乳腺癌细胞系外周血单核细胞破的人前临床模型的建立
2017年9月13日
该协议描述了一个体外的发展, 从外周血单核细胞中培养的乳癌细胞系破人前模型, 模拟癌细胞-破骨细胞的相互作用。该模型可用于进一步了解骨转移形成和改善治疗方案。
这种源自外周血单核细胞 （PBMC） 的体外人类破骨细胞生成模型的总体目标是模拟癌细胞破骨细胞相互作用。这种方法可以帮助回答骨转移领域关于癌细胞和骨细胞相互作用在骨微环境中的影响的关键问题。该技术的主要优点是它是一个完全人类的临床前模型。
此外，这种方法可以提供对骨转移的见解。它也可以应用于其他骨骼相关病理机制的研究，例如骨质疏松症。由于健康供体之间的差异以及选择合适的 PBMC 细胞密度，不熟悉这种方法的个体可能会遇到困难。
这种方法的视觉演示至关重要，因为他们需要查看我们的 PBMC 选择和接种步骤需要一些手动经验才能达到熟练程度。首先在 PBS 中以 1：1 的比例在 EDTA 中稀释至少 20 毫升健康供体全血。充分混合后，将血液溶液分成 30 mL等分试样，装在 50 mL锥形管中。
小心地将 15 毫升淋巴细胞分离培养基嵌入每根试管的底部。通过密度梯度离心分离细胞。并将含有血沉棕黄层的白色单核细胞拉入新的 15 毫升试管中。
用 20 mL PBS 洗涤收获的细胞两次，每次洗涤一次，然后在冰上用 5 mL 红细胞裂解缓冲液裂解红细胞 3 至 5 分钟。用 20 毫升 PBS 终止反应，并通过离心收集白细胞。重悬沉淀并完成 alpha M-E-M 进行计数。
然后，在 24 孔板的每个孔中，将细胞接种在 7 个点 5 乘以 10 至每平方厘米 5 PBMC 浓度，以便在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育。大约三小时后，从培养物中去除上清液、碎片、未附着的细胞和未裂解的红细胞。并加入新鲜培养基，补充 MCSF。
接种后 14 天，用 PBS 洗涤细胞 2 次，并在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。根据制造商的说明进行陷阱染色。破骨细胞样细胞将呈 TRAP 阳性，至少有四个细胞核。
在显微镜下以 10 倍放大倍率手动计数破骨细胞样细胞。对于癌细胞诱导的破骨细胞分化，当癌细胞达到 90% 汇合时，它们通过胰蛋白酶消化分离，并以 4 乘以 10 的浓度接种到零点 4 微米孔插入物上，浓度为每平方厘米 3 个细胞在新鲜 α MEM 中。第二天，将接种的插入片段放在完全 ALPHA M-E-M 中的未分化 1 天铺板单核细胞培养物上，并每 2 到 3 天更换一次培养基。
然后，在共培养开始 11 天后，将插入片段转移到新板中，该板包含用于所需下游分析的适当试剂。乳腺癌细胞可以维持破骨细胞生成，因为癌细胞诱导的孔中破骨细胞的数量与在阳性生长因子对照孔中获得的数量相似。然而，当细胞用抗肿瘤药物治疗时，在所有培养物中观察到的破骨细胞数量减少。
有趣的是，生长因子衍生的成熟破骨细胞的表面积大于癌细胞诱导的表面积。在抗肿瘤药物处理的培养物中未观察到这种效果。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 7 个 8 小时内完成。
在此程序之后，可以进行额外的下游分析，如基因表达分析、Western Blot、免疫荧光分析或 ELISA，以回答有关癌细胞/骨细胞相互作用或抗肿瘤药物机制的其他问题。开发后，这项技术为骨转移领域的研究人员在全人类临床前模型中研究骨微环境铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何共培养单核细胞，与癌细胞进行分化有一个很好的了解。
不要忘记，处理生物样本和药物可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验室外套。
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概述
该协议描述了一种体外人类临床前破骨细胞发育模型的开发，该模型使用培养有乳腺癌细胞系的外周血单核细胞，以模拟癌细胞与破骨细胞的相互作用。该模型可以帮助回答关于骨转移的关键问题并改善治疗选择。
关键研究组成部分
科学领域
- 破骨细胞发育
- 骨转移
- 癌细胞相互作用
背景
- 该模型使用外周血单核细胞（PBMCs）。
- 它旨在复制癌细胞与破骨细胞之间的相互作用。
- 这项研究对于理解骨相关的病理具有重要意义。
- 健康供体之间的差异可能会影响结果。
研究目的
- 模拟癌细胞-破骨细胞相互作用。
- 研究这些相互作用在骨微环境中的影响。
- 提供关于骨转移和相关疾病的见解。
使用的方法
- 用乳腺癌细胞系培养PBMCs。
- 评估破骨细胞发育。
- 评估癌细胞和骨细胞的相互作用。
- 分析PBMCs细胞密度的变异性。
主要结果
- 该模型成功模拟了癌细胞-破骨细胞相互作用。
- 获得的见解可以为骨转移的治疗策略提供信息。
- 潜在的应用扩展到其他骨相关疾病。
- 挑战包括供体变异性和细胞密度选择。
结论
- 这个人类临床前模型对于研究骨转移很有价值。
- 它增强了对癌细胞在骨微环境中相互作用的理解。
- 未来的研究可以利用这个模型在骨病理学中进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
