是减去阴性对照细胞信号后的数据。红色和蓝色箭头分别表示注入的开始和结束。配体固定到芯片的过程逐步改变质量，直至注入终止。配体注入结束后观察到的稳定平台期反映了配体与表面的稳定结合（图1B，第2个循环）。当达到稳定基线后，向配体和参比细胞注入缓冲液（图1B，第3个循环）。该次注入作为“空白对照”，在分析过程中将被减去。注入时记录到微小变化，反映了物质流经芯片的过程。随后在另一个独立循环中（图1B，第4个循环），注入分析物；响应单位（RU）的逐步增加代表分析物与配体的结合过程。结合位点逐渐被占据，直至达到平衡。一旦注入结束，RU值的下降反映了复合物的解离过程。通过此类传感图可推导出平衡前和平衡时的反应速率常数（见后文）。图1描绘了配体与分析物之间的瞬时相互作用。当相互作用更稳定时，RU值的下降更缓慢，表明解离速率常数kd更低。
本文描述了一项表面等离子体共振（SPR）实验，旨在表征膜转运蛋白（经去垢剂溶解）与其功能性伴侣——对应的底物结合蛋白之间相互作用的特性6,7。所选用的模型系统为来自Archeoglobus fulgidus的ATP结合盒（ABC）转运蛋白ModBC-A。该系统因其结果高度可重复、信噪比高以及具有典型的“开/关”速率而被选用。此外，还存在同源的ABC转运蛋白，可作为重要的阴性对照。转运蛋白ModBC（配体A）通过去垢剂从膜中提取，经纯化后固定于芯片表面；其可溶性相互作用伴侣ModA作为分析物。作为阴性对照配体，使用另一种ABC转运蛋白RbsBC（“配体B”）。

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>NTA传感器芯片&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 软件&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镍</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>二水合钨酸钠</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Bio-Lab LTD.</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷（DDM）</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>尼龙（NY）膜过滤器</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC ABC 转运蛋白</td><td>Lewinson 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RbsBC ABC 转运蛋白</td><td>Lewinson 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ModA 底物结合蛋白</td><td>Lewinson 实验室</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用表面等离子共振（spr）实时测量膜蛋白与受体的相互作用

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

蛋白质-蛋白质相互作用在大多数（即使不是全部）生理过程中都至关重要，理解这些相互作用的本质是生物学研究的核心步骤之一。表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一种高灵敏度的检测技术，可用于实时、无标记地研究生物分子间的相互作用。在典型的SPR实验中，其中一个组分（通常为一种蛋白质，称为“配体”）被固定在传感器芯片表面，而另一个组分（“分析物”）则游离于溶液中，并被注入流经该表面。分析物与配体之间的结合与解离过程被实时监测，并以传感图（sensogram）的形式绘制成曲线，从中可获取达到平衡前及平衡状态下的相关数据。由于SPR技术无需标记、样品消耗量少，并能提供平衡前的动力学数据，因此在研究蛋白质相互作用动态过程时，常成为首选方法。然而需要注意的是，由于该方法具有很高的灵敏度，所获得的数据必须经过仔细分析，并需结合其他生物化学方法加以验证。
表面等离子共振（SPR）特别适用于研究膜蛋白，因为它消耗的纯化材料量少，并且与脂质和去垢剂相容。本方案描述了一项SPR实验，用于表征膜蛋白（ABC转运蛋白）与可溶性蛋白（该转运蛋白对应的底物结合蛋白）之间相互作用的动力学特性。

在本文所述系统中，使用 NiNTA 芯片固定带有 His 标签的膜转运蛋白 6,7由于是同源二聚体，每个转运蛋白均带有双重标签，从而增强其与NiNTA芯片的结合。在镍离子负载后，将配体A（目标转运蛋白）固定于Fc=2通道，直至约3,500 RU（程序循环2， 图2A 黑色标签）。随后，在相同的流速和进样时长下，将配体B（对照配体）注入Fc=1，初始结合水平仅达到约3,000 RU。为确保两个流通池中固定化的蛋白量相近，继续采用较短时间进样方式向Fc=1加载配体B，并密切监测固定化过程，直至达到3,500 RU。图中“阶梯”状曲线表示每次进样后Fc=1上质量逐步增加的情况图2A 灰色标签）。在线监测 Fc=2-1 有助于控制配体的均等加载。 图 2B 演示 Fc=2-1 相减方法， 即，通过从 Fc=1 中 RU 值的逐步增加量中减去 Fc=2 中的最大 RU 值。重要的是，应调整配体注射的持续时间，以实现待研究配体与对照配体的等量负载。相反，在注射分析物时，所有使用浓度的注射持续时间必须保持一致。...

表面等离子体共振（SPR）是一种无需标记、可实时检测生物分子相互作用的方法。本文描述了一项膜蛋白与受体相互作用实验的实验方案，并讨论了该技术的优缺点。

利用表面等离子共振（SPR）实时测量膜蛋白与受体的相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用对大多数（即使不是全部）生理过程至关重要，理解这些相互作用的本质是生物学研究的核心……

以下实验的总体目标是利用表面等离子共振技术演示蛋白质受体相互作用。该过程通过将镍离子注入至亚硝基三乙酸（NTA）基质上实现。随后，在进行空白注射后，将一种称为配体的蛋白质固定在传感器芯片上。第二种被称为分析物的蛋白质被注入到固定的配体上。为了检测这两种蛋白质之间的相互作用，结果表明，这两种蛋白质发生瞬时相互作用，即分析物与配体结合后又解离。根据测得的两种蛋白质的解离和结合速率，可计算出它们相互作用的亲和力。与现有的下拉法或免疫共沉淀等方法相比，该技术的主要优势在于能够鉴定那些通常具有重要生物学意义的瞬时性或低亲和力的相互作用。该方法有助于回答生物化学领域的一些关键问题，例如目标蛋白是否与另一个蛋白或小分子发生结合，可确定相互作用的性质，并测量其亲和力。在样品制备过程中，需按照文本方案所述，从纯化的蛋白中去除所有聚集体。配制电泳缓冲液，并使用0.22微米滤器过滤所有缓冲液和蛋白质样品。在将电泳缓冲液瓶连接至泵入口前，务必预先确认滤器与蛋白质相容。另取10毫升电泳缓冲液置于单独的离心管中备用。然后用流动相缓冲液稀释样品，以避免缓冲液不匹配。一般原则是，为了实现稳定的配体解离，应采用较低的配体浓度、较长的注入时间以及较低的流速，而不是使用高配体浓度、较短的注入时间及高流速。将浓缩的配体储备液用流动相缓冲液稀释至终浓度约为每毫升20微克。最后，将分析物用流动相缓冲液稀释至所需浓度。对于亲和力未知的系统，应测试从 10 微摩尔到 10 阿摩尔的分析物浓度范围，按十倍梯度稀释进行。在本演示中，重复使用一种适合捕获带有寡组氨酸标签蛋白的 NTA 耦合芯片。从缓冲液中取出保存的芯片后，用双蒸水充分冲洗，轻柔干燥，并放回其原始护套中。将芯片装入 SPR 仪器时，打开传感器芯片门，将芯片放入其鞘套中。关闭舱门并点击“dock chip”（装入芯片）。将芯片池温度设置为 25 摄氏度。将样品室温度设置为七摄氏度，以在整个实验过程中保持蛋白质的稳定性。按照文本方案中的描述准备好上样和清洗溶液后，用运行缓冲液对表面等离子共振（SPR）仪器进行预平衡。下一步，将流速设置为每分钟50微升。设定流路并定义参考扣除，以获得此处所述的结果。选择合适的样品架后，设置流路为一号流路单元和二号流路单元，并将一号流路单元从二号流路单元中扣除，然后在开始实验前保存结果文件，以便在运行过程中自动保存数据。每个实验由多个循环组成。详细记录每个循环中完成的注射操作，并将配体、缓冲液空白注射和分析物注射分别安排在不同的循环中。第一个循环用于芯片准备和镍离子加载。确保流路和通道设置正确后，注入350毫摩尔的EDTA持续一分钟，以洗去残留分子。接下来，将流速设置为每分钟10微升。然后注入0.5毫摩尔的氯化镍，持续两分钟。此时，芯片树脂已由镍离子包被。第二步是配体固定化。将流速设置为15微升每分钟，并将流路设置为流通池。第二步，注入配体A，直至响应单位（RU值）达到配体分子量的10至20倍。例如，将分子量为50千道尔顿的配体加载至501,000响应单位（RU）之间，并记录达到的RU值。然后将流速设置为每分钟15微升，流路设置为流通池1号，注入对照配体B，使其达到与配体A相同的RU值，同时监测减法过程，通过在线传感器图谱监控以控制注射时长。接下来，将流速设置为 50 微升每分钟，流路设置为流通池一和流通池二，继续清洗系统 5 到 20 分钟，直至基线稳定。第三步循环为空白进样。该注射用于空白扣除。因此，应包含除分析物本身外所有将与分析物一同注入的组分。注射时长可根据达到平衡所需时间进行调整。将流速设置为每分钟15微升，并将流路设置为流池一和流池二，以及流池一减去流池二。输入持续30秒的称重指令以获得稳定的基线。然后注入运行缓冲液13秒。等待 120 至 600 秒以记录解离相。此步骤的时长取决于 kd 值。解离越慢，此步骤所需时间越长。第四次循环为分析物注入。复制并粘贴第三次循环中使用的完全相同的条件，以便后续对这两次注入进行减法处理。将样品架中槽位的位置从盛有对照溶液的更换为盛有分析物溶液的槽位。选择一个略高于预期平衡解离常数的浓度。若无先前知识，可选择一微摩尔作为合适的起始点。在重复进行一次缓冲液注射和分析物注射后，对第七个芯片进行三次循环冲洗。将流速设置为 50 微升每分钟，然后注入 350 毫摩尔 EDTA 持续一分钟。重复此步骤两次。请勿使用一次三分钟的连续注入，因为这可能会损坏芯片。接下来，注入 0.25% 十二烷基硫酸钠持续一分钟。重复此步骤两次。切勿使用一次三分钟的注入，因为这可能在镍负载后损坏芯片。目标转运蛋白在镍负载后被固定至第二号流动池，直至达到 3,500 R.U.。然后采用相同的流速和注入时间，将对照配体注入到第一号流动池中，初始注入量仅达到3000 R，以确保两个流动池上固定的蛋白量相近。随后通过较短时间的多次注入继续加载对照配体，同时监测其加载量直至达到3,500共振单位（RDU）。阶梯状曲线表示每轮注入后第一号流动池上质量的逐步增加，此处显示的是第一号流动池减去参比流动池后的信号。第二，为了实现均等的结合量，必须调整配体注射的持续时间。相比之下，为了获得定量数据，分析物注射的持续时间必须在所有使用的浓度下保持恒定。需依次注射一系列不同浓度的分析物。此处展示的是在固定注射时长下，不同分析物浓度的注射结果。不同浓度的分析物以随机顺序进行注射，在分析前将双空白传感图沿x轴对齐，以确定亲和力和速率常数。随后应用模型拟合。mod BCA 相互作用的计算平衡解离常数约为 3×10⁻⁶ M，具有中等快速的 KA 和快速的 KD。掌握该技术后，观看本视频后可在数小时内完成实验。您应能够充分理解如何设计并开展以目标蛋白为基础的 SPR 实验。

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