一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

本实验的总体目标是建立一种能够紧密模拟人类骨髓细胞及细胞内微环境的培养体系。首先，用工业基质包被组织培养孔的表面，然后将骨髓单个核细胞或其他感兴趣的细胞与骨髓基质混合。

随后，去除工业基质，将细胞基质混合物加入孔中。待基质凝固后，覆盖生长培养基。最终，可直接在基质中观察细胞，或将其分离用于后续分析。与现有的细胞培养方法相比，

例如，标准的组织培养方法或共培养模型，其中细胞在塑料表面生长。使用三维培养方法的主要优势在于，细胞在生理性的微环境中生长，因此可让您在组织的天然条件下研究细胞。准备一个48孔板，用于接种细胞。

首先向每个孔中加入65微升工业涂层溶液，然后将溶液均匀铺展，以覆盖孔的整个表面。该方法也可扩展应用于其他表面。让培养板在室温下孵育至少30分钟。

同时，制备每微升 PBS 中含有 50,000 个细胞的细胞悬液。制备足量悬液，以便向每个孔中加入 10 微升。然后在离心管中，将细胞悬液与每孔 100 微升的重建骨基质轻轻混合，避免产生气泡。

将混合物置于冰上，以防止在板子完成时基质凝固。孵育后，通过抽吸完全去除所有液体和包被溶液。然后向每孔加入100微升充分混匀的含有基质的细胞悬液。

使用移液器迅速倾斜孔板，使液体均匀覆盖孔的整个表面。在加样过程中需不断混匀细胞悬液，因为细胞在完全加载后容易发生聚集。将孔板在无振荡条件下孵育30至60分钟，直至基质凝固。

接下来，将骨髓生长培养基在37摄氏度的水浴中预热。孵育30分钟后，检查基质是否已正确凝固。良好的基质会形成一层柔软的凝胶状层，在倾斜培养板时不会移动。

基质准备好后，使用血清移液管将一毫升培养基逐滴轻柔地覆盖在基质上。然后将组装好的重建骨基质培养物放回培养箱中，最多培养30天，期间无需更换培养基。如果需要更换培养基，每次仅更换一半培养基。

轻轻移除培养基，避免扰动基质层。倾斜培养板，使用移液器轻柔地吸出培养基。切勿在基质层上方抽吸培养基。

染色细胞时，请使用此方法进行溶液更换。从三维培养板孔中移除培养基时，必须从孔的侧壁移除，这一点至关重要。

否则，基质将被破坏，细胞可能丢失。保持使用相同的技术。用无菌的1×PBS洗涤细胞两次，然后向每个样品中加入0.5毫升冰冻的细胞回收溶液。

通过剧烈吹打将整个基质层连同细胞一起移除。每个孔中的收集物转移至微量离心管中，并置于冰上。然后向同一孔中再加入0.5毫升复苏溶液，收集所有剩余材料。

将所有收集物涡旋混匀，并在冰上孵育1小时。孵育期间，每隔15分钟涡旋混匀试管一次，以促进细胞从基质中释放。孵育1小时后，检查混合物中是否存在可见的基质团块。

不应存在任何团块，但如果仍有残留，将混合物转移至更大的离心管中，并额外加入两到五毫升细胞回收溶液。然后将细胞再孵育30至60分钟，期间定期涡旋震荡，并再次检查是否无基质团块存在。

当基质不再成团时，在 4°C 条件下以 1000 RPM 离心混合物 5 至 10 分钟。然后移去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升冷的 1× PBS 中。

重复离心操作。弃去上清液，加入新鲜的 PBS 重悬沉淀，并重复洗涤一次。共洗涤三次。

第三次 PBS 洗涤后，用适当的溶液重悬细胞，用于后续实验步骤。骨髓细胞在重建的骨基质中培养 30 天，并在 200 倍放大倍数下定期通过光学显微镜进行成像观察。基质细胞成分最早在第 5 天被检测到，但在第 14 天时已清晰可见。

在培养期间，细胞通过基质迁移并聚集成明显的细胞簇。随着时间推移，恶性细胞团块不断扩展，以评估在RBM中过度生长的间质成分的组成。同时评估了细胞在RBM与工业涂层交界处的形态学特征。

细胞经纤维连接蛋白、肌动蛋白和细胞核染色。具有间质样形态的细胞经检测显示为前成骨细胞，碱性磷酸酶活性较高。这些细胞能够矿化钙，通过茜素红染色确定。可见脂滴存在的细胞根据油红O染色阳性被鉴定为脂肪细胞。

具有偶见多个细胞核的红细胞被认定为前成骨细胞，并且抗酒石酸酸性磷酸酶染色呈阳性。从三维培养物中分离细胞后，可进行多种操作。例如，可研究在微环境中生长的各种细胞的细胞表型。

您可以研究基因和蛋白质的表达，甚至可以确定这些细胞在三维条件下分泌哪些类型的分子。