Name: 三维组织培养模型研究人类原发性骨髓和恶性肿瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习三维培养系统研究人类原发性骨髓细胞行为的方法。该技术模拟骨髓微环境，支持细胞直接观察和下游分析，有助于深入理解造血过程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了美国国立卫生研究院、国家癌症研究所（1R21CA141039）、BD生物科学研究资助奖、美国癌症协会机构研究资助（IRG #58-006-53）（授予普渡大学癌症研究中心）以及加拿大卫生研究院和阿尔伯塔癌症委员会研究倡议计划的资助。M.P. 受美国国立卫生研究院、国家癌症研究所癌症预防实习项目（R25CA128770；项目负责人：D. Teegarden）资助，该项目由普渡大学肿瘤科学中心和发现学习研究中心负责管理。

1. 预先准备
<ol>
	<li>将无菌刻度移液管和移液器吸头保存在 4 °C。 
	问题排查： Matrigel 在室温（RT）下会凝固；使用预冷的移液管和吸头可防止 Matrigel 在培养建立过程中提前凝固。</li>
	<li>在 4 °C 下过夜解冻一瓶 Matrigel。</li>
</ol>
2. 试剂的准备
<ol>
	<li>纤连蛋白储备液的制备：将100 mg人纤连蛋白溶于100 ml蒸馏水中，配制成1 mg/ml的储备液。待纤连蛋白完全溶解后，经无菌过滤，分装，4 °C保存，可稳定存放长达6个月。 
	问题排查： 如果纤连蛋白未能迅速溶解，将溶液置于37 °C水浴中孵育几分钟。</li>
	<li>10倍稀释液的制备&#160;PBS：溶解 80 g 氯化钠 NaCl、14.4 g Na2HPO4，2 g KCl 和 2.4 g KH2PO4 在1 L蒸馏水中溶解。调节pH至7.4，经无菌滤器过滤后，4 °C保存，可保存长达6个月。</li>
	<li>中和缓冲液的制备20：配制含有100 mM HEPES的2x溶液&#160;磷酸盐缓冲液（PBS），使用 1 M HEPES 和 10x&#160;PBS 储存液。将溶液的 pH 值调节至 7.0。于 4 °C 保存 2 至 3 个月。</li>
	<li>制备2 mg/ml的大鼠尾部I型胶原溶液：用中和缓冲液（步骤2.3）配制2 mg/ml的I型胶原溶液。低速涡旋振荡溶液，并用移液器轻轻吹打混匀。由于该胶原黏度较高，移液时应避免产生气泡。建议每次使用前新鲜配制I型胶原溶液。使用前将溶液置于冰上保存。</li>
	<li>骨内膜包被物（rEnd）的制备：将1 mg/ml的纤连蛋白原液与2 mg/ml的I型胶原原液（步骤2.1和2.4）混合，终浓度分别为77 μg/ml和29 μg/ml，溶于1x&#160;无菌 PBS。混匀后 4 °C 保存，可保存长达 1 个月。</li>
	<li>重建骨基质（rBM）的制备：
	<ol>
		<li>将1.5 ml 微量离心管预冷于冰上。所有基质溶液始终置于冰上保存。</li>
		<li>将4份Matrigel（Matrigel浓度因批次而异，但差异可忽略）、2.5份1 mg/ml纤连蛋白和1份2 mg/ml I型胶原蛋白在冰上混合。先用预冷的枪头将Matrigel加入离心管中，随后加入纤连蛋白和I型胶原蛋白。Matrigel在高于4 °C时会开始凝固，因此移液操作需迅速。通过轻柔吹打充分混匀基质，避免产生气泡。混合重组基底膜（rBM）过程中始终保持离心管置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓生长培养基（BMGM）的制备：配制500 ml含6.2 x 10-4 M CaCl2, 10-6 M 琥珀酸钠，10-6 M 氢化可的松，20% 人血浆（来自健康供体或患者的正常或恶性血浆），以及 1% 青霉素/链霉素，溶于 RPMI-1640 培养基。CaCl2，琥珀酸钠和氢化可的松添加剂可在 -80 °C 下保存 &#62;6个月，1,000倍&#160;储备液。在培养细胞系时，可使用胎牛血清（FBS）替代人血浆。</li>
	<li>10% 中性缓冲福尔马林（NBF）的配制：将37%甲醛储备液加入1x&#160;PBS 按 10% v/v 混合均匀，避光保存于室温，可稳定存放 2–3 周。</li>
	<li>1% 牛血清白蛋白（BSA）的配制：称取适量 BSA，溶于 1x 缓冲液中&#160;PBS。4 °C 保存，1 周内使用。BSA 溶液若冷藏时间过长易发生污染。 alternatively，BSA 溶液可分装后于 -20 °C 冻存以长期保存。避免反复冻融。</li>
	<li>细胞回收溶液（CRS）的制备：配制含5 mM EDTA、1 mM 钒酸钠（Na3视频操作4）以及含有1.5 mM 氟化钠（NaF）的1x溶液&#160;PBS。经无菌过滤后，于4 °C保存，可保存长达6个月。</li>
</ol>
3. 非恶性与恶性人类骨髓细胞的嵌合式三维培养
<ol>
	<li>按照制造商说明书，通过Ficoll-Plaque密度梯度离心法纯化原代骨髓单个核细胞。 
	可选步骤：可根据制造商说明，使用 0.25 μM 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）对细胞进行标记，以在整个培养期间追踪细胞增殖。 
	问题排查： 若细胞在CFSE染色后发生死亡，需对CFSE用量进行滴定，因其浓度依赖于细胞类型；对于原代骨髓单个核细胞，0.25 μM浓度效果良好。</li>
	<li>向48孔组织培养处理板的每个孔中加入65 μl rEnd溶液。将溶液均匀铺展以覆盖孔的整个表面，并孵育 &#62;室温下30分钟</li>
	<li>将细胞悬液调整至密度为 0.5 x 106 10 μl 的 1x 缓冲液中的细胞&#160;每48孔板的孔加入PBS。在1.5 ml微量离心管中，将细胞悬液与每孔100 μl rBM基质混合。通过轻柔吹打混匀细胞与rBM基质；避免产生气泡。将细胞/基质混合物置于冰上，防止基质凝固。 
	注意： rBM 系统具有完全可扩展性；可进行设置&#160;若使用非48孔板规格的系统，应根据所用培养板的表面积调整所有试剂（基质和培养基）的用量，并相应地按比例调整接种细胞数量。</li>
	<li>吸尽残留的rEnd，将细胞/基质混合物加入孔中央。迅速铺匀细胞/基质混合物，使其覆盖整个孔表面。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育30–60分钟。2 将培养板放入组织培养孵育箱中，使基质凝固。孵育期间请勿摇晃或扰动培养板。 
	故障排除： 为防止细胞在rBM中分布不均，接种前需充分混匀。每次取用后均应重新混匀。th 铺板充分，以避免细胞沉降到管底。铺板后，由于基质中的表面张力，细胞不会沉降到孔底。 
	故障排除： 为防止细胞在rBM中分布不均，接种前需充分混匀。每次取用后均应重新混匀。th 接种时需充分混匀，以避免细胞沉降至管底。接种后，由于基质中的表面张力作用，细胞不会沉降至孔底。</li>
	<li>将BMGM置于设定为37 °C的水浴中预热。</li>
	<li>30 分钟后，检查基质是否已正确凝固；此时会形成一层柔软的凝胶样层，当培养板倾斜时该层不会移动。用 1 ml 温热的 BMGM 覆盖细胞/基质层。为避免破坏基质，使用移液管轻柔地逐滴加入培养基。将组装好的 rBM 培养物置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 组织培养箱中培养所需时间。 
	注意： 细胞活力可在不更换培养基的情况下维持至少30天；若需更换培养基，每次仅更换50%。 
	关键步骤： 培养基温度不宜过低，以免低温干扰已凝固的基质。添加培养基时应避免直接冲刷基质表面，以防破坏柔软的基质层。 
	问题排查： 如果在rBM体系中细胞活力较低，在使用骨髓穿刺液以外的原代单个核细胞时，可能需要通过实验确定细胞密度。使用细胞系时，应将细胞数量减少10倍，因为永生化细胞系的增殖速度高于原代细胞。</li>
</ol>
4. “原位”成像
<ol>
	<li>光学显微镜观察
	<ol>
		<li>直接在重组基底膜（rBM）中对培养的细胞进行成像，可使用明场、微分干涉差（DIC）、共聚焦或其他支持长距离成像的显微技术，因为基质厚度约为1 mm。利用显微镜上常见的Z轴层扫功能，从顶部到底部对整个培养物进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色 
	提示：在以下免疫染色步骤中，避免使用抽吸方式移除染色或洗涤液，而应倾斜培养板，用移液器小心吸出液体。
	<ol>
		<li>用移液器移除BMGM，随后用100 μl/次/孔的室温1×&#160;PBS洗涤2–3次。确保使用足够的PBS覆盖孔的整个表面。</li>
		<li>向每孔（48孔板）加入100 μl的10%中性缓冲福尔马林（NBF），室温固定15分钟。移除NBF后，用100 μl/次/孔的室温1×&#160;PBS洗涤细胞两次。 
		注意：避免使用低温NBF，因其可能导致基质液化。</li>
		<li>移除PBS，加入1% BSA，在室温孵育1小时，或4 °C过夜，以阻断抗体的非特异性结合。</li>
		<li>将一抗用1% BSA按所需稀释比例配制。不同抗体的稀释比例可能不同，请参考生产商说明或通过滴定确定最佳抗体浓度。每孔加入100 μl一抗溶液，按生产商推荐条件孵育。 
		关键步骤：所有涉及荧光素或荧光染料标记抗体的孵育步骤均需避光进行。</li>
		<li>移除一抗溶液，用1×&#160;PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>进行间接免疫荧光染色时，加入与荧光探针偶联的二抗，室温孵育1小时。二抗用1% BSA稀释，浓度按生产商建议使用。</li>
		<li>移除二抗溶液，用1×&#160;PBS洗涤3次，每次5分钟。 
		问题排查：为避免成像时背景过高，应对荧光标记的二抗进行滴定，使用能产生足够信号的最低浓度。若背景仍较高，可增加洗涤次数或延长洗涤时间，或改用直接标记的一抗，并跳过步骤4.2.6。</li>
		<li>为染细胞核，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色液，按生产商推荐稀释比例配制，室温孵育7–10分钟&#160;。</li>
		<li>移除核染色液，用1×&#160;PBS洗涤2次，每次5分钟。</li>
		<li>移除最后一次洗涤的PBS，在样品上加一滴封片剂（常规固化型），以保持荧光信号。使用荧光显微镜或共聚焦显微镜，根据适当的激发/发射波长设置进行成像。 
		注意：染色后应在2天内完成成像，以避免基质降解、rBM完整性丧失及荧光信号减弱。若不能立即成像，染色样品应于4 °C避光保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从重组基底膜中分离细胞
<ol>
	<li>轻柔地移除培养基，避免扰动基质层。切勿吸取。</li>
	<li>用无菌的 1x 溶液洗涤细胞 2 次&#160;PBS。不要抽吸。</li>
	<li>向每个孔中加入0.5 ml预冷的CRS，通过剧烈吹打将细胞连同基质层完全移除。收集细胞、基质和CRS至1.5 ml微量离心管中，置于冰上。</li>
	<li>向同一孔中再加入 0.5 ml CRS，收集所有残留材料，转移至同一微量离心管中。</li>
	<li>将细胞、基质和CRS的混合物涡旋混匀，置于冰上孵育1小时。每15分钟涡旋一次细胞，以促进细胞从基质中释放。</li>
	<li>1小时后检查混合物，不应有可见的基质凝块存在。 
	问题排查： 若1小时后仍可见基质团块，将细胞/基质/CRS混合物转移至更大的离心管中，加入额外的2-5 ml CRS，再孵育30-60分钟。</li>
	<li>在4 °C下，以1,000 rpm离心细胞悬液于CRS中5–10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml预冷的1x缓冲液中&#160;PBS</li>
	<li>以1,000 rpm离心5–10分钟，弃上清液。再用PBS洗涤一次。</li>
	<li>第二次 PBS 洗涤可完成细胞从基质中的回收，所得的单细胞可用于任何后续实验，如 DNA/RNA/蛋白质提取、流式细胞术 体内 移植 等等.</li>
</ol>

<ol><li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li>
<li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li>
<li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li>
<li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li>
<li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+propagated+in+serum-free%2C+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li>
<li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li>
<li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEACAM1-4S%2C+a+cell-cell+adhesion+molecule%2C+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li>
<li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment-mediated+drug+resistance%3A+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li>
<li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li>
<li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li>
<li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li>
<li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li>
<li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li>
</ol>

作者声明&#160;不存在利益冲突。

rBM 模型提供了一个综合系统，可维持骨髓的细胞组成 离体 长达30天。在rBM中培养的骨髓细胞会根据其功能自发分层，紧密模拟体内骨髓的结构特征 体内此外，这是首个能够扩增多发性骨髓瘤克隆的系统8确保骨髓细胞稳健生长及培养整体成功最关键的步骤是：1）获得健康的骨髓细胞群体， &#62;70% 的存活率且基本不含红细胞，2）确保基质成分充分混匀，并使细胞在基质中均匀分布，3）在向体系中添加生长培养基时需小心操作，避免破坏基质。为确保恶性细胞的稳健增殖，生长培养基中应补充与所培养细胞患者诊断相匹配的人源血浆。观察到rBM体系的一个局限性是，在缺乏骨髓基质组分的情况下，无法支持纯化的CD34+造血干细胞、CD20+ B细胞以及CD138+浆细胞的生长。
rBM 系统具有高度的多功能性，可根据特定研究的目标进行多种修改。可向该系统中添加血管内皮组分以模拟骨髓的血管化，还可添加额外的细胞外基质成分，使基质组成尽可能接近天然状态 体内 可根据疾病状态调整基质膜（BM）和基质成分的浓度，以反映不同基质组分浓度可能发生改变...

组织培养技术的发展旨在通过可控环境研究细胞行为，以减少在完整生物体中比较各种过程时的系统性差异。该方法最早建立于20世纪初1,2，指将组织外植体在玻璃培养皿中进行离体（ex vivo）培养的技术。20世纪中期，该系统被改进为培养分散的单个细胞而非完整的组织碎片，因此“组织培养”与“细胞培养”这两个术语逐渐成为同义词3。在传统的细胞培养系统中，细胞生长于组织培养级塑料表面，并覆盖含有多种生长因子的培养基。根据细胞的贴壁能力，形成了两种类型的培养方式：贴壁细胞培养，即细胞附着并铺展在组织培养级塑料表面；以及非贴壁培养，即细胞在悬浮状态下增殖。自细胞培养技术发展初期以来，已建立了多种永生化细胞系，例如HeLa4，这是第一个人类癌细胞系。这些细胞系能够在体外持续无限增殖，且大多数无需特殊处理即可维持其活性。
最初的细胞培养方法采用还原论策略，旨在通过仅包含维持细胞存活和增殖所必需的最基本组分，尽可能简化系统。然而，这种简化的细胞培养方法无法支持大多数具有有限寿命的原代人类细胞在体外（ex vivo）的生长。因此，目前正设计新的培养系统，以尽可能接近地模拟组织微环境，从而使细胞外植体能够在生理条件下生长。与传统的/还原论的细胞培养方法相比，三维（3-D）培养系统现已成为一种优选方法，可在支持性微环境背景下高效培养多种人类细胞系和原代细胞，进而研究健康与疾病相关的机制。这类3-D系统通常通过使用重建基质和/或添加生长因子的培养基来建立，以重现目标细胞类型的组织微环境。首个此类三维（3-D）培养模型被开发用于研究乳腺腺体的发育。为了向细胞提供天然条件，乳腺上皮细胞被包埋于Matrigel、富含胶原蛋白IV和层粘连蛋白的细胞外基质（ECM）中，并覆盖含有生长因子的培养基。在此条件下，乳腺上皮细胞形成类似乳腺腺泡的细胞簇，且在乳源性激素刺激下，这些腺泡结构可向其中空腔内分泌酪蛋白及其他乳蛋白。即使在添加催乳素的标准培养条件下，也未观察到酪蛋白分泌5，这进一步强调了微环境在维持细胞形态和表型特征中的重要作用。当细胞脱离其生理微环境后正常细胞功能丧失的另一个例证是：缺乏支持性微环境时，角质形成细胞无法形成分层的表皮6。目前已建立多种其他3-D模型，以实现原代细胞在体外（ex vivo）的有效扩增7,8。
微环境在细胞行为中的关键作用在一项研究中得到了优雅的证明，该研究中乳腺上皮细胞形成了 &#34;内向外&#34; 在胶原蛋白I基质中培养时，腺泡结构的形态发生异常，与在Matrigel中形成的正确极化腺泡相比出现形态缺陷；当在胶原蛋白I培养体系中加入产生层粘连蛋白的肌上皮细胞后，这种异常形态得以恢复9此外，准确的基因型表达需要正确的微环境。在培养皿中生长时，转染了细胞间黏附分子CEACAM1的MCF7乳腺癌细胞与未转染的CEACAM阴性细胞表现完全相同。然而，当在接触细胞外基质（ECM）的Matrigel中培养时，野生型MCF7细胞形成类似肿瘤的结构，而转染了CEACAM1的MCF7细胞则恢复为正常表型，形成具有中空管腔的腺泡结构，这与非恶性乳腺上皮细胞的行为一致。10同样，在标准培养条件下，阻断乳腺癌细胞中的β1-整合素并不会改变其行为，但在3-D培养中进行相同的实验则表明，阻断β1-整合素可使恶性细胞逆转为正常表型11因此，组织微环境不仅对于维持细胞活力至关重要，而且对于保持细胞正常功能也必不可少。
除了提供可在生理条件下研究细胞行为的体系外，三维培养还可作为新型治疗药物临床前测试的稳定且可靠的介质8,12,13在三维条件下培养细胞，可实现对研究性化合物在环境介导的耐药性条件下的筛选14，可在其中评估细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）黏附的贡献。此外，通过整合多种组织的多个细胞区室，可确定新化合物的脱靶毒性。此类筛选比相应的研究更快速且更具成本效益 体内8.
在此，我们介绍一种重建骨髓（rBM）的三维模型构建方法，该模型可支持正常与恶性骨髓（BM）细胞的增殖。 离体 在高度模拟人类骨髓微环境的系统中。以往在二维培养、含骨髓基质不同组分的液体或贴壁共培养，以及三维半固体琼脂培养体系中培养原代人类骨髓细胞的尝试均收效有限，因其无法为细胞提供组织微环境所需的组分15-18在这些系统中，原代骨髓细胞存活率低，且无法增殖 离体另一种系统是将人骨髓祖细胞与骨髓基质细胞在类球体中共培养的三维系统，在该系统中，造血干细胞的活力和增殖至少维持了96小时19然而，尽管该系统对理解造血祖细胞生物学具有重要价值，但由于缺乏细胞外基质（ECM）成分，无法真实再现骨髓（BM）的微环境，因而限制了其应用价值。本文所述的重组基底膜（rBM）模型则提供了一个综合性系统，可同时重建人骨髓的细胞与细胞外组分 体外我们表明，rBM 培养体系能够支持 ex 正常人骨髓细胞以及从患有各种血液系统疾病患者中分离的细胞的体内生长。

<table><tbody><tr><td>CellTrace CFSE 增殖检测试剂盒 - 用于流式细胞术</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白</td><td>Millipore</td><td>NG1884448</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I 型</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>使用本方案时，Millipore 来源的胶原 I 型无法正常聚合</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 荧光封片介质（常规套装）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/萘酚 AS-MX 片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>用于 TRAP 染色</td></tr><tr><td>SigmaFast BCIP/NBT 片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td>用于碱性磷酸酶染色</td></tr><tr><td>Zeiss 共聚焦 LSM 510 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510 软件</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>共聚焦图像分析软件</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M 倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Axiovert 200M 图像分析软件</td></tr><tr><td>FACSort 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro 软件&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞术数据分析软件</td></tr></tbody></table>

一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

组织培养是研究细胞功能诸多方面的宝贵工具，从正常发育到疾病机制均可涵盖。传统的细胞培养方法依赖于细胞在组织培养皿的固体基质上贴壁生长，或在液体培养基中悬浮生长。尽管已利用这些方法建立并培养了多种永生化细胞系，但当需要在体外（ex vivo）培养原代细胞时，这些方法常常失败。这种失败被认为源于标准培养系统中缺乏组织微环境所必需的适当细胞外基质成分，而常规系统通常使用组织培养级塑料作为细胞生长的表面。细胞外基质是组织微环境的重要组成部分，其存在对于维持细胞极性、存活和增殖等生理功能至关重要。本文介绍一种三维组织培养方法，即在模拟人类骨组织微环境的细胞外基质中培养原代骨髓细胞（rBM系统）。细胞被包埋于细胞外基质中，并通过添加人血浆的培养基获得营养，从而构建了一个综合性的培养体系，可在维持原代组织细胞组成的同时，支持细胞存活和增殖长达30天。利用rBM系统，我们已成功培养了来自正常供者以及淀粉样变性患者和多种血液系统恶性肿瘤患者的原代骨髓细胞。rBM系统支持在基质内直接、实时观察细胞行为，并可用于评估新型治疗药物的临床前疗效。此外，细胞可从rBM系统中分离出来，用于后续的体内（in vivo）移植、细胞分选、流式细胞术以及核酸和蛋白质分析。综上所述，rBM方法为在生理条件下培养原代骨髓细胞提供了一个可靠的系统。

由于原代骨髓细胞在标准组织培养条件下无法增殖，因此建立了rBM系统以高度模拟骨髓微环境，提供一种用于培养和扩增骨髓细胞的体系 离体骨髓细胞外基质的主要成分，包括纤连蛋白、I型胶原、IV型胶原和层粘连蛋白21，被加入到rBM基质中，为该三维培养体系提供结构支架。通过在组织培养皿表面包被I型胶原和纤连蛋白，重建了富含这些成分的骨内膜——即骨组织与骨髓（BM）之间的界面。骨髓内多个细胞区室间的相互作用共同维持组织的整体稳态。为确保不遗漏任何细胞组分，本研究采用人骨髓穿刺活检标本中的非分选单个核细胞建立rBM培养体系。为保证体系中含有循环环境中存在的激素、生长因子和细胞因子，培养基中添加了与所培养标本对应的新人血浆。即 将正常供者的血浆加入非恶性骨髓细胞的重组骨髓（rBM）培养体系中，而将患者血浆加入恶性细胞的培养体系中。 （图1）.
在获得普渡大学和阿尔伯塔大学机构研究委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》取得书面知情同意后，采集了健康供体及各类血液系统恶性肿瘤患者的骨髓和血液样本 （...

在标准培养方法中，细胞被从其生理环境中取出，并在培养皿的塑料表面进行生长。为了研究原代人骨髓细胞的行为，我们建立了一种三维培养系统，使细胞在能够模拟组织天然微环境的条件下生长。

组织培养一直是研究细胞功能诸多方面的宝贵工具，从正常发育到疾病均有所涉及。传统的细胞培养方法……

本实验的总体目标是建立一种能够紧密模拟人类骨髓细胞及细胞内微环境的培养体系。首先，用工业基质包被组织培养孔的表面，然后将骨髓单个核细胞或其他目标细胞与骨髓基质混合。随后，去除工业基质，将细胞基质混合物加入孔中。待基质凝固后，覆盖生长培养基。最终，可直接在基质中观察细胞，或将其分离用于后续分析。与现有的细胞培养方法相比，例如，标准的组织培养方法或共培养模型，其中细胞在塑料表面生长。使用三维培养方法的主要优势在于，细胞在生理性的微环境中生长，因此可让您在组织的天然条件下研究细胞。准备一个48孔板，用于接种细胞。首先向每个孔中加入65微升工业涂层溶液，然后将溶液均匀铺展，覆盖孔的整个表面。该方法也可扩展应用于其他表面。将培养板在室温下孵育至少30分钟。同时，制备细胞悬液，浓度为每微升 PBS 中含 50,000 个细胞。制备足量悬液，以便向每个孔中加入 10 微升；然后在离心管中，将细胞悬液与每孔 100 微升的重建骨基质轻轻混合，避免产生气泡。将混合物置于冰上，以防止在板子完成时基质凝固。孵育期间，通过抽吸完全移除所有液体和包被溶液。然后向每个孔中加入100微升充分混匀的含基质细胞悬液。使用移液器迅速倾斜孔板，使液体均匀覆盖孔的整个表面。在加样过程中需不断混匀细胞悬液，因为细胞在完全加载后容易发生聚集。将孔板在无振荡条件下孵育30至60分钟，直至基质凝固。接下来，将骨髓生长培养基在37摄氏度的水浴中预热。孵育30分钟后，检查基质是否已正确凝固。良好的基质会形成一层柔软的凝胶状层，在倾斜培养板时不会移动。基质准备好后，使用血清移液管将一毫升培养基逐滴轻柔地覆盖在基质上。然后将组装好的重建骨基质培养物放回培养箱中，最多培养30天，期间无需更换培养基。如果需要更换培养基，每次仅更换一半培养基。轻轻移除培养基，避免扰动基质层。倾斜培养板，使用移液器轻柔地吸出培养基。切勿在基质层上方抽吸培养基。染色细胞时，请使用此方法进行溶液更换。从三维培养板孔中移除培养基时，必须从孔的侧壁移除，这一点至关重要。否则，基质将被破坏，细胞可能丢失。保持使用相同的技术。用无菌的1×PBS洗涤细胞两次，然后向每个样本中加入0.5毫升冰冻的细胞回收液。通过剧烈吹打将整个基质层连同细胞一起移除。每个孔中的收集物转移至微量离心管中，并置于冰上。然后向同一孔中再加入0.5毫升复苏溶液，收集所有剩余材料。将所有收集物涡旋混匀，并在冰上孵育1小时。孵育期间，每隔15分钟涡旋混匀试管一次，以促进细胞从基质中释放。孵育1小时后，检查混合物中是否存在可见的基质团块。不应存在任何团块，但如果仍有残留，将混合物转移至更大的离心管中，并额外加入两到五毫升细胞回收溶液。然后将细胞再孵育30至60分钟，期间定期涡旋振荡，并再次检查是否无基质团块存在。当基质不再成团时，在 4°C 条件下以 1000 RPM 离心混合物 5 至 10 分钟。然后移去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升冷的 1× PBS 中。重复离心操作。弃去上清液，加入新鲜的 PBS 重悬，再次洗涤。共洗涤三次。第三次 PBS 洗涤后，用适当的溶液重悬细胞，用于后续实验步骤。骨髓细胞在重建的骨基质中培养 30 天，并在 200 倍放大倍数下定期通过光学显微镜进行成像观察。基质细胞成分最早在第 5 天被检测到，但在第 14 天时已清晰可见。在培养期间，细胞通过基质迁移并聚集成明显的细胞簇。随着时间推移，恶性细胞团块不断扩展，以评估在RBM中生长的间质成分的组成。同时评估了细胞在RBM与工业涂层交界处的形态学特征。细胞经纤维连接蛋白、肌动蛋白和细胞核染色。具有间质样形态的细胞经鉴定为前成骨细胞，表现出高水平的碱性磷酸酶活性。通过茜素红染色确定，这些细胞具有钙化能力；而可见脂滴存在的细胞则根据油红染色阳性结果被鉴定为脂肪细胞。具有偶见多个细胞核的红细胞被认定为前成骨细胞，并且抗酒石酸酸性磷酸酶染色呈阳性。从三维培养物中分离细胞后，可进行多种操作。例如，可研究在微环境中生长的各种细胞的细胞表型。您可以研究基因和蛋白质的表达，甚至可以确定这些细胞在三维条件下分泌哪些类型的分子。

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

三维组织培养模型研究人类原发性骨髓和恶性肿瘤

本文描述了一种利用人脐带血和白血病骨髓细胞进行造血的三维培养系统。该方法基于使用涂覆有细胞外基质蛋白的多孔合成聚氨酯支架。该支架可适应多种细胞的培养。...

ex vivo 模拟正常与异常的人类造血过程

本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。...

人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

本文描述了在人骨组织外植体模型系统中研究乳腺癌细胞迁移、增殖和定植的实验方案。...

研究乳腺癌细胞定植转移微环境的人类股骨组织外植体培养方法

人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。...

建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

本方案描述了一种方法的开发过程 体外...

开发一种人源前临床破骨细胞生成模型：外周血单核细胞与乳腺癌细胞系共培养

利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外...

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内...

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

一个 体外 通过将间充质细胞和内皮细胞接种到预先制备的三维聚乙二醇水凝胶上，建立骨髓血管微环境模型。该微环境中的内皮网络、细胞外基质成分以及碱性磷酸酶活性会因所使用的生长因子不同而发生变化。该平台可用于构建高级癌症模型。 <br...

利用预铸聚乙二醇（PEG）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。...

一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

学习三维培养系统研究人类原发性骨髓细胞行为的方法。该技术模拟骨髓微环境，支持细胞直接观察和下游分析，有助于深入理解造血过程。

一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

探索更多视频