Monospecific 和混合 DFS70 模式在 HEp-2 ELITE/DFS70 击倒底物筛选中的同时鉴别

该程序的总体目标是展示一种改进的间接免疫荧光测定，该测定使用新型 HEp-2、致密细斑点 70 敲除底物来筛选抗核自身抗体，并同时确认单特异性和混合致密细斑点 70 模式。新型 HEp-2 底物使用标准的间接免疫荧光程序和解释标准来筛选临床相关的抗核抗体，也称为 ANA。主要优点是能够在筛选步骤中区分密集的细斑点 70 模式与疾病相关、均匀的斑点或具有挑战性的混合模式。

演示该程序的是我们质量控制实验室的技术人员 Sofia Badanin。对于底物载玻片，使用载玻片，每张载玻片上有 12 个孔，包含常规 HEp-2 细胞，或常规和致密细斑点 70 个敲除 HEp-2 细胞的混合物。让装有底物载玻片的袋子平衡至室温以获得最佳性能，并防止在添加样品之前水分在载玻片表面凝结。

这应该需要 10 到 15 分钟。平衡至室温后，用手指小心地去除底物载玻片，避免载玻片与造口袋侧面接触。标记载玻片并将它们放入孵育室中，并在孵育室中衬有湿纸巾，以防止在样品和偶联物孵育过程中载玻片干燥。

大约 50 μL 的阴性和阳性对照以及稀释的患者血清分配到单个玻片孔中，然后将玻片放入孵育室中。ANA 测试是筛查自身免疫性疾病的第一步。避免载玻片上患者样本的交叉污染，以最大限度地减少假阳性或假阴性结果，这一点至关重要。

为防止孔交叉污染，请避免孔过满。盖上孵育室的盖子，在室温下孵育玻片 30 分钟。如果患者的血清中存在任何 ANA，它会在此期间与每个遗嘱中存在的细胞结合。

孵育期结束后，从孵育室中取出玻片。握住载玻片的标签端，用大约 10 mL 的重构磷酸盐缓冲盐水洗涤缓冲液轻轻冲洗 10 到 15 秒。立即将玻片转移到装有 PBS 洗涤缓冲液的 Coplin 染色缸中，浸泡 10 分钟。

对所有剩余的幻灯片重复此过程。一次只能从 Coplin 罐中取出一张载玻片。要从玻片上去除多余的 PBS 洗涤缓冲液，请在纸巾上轻轻敲击或吸干玻片。

在每个孔上，轻轻滴入一滴异硫氰酸荧光素，标记的抗人 IgG 荧光偶联物。然后，将玻片在密闭的染色孵育室中孵育 30 分钟。孵育期结束后，从孵育室中取出玻片。

握住载玻片的标签末端，像以前一样用大约 10 毫升的 PBS 洗涤缓冲液轻轻冲洗。立即将玻片转移到装有 PBS 洗涤缓冲液的 Coplin 染色缸中，浸泡 10 分钟。将套件中提供的盖玻片放在干纸巾上。

在盖玻片的底部边缘，将 3 到 4 滴封固剂滴成一条线。接下来，从含有洗涤缓冲液的 Coplin 染色缸中一次取出一张载玻片。要去除多余的洗涤缓冲液，请轻轻敲击或吸干纸巾上的玻片。

避免在玻片上留下过量的洗涤缓冲液、对盖玻片施加过大的压力或引入气泡。所有这些都会影响细胞形态、产生的荧光模式和反应强度。将载玻片的下边缘放在盖玻片的边缘，将载玻片轻轻降低到盖玻片上。

这允许盖玻片上的封固剂流向玻片的顶部边缘，并最大限度地减少气泡的形成，气泡可能会干扰每个孔的读数。使用位于暗室中的异硫氰酸荧光素滤光片组，用荧光显微镜观察载玻片。在显微镜下以 200 倍或更大的放大倍率检查样品是否有特定的亮绿色荧光，以对阳性和模式做出最终解释。

观察阳性和阴性对照。阳性对照将在细胞核中显示亮绿色荧光。阴性对照在荧光显微镜下不会显示特异性绿色荧光。

记录每个孔的阳性或阴性结果，并包括阳性病例的 ANA 模式。HEp-2 致密的细斑点 70 敲除底物保留了所有主要的细胞核和细胞质模式。密集的细小斑点模式的特征是在整个间期细胞核和有丝分裂期的染色质中存在均匀分布的斑点染色。

表达致密细斑点 70 抗原的常规 HEp-2 细胞和不含抗原的工程化 HEp-2 细胞的存在有助于准确区分致密细斑点 70 模式，同时保留常规 HEp-2 底物的所有优点。将主要疾病相关 ANA 模式阳性的血清与等比例的致密细斑点 70 型阳性血清混合，并在常规 HEp-2 和 HEp-2 致密细斑点 70 敲除底物上进行测试。在这里，红色箭头表示处于有丝分裂期的细胞。

黄色箭头表示常规 HEp-2 细胞核，蓝色箭头表示工程化的 HEp-2 细胞核。对于所有描述的反应组合，致密的细斑点 70 敲除底物在同一视野中显示出未修饰细胞和工程细胞之间的明显强度差异。这有助于区分单一特异性和混合的致密细斑点 70 反应。

针对细胞核和细胞质抗原的自身抗体在系统性自身免疫性疾病中非常普遍。据报道，由针对 DFS70 的自身抗体（也称为 PSIP1 蛋白）产生的密集细小斑点模式在健康人群中非常普遍。此外，这些 DFS70 自身抗体既可以单独存在，也可以与其他疾病相关的 ANA 一起存在。

这使得临床实验室准确区分这种模式与其他疾病相关模式至关重要。例如，在与狼疮相关的混合均匀斑点模式中，可能会被误解为 DFS70 模式，因此需要多次确认测定。使用 HEp-2 底物的间接免疫荧光法被认为是 ANA 的金标准筛选方法。

然而，准确性在很大程度上取决于技术人员的技能、各个步骤的仔细执行以及对结果模式的准确解释。相反，对常规 HEp-2 和 DFS70 敲除底物的比较评估表明，这种新底物在筛选 ANA 时以高可信度区分 DFS70 模式的效用。使用这种改进的 HEp-2 底物，对单阳性和混合 DFS70 模式的进一步解释相对简化。

新底物使用标准的间接免疫荧光方案和所有临床相关 ANA 模式的既定解释标准。