乳腺癌细胞系外周血单核细胞破的人前临床模型的建立

该协议描述了一个体外的发展, 从外周血单核细胞中培养的乳癌细胞系破人前模型, 模拟癌细胞-破骨细胞的相互作用。该模型可用于进一步了解骨转移形成和改善治疗方案。

这种源自外周血单核细胞 （PBMC） 的体外人类破骨细胞生成模型的总体目标是模拟癌细胞破骨细胞相互作用。这种方法可以帮助回答骨转移领域关于癌细胞和骨细胞相互作用在骨微环境中的影响的关键问题。该技术的主要优点是它是一个完全人类的临床前模型。

此外，这种方法可以提供对骨转移的见解。它也可以应用于其他骨骼相关病理机制的研究，例如骨质疏松症。由于健康供体之间的差异以及选择合适的 PBMC 细胞密度，不熟悉这种方法的个体可能会遇到困难。

这种方法的视觉演示至关重要，因为他们需要查看我们的 PBMC 选择和接种步骤需要一些手动经验才能达到熟练程度。首先在 PBS 中以 1：1 的比例在 EDTA 中稀释至少 20 毫升健康供体全血。充分混合后，将血液溶液分成 30 mL等分试样，装在 50 mL锥形管中。

小心地将 15 毫升淋巴细胞分离培养基嵌入每根试管的底部。通过密度梯度离心分离细胞。并将含有血沉棕黄层的白色单核细胞拉入新的 15 毫升试管中。

用 20 mL PBS 洗涤收获的细胞两次，每次洗涤一次，然后在冰上用 5 mL 红细胞裂解缓冲液裂解红细胞 3 至 5 分钟。用 20 毫升 PBS 终止反应，并通过离心收集白细胞。重悬沉淀并完成 alpha M-E-M 进行计数。

然后，在 24 孔板的每个孔中，将细胞接种在 7 个点 5 乘以 10 至每平方厘米 5 PBMC 浓度，以便在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育。大约三小时后，从培养物中去除上清液、碎片、未附着的细胞和未裂解的红细胞。并加入新鲜培养基，补充 MCSF。

接种后 14 天，用 PBS 洗涤细胞 2 次，并在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。根据制造商的说明进行陷阱染色。破骨细胞样细胞将呈 TRAP 阳性，至少有四个细胞核。

在显微镜下以 10 倍放大倍率手动计数破骨细胞样细胞。对于癌细胞诱导的破骨细胞分化，当癌细胞达到 90% 汇合时，它们通过胰蛋白酶消化分离，并以 4 乘以 10 的浓度接种到零点 4 微米孔插入物上，浓度为每平方厘米 3 个细胞在新鲜 α MEM 中。第二天，将接种的插入片段放在完全 ALPHA M-E-M 中的未分化 1 天铺板单核细胞培养物上，并每 2 到 3 天更换一次培养基。

然后，在共培养开始 11 天后，将插入片段转移到新板中，该板包含用于所需下游分析的适当试剂。乳腺癌细胞可以维持破骨细胞生成，因为癌细胞诱导的孔中破骨细胞的数量与在阳性生长因子对照孔中获得的数量相似。然而，当细胞用抗肿瘤药物治疗时，在所有培养物中观察到的破骨细胞数量减少。

有趣的是，生长因子衍生的成熟破骨细胞的表面积大于癌细胞诱导的表面积。在抗肿瘤药物处理的培养物中未观察到这种效果。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 7 个 8 小时内完成。

在此程序之后，可以进行额外的下游分析，如基因表达分析、Western Blot、免疫荧光分析或 ELISA，以回答有关癌细胞/骨细胞相互作用或抗肿瘤药物机制的其他问题。开发后，这项技术为骨转移领域的研究人员在全人类临床前模型中研究骨微环境铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何共培养单核细胞，与癌细胞进行分化有一个很好的了解。

不要忘记，处理生物样本和药物可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验室外套。