三维组织培养模型研究人类原发性骨髓和恶性肿瘤

该程序的总体目标是建立一个培养系统，该系统紧密概括了人骨髓的细胞和细胞内微环境。首先，组织培养孔的表面涂有工业基质。然后将骨髓单核细胞或其他感兴趣的细胞与骨髓基质混合。

随后，去除工业基质，将细胞基质混合物添加到孔中。一旦基质果冻，它就用生长培养基覆盖。最终，与现有的细胞培养方法相比，细胞可以直接在基质中可视化，也可以分离用于下游分析。

例如，标准组织培养方法或细胞在塑料上生长的共培养模型。使用 3D 培养方法的主要好处是细胞在生理微环境中生长，因此它允许您在组织的天然条件下研究细胞。准备一个 48 孔板，细胞将在其中铺板。

首先向每个溶液中加入 65 微升工业涂料溶液，将溶液均匀涂抹以覆盖孔的整个表面。此方法也适用于其他表面。让板在室温下孵育至少 30 分钟。

同时，制备每微升 PBS 50， 000 个细胞的细胞悬液。准备足够的剂量，向每个孔中加入 10 微升，然后在 einor 管中，将细胞悬液与 100 微升重建骨基质混合。轻轻混合，避免引入气泡。

将混合物放在冰上，这样板完成后基质就不会凝胶。孵育，通过抽吸去除所有液体和 dote 涂层溶液。然后向每个细胞中加入 100 μL 充分混合的细胞悬液和基质。

使用移液管快速倾斜板，以均匀覆盖孔的整个表面。在孔填充之间继续混合悬浮液，因为一旦满载，细胞就会结块。将板孵育 30 至 60 分钟，不要搅拌，直到基质凝固。

接下来，在设置为 37 摄氏度的水浴中预热骨髓生长培养基。孵育 30 分钟后，检查基质是否正确凝固。良好的基质会形成柔软的凝胶状层，当板倾斜时不会移动。

基质准备好后，使用血清移液管将其轻轻滴加一毫升培养基。然后将组装好的重建骨基质培养物放回培养箱中长达 30 天，无需更换培养基。如果需要更换介质，一次只更换一半的介质。

轻轻去除培养基，不要干扰基质层。倾斜板并使用移液管轻轻排空培养基。以后不要在基质上吸出介质。

当对细胞进行染色时。使用此技术进行解决方案更改。要从 3D 培养物的孔中去除培养基，将其从孔的侧面去除非常重要。

否则，基质会受到干扰，细胞可能会丢失坚持相同的技术。用无菌的 one XPBS 洗涤细胞两次。然后向每个溶液中加入半毫升冰冷的细胞回收溶液。

好吧，通过用力上下吹打去除整个基质层和细胞。对于每种，将收集物充分转移到微量离心管中并将其置于冰上。然后在同一孔中再加入半毫升回收溶液并收集所有剩余材料。

涡旋所有收藏品，并在冰上孵育一小时。在一小时内，每 15 分钟涡旋试管，以促进细胞从基质中释放。一小时后，检查混合物中是否有可见的基质块。

不应存在，但如果有，请将混合物转移到更大的试管中，并额外添加 2 至 5 mL 细胞回收溶液。然后将细胞再孵育 30 到 60 分钟。定期涡旋，并再次检查是否有基质团块。

当矩阵不再成团时。在 4 摄氏度下以 1000 RPM 的速度离心混合物 5 到 10 分钟。然后去除上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升冷的 XPBS 中。

重复离心。用新鲜的 PBS 替换上清液并重复洗涤。第三次。

第三次 PBS 洗涤后，在适当的溶液中回收细胞以进行下一个程序。骨髓细胞在重建的骨基质中生长 30 天，并通过 200 倍放大的光学显微镜定期成像。基质成分在第 5 天首次检测到，但在第 14 天时它们已明显。

在培养过程中，细胞通过基质迁移并聚集成不同的簇。恶性细胞团数随着时间的推移而扩增，以评估在 RBM 中生长的基质成分的组成。评估了 RBM 和工业涂层之间过渡时细胞的形态。

对细胞进行纤连蛋白、肌动蛋白和细胞核染色。具有基质形态的可视化细胞被证明是具有高水平碱性磷酸酶活性的前成骨细胞。它们能够矿化钙，如扎林红染色确定的那样，具有可见脂滴的细胞根据油阳性染色被鉴定为脂肪细胞。

偶尔有多个细胞核的红细胞被认为是破骨细胞前，并且抗酒石酸盐酸性磷酸酶呈阳性。从 A 3D 培养物中分离细胞后，您可以做各种事情。例如，您可以研究在微环境中生长的各种细胞的细胞表型。

您可以研究基因和蛋白质表达，甚至可以确定这些细胞在 3D 条件下分泌什么样的分子。