模拟寨卡病毒感染人类发育中大脑 体外 利用干细胞衍生的大脑类器官

本实验的总体目标是利用干细胞来源的脑类器官建立寨卡病毒感染人脑发育过程的模型。该方法有助于回答生物学领域的一些关键问题，例如，哪些细胞能够被感染，以及哪些蛋白质参与了感染途径。该技术的主要优势在于，它能够模拟人类早期感染过程，可用于高通量检测，并可与靶向基因技术（如CRISPR）相结合。

该方法可为寨卡病毒感染机制提供深入见解，也可应用于其他系统，例如药物筛选和病毒假型构建。采用常规干细胞维持方法，将细胞培养至50%至70%融合度。

使用明场显微镜在10至20倍放大倍数下检查培养物，确保克隆形态健康且无明显分化现象。将无异源成分的干细胞维持培养基在37°C水浴中预热，并在室温下解冻2毫升酶解解离试剂以及50微升装的ROCK抑制剂储备液。接下来，准备一个超低吸附U型底96孔板、一个多通道P200移液器和一个25毫升试剂储液槽。

接下来，将45毫升培养基分装至一个50毫升锥形管中。加入45微升ROCK抑制剂，并通过反复吹打充分混匀抑制剂，随后倒置混匀2至4次。对含有干细胞的六孔板中的两个孔进行真空抽吸，迅速向每孔加入1毫升无酶解离试剂，然后将培养板在37°C孵育4分钟。

接下来，用真空抽吸法吸除处理过的孔中的液体，并向每孔加入1毫升酶解解离试剂。在37摄氏度孵育5分钟后，将培养板从孵箱中取出。轻轻敲击培养板，以分散任何聚集的细胞。

接下来，在显微镜下观察细胞。如果仍可见较大的细胞团块，则将培养板在37°C下额外孵育2分钟。重复该步骤，直至肉眼不可见细胞团块为止。

待细胞充分解离后，向每孔中加入1毫升无异源成分的干细胞维持培养基，以中和解离酶的活性。将细胞悬液转移至50毫升锥形管中，并取少量样品用于细胞计数。在离心过程中完成细胞计数，并确定重悬体积，使细胞浓度达到每毫升60,000个细胞。

小心吸除上清液，并用含有ROCK抑制剂的培养基将细胞重悬，调整细胞密度为每毫升60,000个细胞。使用5毫升移液器，轻柔吹打混匀5至10次，以确保细胞悬液均匀。立即将细胞悬液加入试剂储液槽中，并使用多通道P200移液器向超低吸附U型底96孔板的每孔转移150微升细胞悬液。

接下来，将培养板在150 × g条件下离心1分钟，然后将培养板放入37摄氏度的培养箱中。48小时内不要扰动培养板。从第二天开始，在50毫升锥形管中准备17毫升培养基，其中含有17微升的储备rock抑制剂。

将混合物置于水浴锅中，加热至 37 摄氏度。从培养箱中取出类器官培养板，使用多通道 p200 移液器，缓慢从第一排孔的边缘吸取 75 微升培养基，然后迅速将其排回孔内，以悬浮松散的细胞和类器官。

对每一行重复此分散操作。等待15秒，确保类器官已沉降至每个孔的底部，然后使用多通道p200移液器缓慢而小心地从每个孔中吸出75微升培养基，并排入废液储液槽中。接下来，将含有ROCK抑制剂的培养基转移至试剂储液槽中，向每个类器官孔中加入150微升培养基，然后将细胞置于37°C培养箱中孵育。

将17毫升新鲜培养基预热至37摄氏度，此次不添加rock抑制剂。使用多通道P200移液器并调至100微升，重复之前展示的分散操作，静置15秒，以确保类器官沉降至孔板底部。随后，小心吸出每孔中的125微升培养基，并加入150微升预热的培养基。

将培养板放入37摄氏度的培养箱中。根据此处所示配方制备培养基，然后使用500毫升滤器对混合溶液进行无菌过滤。从第4天开始，直到约第24天细胞被感染为止，每隔一天使用神经诱导培养基进行常规换液维护。

过滤后，将17毫升神经诱导培养基加热至37°C，并将剩余培养基储存在4°C。使用设置为100微升的多通道P200移液器，将之前制备的类器官板的所有孔中的液体充分分散。静置15秒，以确保类器官已沉降至孔底。

从每个孔中小心吸出 125 微升培养基，并加入 125 微升新鲜的神经诱导培养基。每隔一天重复一次神经诱导操作，直至类器官准备好进行寨卡病毒感染。将 Earle's 1× 平衡盐溶液、1× PBS 和神经诱导培养基置于 37 摄氏度水浴中预热。

接下来，将已知浓度的寨卡病毒用1×Earle's溶液稀释至目标感染复数（通常为0.1至10之间）。使用P200移液器小心吸除每个类器官孔中的全部培养基。随后，用200微升预热的1×PBS快速洗涤类器官。

从每个孔中移除培养基时，关键是要避免触碰类器官或将类器官吸入移液器中。否则可能对类器官造成不可逆的损伤。一旦发生这种情况，最好丢弃该类器官。

接下来，使用单通道 p200 移液器小心地从每个类器官孔中移除所有残留液体。然后，迅速向每孔加入 50 µL 的 1× Earle's 溶液（模拟感染）或寨卡病毒溶液。确保每个类器官完全浸没后，将培养板放回 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。

病毒暴露完成后，用 200 微升 PBS 清洗类器官的每个孔。静置 15 秒使类器官沉降，然后使用单通道 p200 移液器吸除 PBS。最后，向每个孔中加入 200 微升新鲜神经诱导培养基，并将培养板放回培养箱中。

使用DAPI、磷酸化波形蛋白、TBR2和MAP2进行染色，可联合显示类器官内形成的皮层结构。这些结构包括每个玫瑰花结样结构中的室带、室下带、中间带以及皮层板。将类器官培养至第108天，可观察其发育的后期阶段。

尽管此类类器官中的皮层分层并不十分显著，但其向胶质细胞生成的自然转变过程仍与体内情况相似。在寨卡病毒感染后三天，类器官大小的差异开始显现。这种差异的程度取决于施加于类器官的病毒感染复数。

类器官大小的差异将在接下来的一周内逐渐增大，直至被感染的类器官开始解体。感染三天后，与对照组孔相比，感染孔中的细胞碎片也会增多。在进行该操作时，必须遵循安全的实验室操作规范，因为实验中使用了具有活性的感染性材料。

完成此操作后，可进一步采用免疫组织化学或RNAC等方法，以探究寨卡病毒感染神经发育过程中涉及的生物学问题。