Name: Monospecific 和混合 DFS70 模式在 HEp-2 ELITE/DFS70 击倒底物筛选中的同时鉴别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解使用新型HEp-2 DFS70敲除底物进行间接免疫荧光检测的方法，用于筛查抗核抗体并同时鉴别单特异性和混合性DFS70模式。该技术可提高自身免疫疾病诊断的准确性。

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我们感谢 Andrew Zenger 进行了间接免疫荧光实验并收集了图像。

该方案遵循 Trinity Biotech 机构人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 样品和基底的制备
<ol>
	<li>将含有基质载玻片的袋装试剂（每张玻璃载玻片上含12个孔，孔内含有HEp2或HEp-2+HEp2 KO细胞混合物）置于室温下平衡，以获得最佳性能，并防止在加样前载玻片表面产生冷凝水。此过程大约需要10至15分钟。</li>
	<li>待其恢复至室温后，用手指小心取出基质载玻片，避免手指接触袋子的边缘。</li>
	<li>标记载玻片，并将其放入已用湿水浸润的纸巾铺底的湿盒（室温）中，以防止在样本和结合物孵育过程中载玻片干燥。 
	注意：干燥的孔可能导致非特异性染色；孵育盒内放置湿润的纸巾可提供湿度，防止孔内干燥。</li>
</ol>
2. 添加对照和样本
<ol>
	<li>将约 50 µL 的阴性/阳性对照、本研究中所述的 DFS70-ANA 阳性血清组合或患者血清样本分别加入到玻片上的各个反应孔中。</li>
	<li>将对照和样本分别加入玻片的每个反应孔中。</li>
	<li>为防止孔间交叉污染，请避免过度填充反应孔。在不溢出的前提下，确保反应孔表面被完全覆盖，并避免产生气泡。 
	注意：推荐体积为 50 µL，同步骤 2.1 所述。</li>
	<li>盖上孵育盒盖子，在室温下孵育 30 分钟。如果患者血清中存在任何 ANA，则在此孵育期间会与各孔中的细胞结合。</li>
	<li>孵育结束后，从孵育盒中取出玻片。握住玻片的标签端，用移液器或盛有 PBS 洗涤缓冲液的烧杯，轻轻冲洗约 10 mL 试剂盒提供的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤缓冲液，冲洗 10 - 15 秒。立即将玻片转移至装有 PBS 洗涤缓冲液的考普林罐中，浸泡洗涤 10 分钟。对所有剩余玻片重复此操作。 
	注意：当将多个玻片放入一个考普林罐时，应确保玻片的细胞面不与其他玻片接触，以免损伤附着在玻片上的细胞。</li>
</ol>
3. 添加荧光偶联物
<ol>
	<li>每次从 Coplin 染色缸中取出一张载玻片。为去除载玻片上多余的 PBS 洗涤缓冲液，将其轻轻在纸巾上轻拍或吸干。每套试剂盒均提供 FITC 标记的抗人 IgG 荧光结合物。向每个孔中轻柔加入 1 滴（约 50 µL）提供的结合物。</li>
	<li>将切片置于密闭染色孵育 chamber 中孵育 30 分钟。 
	注意：推荐使用针对Fc段的特异性IgG结合物。如果患者血清中存在任何抗核抗体（ANA），在此孵育期间，该结合物将与各孔中的细胞结合，导致孔中细胞出现特异性荧光。该结合物对光敏感，使用密闭孵育盒有助于防止光线干扰各孔中细胞的结合反应。</li>
	<li>孵育期结束后，从孵育 chamber 中取出玻片。手持玻片标签端，用移液器或盛有 PBS 洗涤缓冲液的烧杯，加入约 10 mL 试剂盒提供的 PBS 洗涤缓冲液，轻轻冲洗。立即将玻片转移至装有 PBS 洗涤缓冲液的 Coplin 染色缸中，浸泡洗涤 10 分钟。对所有剩余玻片重复上述步骤。 
	注意：将多个载玻片放入考普林瓶时，应确保载玻片的细胞面不与其他载玻片接触，以免损伤黏附在玻璃载玻片上的细胞。</li>
	<li>将试剂盒中提供的盖玻片放置在干燥的纸巾上。试剂盒中附有封片介质。在盖玻片的底边处，滴加3至4滴封片介质&#160;线。</li>
	<li>从装有洗涤缓冲液的 Coplin 染色缸中一次取出一张载玻片。为去除多余的洗涤缓冲液，将载玻片轻轻在纸巾上轻敲或轻压吸干。</li>
	<li>将载玻片轻轻放于盖玻片上，使载玻片的下边缘接触盖玻片的边缘。这样可使位于盖玻片下边缘的封片介质流向载玻片的上边缘，并最大限度减少气泡的形成，避免干扰载玻片各孔的观察。 
	注意：将盖玻片贴附到载玻片时应使用最小压力。任何过度的压力都可能导致盖玻片发生侧向移动，从而损坏细胞的单层制备结构并引起变形。</li>
	<li>将载玻片置于2 - 8 °C避光保存。载玻片封片后应立即观察，或在48小时内完成检查。 
	注意：长期储存可能导致图案和荧光信号的退化。</li>
</ol>
4. 阳性与阴性结果的判定
<ol>
	<li>在暗室中使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察载玻片。</li>
	<li>在荧光显微镜下以200倍或更高放大倍数检查特异性亮绿色荧光，以最终判断阳性结果及荧光模式。同时观察阳性对照和阴性对照。 
	注意：阳性对照在细胞核内显示亮绿色荧光（图2A，均质型）。阴性对照在荧光显微镜下无特异性绿色荧光。</li>
	<li>记录每个孔的阳性/阴性结果，并对阳性样本注明抗核抗体（ANA）的荧光模式。</li>
</ol>

<ol><li>American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011).</li>
<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANA+screening%3A+an+old+test+with+new+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li>
<li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li>
<li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412(2015).</li>
<li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE%2FDFS70+knockout+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).</li>
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<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+DFS+70+kd%2Ftranscription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li>
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<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li>
<li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+Against+DFS70%2FLEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+%28SARD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li>
<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70%2FLEDGFp75+in+health+and+disease%3A+integrating+basic+science+with+clinical+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li>
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<li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li>
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</ol>

作者 Kishore Malyavantham 和 Lakshmanan Suresh 是美国 Trinity Biotech 公司的员工。

针对细胞核和细胞质抗原的自身抗体在系统性自身免疫性疾病中具有很高的检出率。尽管目前尚无任何单一检测方法能够同时提供最佳的敏感性和特异性，但采用HEp-2细胞进行的间接免疫荧光（IIF）检测被广泛认为是一种高度敏感且经济有效的系统性自身免疫性疾病筛查方法2,3,4。尽管IIF检测流程已应用超过50年，其检测结果的准确性仍高度依赖于技术人员的操作技能、对各实验步骤的规范执行，以及使用维护良好的荧光显微镜对结果进行准确判读。系统性自身免疫性疾病的诊断不应仅依据HEp-2间接免疫荧光等单一血清学检测的结果。
使用高质量水（蒸馏水/去离子水）进行试剂重悬，以及使用标准化试剂盒组分（含HEp-2细胞单层的载玻片、样本稀释液、阳性和阴性对照、预稀释优化的FITC标记结合物以及封片介质），对检测结果具有积极影响。若省略在某些孔中加入对照或样本，可能导致假阴性结果的误判。在加入样本或对照后的任何步骤中，若载玻片发生干燥，可能引起人为假阳性反应和/或出现不正确的荧光模式。若冲洗缓冲液残留过多，或在加入封片介质前载玻片孔内发生干燥，也可能产生人为假象。加入封片介质的量不足，或在加盖盖玻片前在载玻片表面产生气泡，可能导致显微镜下观察时反应信号模糊或失焦。封片后的载玻片必须储存于2–8 °C，并在推荐的时间窗口内完成分析，以尽量减少假阴性或人为假象结果的出现。
使用维护良好的落射荧光显微镜至关重要，该显微镜应配备合适的LED/汞灯/氙灯光源，以及洁净且无损伤的光学元件，包括激发滤光片和发射滤光片，以获得准确的间接免疫荧光（IIF）结果。终端用户必须接受培训，以准确区分阳性与阴性反应的强度，并正确解读荧光模式。HEp-2间接免疫荧光检测易受操作流程、显微镜配置以及终端用户培训或技术水平缺乏标准化的影响。国际自身抗体检测模式协作组（ICAP）提供了由不同厂商获得的典型荧光模式的共识命名法、代表性图像及示例（&#60;www.ANApatterns.org&#62;），供教育用途参考4。ICAP还提供了一套HEp-2细胞荧光模式分类树，涵盖多种核内、胞质及有丝分裂期模式，是学习识别各种看似相似但存在细微差异的荧光模式的宝贵资源4。其中一种较难判读的典型模式是DFS70，该模式亦无明确的自身免疫性疾病关联性；如前文所述，此模式在健康人群中检出率较高5。
根据研究的不同，抗DFS70自身抗体在健康人群、ANA筛查人群以及无系统性自身免疫病证据的ANA阳性个体中的流行率存在差异9,16,20,30,31。已有报道显示，DFS70自身抗体可单独出现，也可与其他疾病相关的ANA模式共存。孤立性或单特异性DFS70模式在健康对照人群中报道的比例为2%至22%，而在自身免疫性风湿病患者中则低于1%32。基于这些趋势，国际自身抗体检测标准化委员会（ICAP）提出将DFS70单一阳性模式作为排除自身免疫性风湿病的一项标准3,31,32。ICAP委员会旨在推动自身抗体检测命名法的统一以及HEp-2细胞间接免疫荧光（IIF）结果判读的标准化，该委员会建议在报告ANA筛查结果时应同时报告DFS70抗体的阳性情况4。
在依据DFS70单一阳性结果排除系统性自身免疫性疾病之前，必须审慎评估当前筛查与确认方法（尤其是针对DFS70的检测方法）的现状。不同研究中，HEp-2细胞间接免疫荧光法（HEp-2 IIF）检测出的DFS70阳性结果与固相确认试验（包括ELISA、CLIA以及线性免疫印迹/点印迹法）之间的符合程度存在显著差异13,22,25,33。此前已有文献讨论过导致这种不一致性的IIF判读标准及确认试验参数5,13,34。最近提出的一种用于抗DFS70抗体确认的免疫吸附方法，在一定程度上弥补了现有固相检测方法（针对DFS70）的不足，但该方法要求实验室对疑似样本在IIF流程中额外增加一步操作，从而增加了检测成本和报告结果的周转时间13。而当使用HEp-2 ELITE/DFS70 KO细胞进行常规抗核抗体（ANA）筛查时，则无需这一额外步骤。这不仅降低了整体成本，而且由于DFS70荧光模式可在初始筛查阶段即被识别，因此对结果报告的周转时间无任何影响27。使用传统HEp-2 IIF方法的另一个缺点是，在筛查阶段无法区分DFS70模式与其他ANA模式共存的情况。然而，这一缺陷可通过使用HEp-2 ELITE/DFS70 KO细胞得以克服27。
使用抗核抗体（ANA）阳性对照及其与单一阳性DFS70对照的不同组合，对传统的HEp-2细胞和新型基因工程改造的HEp-2细胞（HEp-2 ELITE/DFS70 KO）进行比较评估，证明了这种新型底物在同时筛查ANA并确认DFS70荧光模式方面的实用性（图1）。该新型底物的间接免疫荧光（IIF）操作流程与传统的HEp-2 IIF方法完全相同。所有与疾病相关的ANA荧光模式的判读方案也保持一致，仅DFS70模式的判读有所不同（Table 1）。采用新方法对单一阳性及混合型DFS70模式的判读相对更为简便，且无需额外开展其他检测（图1B）。在临床实验室中应用此新方法，可简化DFS70模式判读所带来的挑战，并通过揭示此前被DFS70信号掩盖的疾病相关ANA模式（混合模式），进一步提高ANA筛查的整体准确性。

抗核抗体（ANAs）是自身免疫介导的系统性结缔组织疾病的标志性特征1。目前有多种方法用于ANAs的筛查和确认。使用HEp-2细胞作为底物的间接免疫荧光（IIF）技术仍是应用最广泛且常被推荐的ANAs筛查方法1,2。尽管固相诊断检测技术已取得进展，例如酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶免疫分析（EIA）、化学发光免疫分析（CLIA）以及基于微球的多重检测技术，但由于其诊断价值高且成本效益好，基于HEp-2细胞的IIF仍是最普遍的筛查方法1,2,3。上述检测技术依赖于有限的一组纯化的天然或重组自身抗原，而载玻片孔中的HEp-2细胞单层制备物则在细胞核和细胞质中以天然构象呈现大量多样的自身抗原，这些抗原可与患者血清或阳性对照中的自身抗体发生反应，产生多种与不同自身免疫疾病相关的荧光模式。这些荧光模式根据抗原在细胞内的定位被分为核型、胞质型和有丝分裂期模式。每种模式及其相关的抗原（或抗原谱）和疾病状态均已得到充分表征4。在IIF方法中，将患者血清和对照血清加入到载玻片孔中，其中含有经适当固定的HEp-2细胞单层培养物，以保持多种自身抗原的天然构象。在孵育过程中，患者血清或阳性对照中的自身抗体可与底物（即载玻片孔中的HEp-2细胞）上呈现的自身抗原结合。孵育后，洗去未结合的抗体，然后使用荧光素/异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人IgG试剂检测已结合的IgG类抗体。再洗去未结合的标记物，最后用封片介质将盖玻片封固在载玻片上，以保存反应结果并便于在荧光显微镜下观察。在配备合适激发-发射滤光片组合的荧光显微镜下观察反应结果，滤光片配置需与所用报告分子相匹配（对于FITC报告分子，诊断用显微镜通常采用激发波长范围为467–498 nm、发射波长范围为513&#160;–556 nm的滤光片）。ANA的存在表现为细胞内特定结构出现明亮的绿色荧光。与自动化检测平台不同，IIF方法依赖于对血清进行系列稀释以及通过肉眼判读染色模式来确定阳性结果，这一过程较为繁琐，且需要操作者具备丰富的经验5,6。尽管存在这些局限性，由于国际抗核抗体图谱共识（ICAP）委员会在荧光模式解读和命名方面的标准化努力，以及IIF载玻片处理和结果判读自动化解决方案的日益普及，基于HEp-2细胞的IIF仍然是目前最广泛使用且被推荐的ANAs筛查方法3。
在HEp-2间接免疫荧光（IIF）方法检测出的众多荧光模式中，针对细胞核抗原的自身抗体 psip1 基因产物（也称为 LEDGF/p75/DFS70）近年来因多种原因受到广泛关注4,5,6,7,8,9,10. DFS70 自身抗体在健康对照人群中以高滴度存在，迄今为止的研究均未能证实DFS70自身抗体的存在具有明确的临床关联性7,8,9,10,11,12,13不同研究中报道的DFS70自身抗体在各种疾病状态和健康人群中的阳性率存在显著差异6,8,9,10,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28单特异性DFS70模式可与均质型或斑点型模式明确区分，但当出现均质-斑点混合型模式，或抗DFS70抗体与其他抗核抗体（ANA）共存时，其判读即使对于经验丰富的阅片者也具有挑战性。目前的间接免疫荧光（IIF）筛查方法及针对DFS70的特异性固相检测均无法有效区分单特异性DFS70反应与混合型模式图1A，算法中的黄色阴影区域）。将DFS70模式误判为均质型、斑点型或混合型模式，或 反之亦然，可能对患者诊疗产生重要影响。目前常用的检测流程如下：当怀疑存在密集细颗粒型（AC-2）荧光模式时，临床实验室采用多种针对疾病相关抗核抗体（ANAs）的固相确证试验和/或针对DFS70/LEDGF的免疫吸附法图1A)4,5.
本实验方案的目的是展示一种新型工程化 HEp-2 IIF 底物（HEp-2 ELITE/DFS70 敲除（KO），以下简称 HEp-2 ELITE）的应用价值。该底物在保留传统 HEp-2 筛查抗核抗体（ANA）所有优势的同时，能够以高置信度区分单特异性及混合型 ANA 阳性样本中的 DFS70 模式（图1B，算法中的黄色阴影区域）5。HEp-2 ELITE 底物由约 1:9 比例的未修饰传统 HEp-2 细胞与经基因工程改造、缺乏 LEDGF/p75/DFS70 抗原的细胞混合组成5。HEp-2 ELITE 的 IIF 操作流程与传统 HEp-2 方法完全相同。HEp-2 ELITE 底物的独特构型不仅保留了传统 HEp-2 的全部优势，还能在样本初筛或检测时，将均质型、颗粒型及混合型反应模式与 DFS70 模式区分开来（图1B）5。待检测的患者血清应使用筛查稀释液按 1:40 比例稀释，或根据各实验室的具体标准进行稀释。滴度为 1:40 或更高时出现特异性反应，即判为阳性。
在本研究中，选择在1:40稀释度下呈现中等阳性信号（相对于试剂盒提供的阴性对照和阳性ANA对照）的均质型、斑点型、着丝点型、核仁型、胞质网状/AMA型及DFS70型阳性血清，用于在HEp-2底物（常规型和HEp-2 ELITE型）上模拟单特异性及混合型荧光模式。将1:40稀释的DFS70阳性血清与1:40稀释的各类疾病相关ANA模式对照血清（均质型、斑点型、着丝点型、核仁型或胞质网状-AMA型）按不同比例（对照:DFS70为100:0、80:20、50:50、20:80和0:100）混合，并按照下述标准间接免疫荧光（IIF）程序在常规型和HEp-2 ELITE型底物上进行检测评估。

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12孔载玻片，独立密封于袋中</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>ANA阳性对照</td><td>Trinity Biotech&amp;nbsp;</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>DFS70抗体阳性对照</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>阴性对照</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>含伊文思蓝复染剂的抗人IgG FITC偶联物</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>血清稀释缓冲液</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2细胞12孔载玻片，独立密封于袋中</td><td>Trinity Biotech</td><td>属于货号# 1103、1103-240的试剂盒组分</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;研究中使用但未由试剂盒提供的材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>诊断用荧光显微镜</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>配备Spot诊断相机，型号2.2.1</td></tr><tr><td>孵育室</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>提供给客户使用（无目录编号）</td></tr><tr><td>柯普林瓶</td><td>n/a</td><td></td><td>常规实验室器皿</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>n/a</td><td></td><td>常规实验室耗材</td></tr><tr><td>蒸馏水/去离子水</td><td>n/a</td><td></td><td>常规实验室耗材</td></tr></tbody></table>

在ana筛查中利用新型hep-2 elite/dfs70基因敲除底物同时区分单特异性与混合型dfs70模式

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

系统性自身免疫性结缔组织病的特征是存在循环中的抗核抗体（ANA）。尽管目前已有多种技术可用于ANA筛查，但使用人上皮细胞-2（HEp-2）作为底物的间接免疫荧光法（IIF）由于其更高的敏感性，仍是首选且被推荐的主要方法。HEp-2底物能够检测出多种荧光模式，这些模式源于自身抗体与分布于细胞核和细胞质中的各种蛋白质及核酸自身抗原结合。然而，在HEp-2底物上出现的大量单特异性及混合性阳性反应模式也增加了结果判读的复杂性和报告准确性的问题。其中最近受到广泛关注的一个具体例子是致密细颗粒70（DFS70）模式，该模式由针对一种称为晶状体上皮源性生长因子（LEDGF）的蛋白质的自身抗体所引起。由于DFS70模式与特定系统性自身免疫疾病之间缺乏明确关联，且在健康人群中具有较高检出率，因此对其模式的准确判读显得尤为重要。使用传统的HEp-2底物将DFS70模式与疾病相关模式进行明确区分具有挑战性。此外，DFS70模式常与均质型、颗粒型以及混合型（均质-颗粒）等疾病相关模式共存，进一步增加了IIF结果解读的复杂性。本文旨在展示一种新型工程化HEp-2 IIF底物的应用价值，该底物在保留传统HEp-2底物所有优势的同时，能够高度可靠地区分单特异性及混合性ANA阳性样本中的DFS70模式。此外，这种新型底物还能够揭示此前被DFS70模式掩盖的疾病相关ANA荧光模式。

HEp-2 ELITE/DFS70 基因敲除基质可保留经典的抗核抗体（ANA）荧光模式，并有助于清晰区分 DFS70 模式：
HEp-2 ELITE/DFS70 KO底物上的常规细胞与基因工程细胞完全相同，仅缺少LEDGF/p75，其余自身抗原均得以保留。试剂盒提供的阴性对照用于确立本底荧光信号。HEp-2 ELITE上的均质型、颗粒型、着丝点型、核仁型及线粒体型阳性对照所产生的荧光模式与传统HEp-2 IIF底物上的预期模式一致图2A）。这些参考图谱及其各自的抗原和疾病关联此前已有详细描述4,29观察到的模式的简要描述 图2A 提供于 表1.
HEp-2 ELITE上的DFS70模式：
每个反应孔中约有10%的细胞显示出致密的细颗粒型荧光模式（国际自身抗体检测标准化委员会ICAP命名：AC-2），该模式可在间期细胞核上观察到，且在分裂期细胞核中可见与染色质相关的着色（图2B）。在传统的HEp-2底物上，当使用DFS70阳性样本反应时，所有细胞均会呈现此模式。其余约90%的HEp-2细胞中，编码LEDGF抗原的psip1基因已被敲除，因此在与单一特异性DFS70阳性血清反应时不会产生任何信号或荧光模式（图2B）。如果10%的HEp-2细胞显示出对应于DFS70模式的较强荧光，而其余细胞呈现其他附加模式（例如，细颗粒型或核仁型），则表明存在混合型荧光模式。必须对这些模式进行仔细观察，以确认除DFS70模式外存在的所有自身抗体特异性。为展示HEp-2 ELITE底物的检测能力，制备了一组含有不同浓度DFS70和ANA阳性对照血清的血清样本，并采用标准间接免疫荧光（IIF）方法在传统HEp-2底物和HEp-2 ELITE底物上进行检测（图3、图4、图5、图6、图7）。
在传统和HEp-2 ELITE底物上解读DFS70单一反应和混合反应：
对于每一种特定的疾病相关ANA模式（图3, 图4, 图5, 图6, 图7），最左列为单一的ANA模式，最右列为单一的DFS70模式。中间三列代表不同比例的疾病相关抗体阳性对照与DFS70模式阳性对照的混合样本。这些混合模式在传统的HEp-2基质上难以分辨图3, 图4, 图5, 图6, 图7，上排）。然而，使用新型 Hep-2 ELITE 底物时，在大多数样本中，未修饰细胞与工程化细胞之间的荧光强度差异明显，不仅能够确认 DFS70 自身抗体的存在（当较亮细胞与较暗细胞的比例为 1:9 时），还可揭示出第二种 ANA 模式。对于均质型-DFS70 或颗粒型-DFS70 混合反应，无法可靠地判断正确的荧光模式，导致实验室需进行多项额外检测图1A）。在着丝粒型DFS70与核仁型DFS70混合反应的情况下，怀疑DFS70阳性极为困难（图5, 图6）。在核仁型和胞质网状/抗线粒体抗体（AMA）反应中，直到血清稀释比例达到50%时，DFS70模式才成为主导。在所有示例中，HEp-2 ELITE基质能够在更广泛的荧光强度水平下同时呈现DFS70模式及其潜在的次要模式，从而有助于更准确地解读抗核抗体（ANA）。
为仔细观察混合模式，对常规和HEp-2 ELITE底物上ANA和DFS70阳性对照的各种50:50组合结果进行了放大展示（图8）。建议在HEp-2底物上观察所有ANA模式（包括DFS70）的间期和有丝分裂期染色，以提高报告模式的判读准确性和可靠性。然而，对于混合模式，分裂期细胞核所呈现的差异性染色模式可能不足以支持准确判读。红箭头（图8）指示常规细胞和基因工程细胞中的有丝分裂期细胞核。可以观察到，分裂期细胞上的混合DFS70反应不符合已建立的疾病相关ANA模式判读规则。黄箭头和蓝箭头分别指示未修饰的和经基因工程改造的（DFS70基因敲除）HEp-2细胞核。在所有组合中（图8），在同一显微视野下，未修饰细胞核染色强度（约10%）与基因工程细胞核染色模式（约90%）之间存在明显差异，从而可实现DFS70模式的同步筛查与确认。
<img alt="使用 HEp-2 和 DFS70 IIF 方法进行 ANA 筛查的流程图；采用 ELISA、EIA、LIA 进行模式分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：使用传统 HEp-2 和 HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF 方法的 ANA 筛查流程。（A）示意图揭示了传统 HEp-2 IIF 在筛查阶段无法识别单特异性及混合型 DFS70 阳性模式（黄色阴影区域），以及其无法排除可能被 DFS70 模式掩盖的继发性疾病相关 ANA 模式的缺陷。此外，目前的 DFS70 特异性固相确证检测无法确认单特异性 DFS70 阳性，导致需进行额外的 ANA 确证检测。（B）示意图展示了 HEp-2 ELITE 在 ANA 筛查中的能力，可同时区分单特异性与混合型 DFS70 反应，并消除对固相 DFS70 确证检测的需求。采用 HEp-2 ELITE 的流程显著简化了 ANA 筛查过程，并减少了所需的确证检测数量。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HEp-2 细胞 ANA 模式；示意图显示 DFS70 基因敲除细胞、传统细胞与工程化细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：HEp-2 ELITE/DFS70 KO 载体上的典型 ANA 及 DFS70 模式。（A）HEp-2 ELITE/DFS70 KO 载体可保留典型的 ANA 模式。使用试剂盒提供的阳性对照产生了典型的均质型反应和 DFS70 阳性反应。其他反应则使用先前建立的阳性对照血清产生，包括颗粒型、着丝点型、核仁型以及细胞质网状/AMA 型反应5。（B）HEp-2 ELITE/DFS70 KO 载体同时提供传统细胞和工程化细胞，有助于轻松区分 DFS70 模式。示意图展示了 DFS70 单特异性反应结果，以及传统细胞和工程化（DFS70-KO）细胞在间期和分裂期细胞核上的染色模式。工程化的 HEp-2 细胞缺乏 LEDGF/p75/DFS70 抗原，因此能够在传统 HEp-2 载体上通常被 DFS70 自身抗体反应掩盖的次要模式实现同步检测。箭头（黄色）指示有丝分裂期细胞核的示例。比例尺为 20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；DFS70抗体染色；HEP-2细胞；浓度变化结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：DFS70抗体血清与均质型阳性血清联合检测。 将DFS70单特异性血清与均质型阳性对照血清按不同比例（100:0、80:20、50:50、20:80和0:100）混合后，在常规及基因编辑（DFS70-KO）HEp-2细胞基质上进行检测。比例尺表示20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="间接免疫荧光检测结果；颗粒型模式；HEp-2细胞；DFS70蛋白分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：DFS70抗体血清与颗粒型染色血清联合检测结果。 将DFS70单特异性血清与呈现阳性颗粒型染色模式的对照血清按不同比例（100:0、80:20、50:50、20:80和0:100）混合后，在常规及基因工程改造的（DFS70-KO）HEp-2基质细胞上进行检测。比例尺表示20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="HEP-2细胞中着丝粒：DFS70比率的荧光显微镜图，展示核型模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：联合使用DFS70和着丝粒阳性血清。 将DFS70单特异性血清与着丝粒阳性模式对照血清以不同比例（100:0、80:20、50:50、20:80和0:100）混合，并在传统及基因工程改造的（DFS70-KO）HEp-2基质细胞上进行检测。比例尺为20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HEP-2细胞的荧光显微镜图像；核仁蛋白分布；比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：DFS70抗体血清与核仁型抗体血清联合检测。 将DFS70单特异性血清与显示阳性核仁型荧光模式的对照血清按不同比例（100:0、80:20、50:50、20:80 和 0:100）混合，分别在传统HEp-2细胞和基因编辑的HEp-2细胞（DFS70-KO）基质上进行检测。比例尺为20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="HEP-2细胞的荧光显微镜图像，细胞质网状模式，DFS70蛋白分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：DFS70与细胞质网状/AMA血清联用分析。 将DFS70单特异性血清与线粒体阳性模式对照以不同比例（100:0、80:20、50:50、20:80和0:100）混合后，在传统及基因工程改造的（DFS70-KO）HEp-2基质上进行检测。比例尺表示20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，细胞染色比较，HEp-2细胞与DFS70抗体，模式分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：在传统和HEp-2 ELITE底物上产生的混合模式（50:50比例）。 两种底物之间的差异得以显现。红色箭头指示在两种底物上的传统细胞和工程化细胞中的有丝分裂细胞核。对于这些组合，传统HEp-2底物上分裂期细胞核所呈现的差异模式不足以准确解读混合模式。可以观察到，分裂期细胞上的DFS70混合反应可能干扰与疾病相关ANA模式解读的既定规则。黄色和蓝色箭头分别指示未修饰和经工程化（DFS70基因敲除）的HEp-2细胞核。在工程化底物上测试的所有组合结果中：可观察到未修饰细胞（约10%）与工程化细胞（约90%）的间期细胞核染色强度存在明显差异，从而实现了DFS70模式的同步检测与确认。比例尺代表20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANA 模式</td>
			<td colspan="2">描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>均质型</td>
			<td colspan="2">整个细胞核均匀荧光，呈现弥散性染色模式。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>颗粒型</td>
			<td colspan="2">细胞核内可见离散的、从粗到细的颗粒状荧光。已有文献描述过细颗粒型和粗颗粒型模式。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核仁型</td>
			<td colspan="2">核仁染色表现为细胞核内多个实性或颗粒状结构。此前已有亚型描述。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>着丝点型</td>
			<td colspan="2">数量有限的大颗粒状荧光。在有丝分裂细胞中，反应性抗原与凝集的染色体共同分布。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胞质网状/AMA</td>
			<td colspan="2">胞质呈颗粒状，线粒体显示阳性染色。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">• 常规 HEp-2 细胞：间期细胞核呈现致密细颗粒样染色模式，有丝分裂期细胞核可见染色质相关染色。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">• 基因编辑 DFS70 KO 细胞：抗 DFS70 抗体呈阴性染色。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">HEp-2 Elite/DFS70 KO 载片包含常规细胞与基因编辑细胞（DFS70 KO），比例约为 1:9。当与单特异性/分离的 DFS70 阳性样本反应时，常规细胞呈现典型的 DFS70 染色模式，而基因编辑细胞呈阴性染色模式。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：抗核抗体（ANA）模式描述。

DFS70 自身抗体可模拟常见的疾病相关抗核抗体模式，导致在使用传统 HEp-2 底物时难以准确判读。本方案描述了新型工程化 HEp-2 底物相较于传统 HEp-2 底物在抗核抗体筛查中的优势，以及在单特异性和混合型抗核抗体阳性病例中高置信度区分 DFS70 模式的应用。

在ANA筛查中利用新型HEp-2 ELITE/DFS70基因敲除底物同时区分单特异性与混合型DFS70模式

系统性自身免疫性结缔组织病的特征是存在循环中的抗核抗体（ANA）。尽管已有多种技术……

本实验的总体目标是展示一种改进的间接免疫荧光检测方法，该方法采用新型HEp-2细胞基质——致密细颗粒样70（dense fine speckled 70）蛋白敲除基质，用于筛查抗核自身抗体，并同时确认单特异性及混合型致密细颗粒样70荧光模式。该新型HEp-2基质采用标准的间接免疫荧光实验流程和判读标准，用于检测具有临床意义的抗核抗体（antinuclear autoantibodies，简称ANAs）。其主要优势在于可在筛查阶段有效区分致密细颗粒样70模式与疾病相关均质型、颗粒型或其他难以判读的混合型荧光模式。演示该操作的将是来自我们质量控制实验室的技术员 Sofia Badanin。对于底物载玻片，请使用每张载玻片上带有12个孔的玻璃载玻片，每个孔内含有常规的HEp-2细胞，或常规细胞与致密细颗粒70基因敲除HEp-2细胞的混合物。在加样前，将装有底物载玻片的袋子置于室温下平衡，以获得最佳性能，并防止载玻片表面产生冷凝水。此步骤应耗时10至15分钟。待基底载玻片平衡至室温后，用手指小心取出载玻片，避免载玻片与袋内壁接触。标记载玻片，并将其放入已铺有湿润纸巾的孵育 chamber 中，以防止样品和结合物孵育过程中载玻片干燥。将阴性对照、阳性对照以及稀释后的患者血清分别加入到玻片上的各个反应孔中，每孔约50微升，然后将玻片放入孵育室。抗核抗体（ANA）检测是筛查自身免疫性疾病的首要步骤。必须避免玻片上患者样本之间的交叉污染，以最大限度减少假阳性或假阴性结果的出现。为防止孔间交叉污染，请避免过度填充孔。将孵育室的盖子盖上，将载玻片在室温下孵育30分钟。如果患者血清中存在任何抗核抗体（ANA），在此期间其将结合到各孔中存在的细胞上。孵育期结束后，从孵育 chamber 中取出玻片。用手握住玻片的标签端，用约 10 毫升重悬的磷酸盐缓冲液洗涤缓冲液轻轻冲洗 10 至 15 秒。立即将玻片转移至装有 PBS 洗涤缓冲液的 Coplin 瓶中，浸泡 10 分钟。对所有剩余的载玻片重复此步骤。每次仅从 Coplin 染色缸中取出一张载玻片。为去除载玻片上多余的 PBS 洗涤缓冲液，可轻轻将载玻片在纸巾上轻拍或吸干。向每个孔中轻柔地加入一滴异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG荧光结合物。然后，将载玻片放入密闭的染色孵育室中孵育30分钟。孵育结束后，从孵育室中取出载玻片。握住载玻片的标签端，用约10毫升PBS洗涤缓冲液轻轻冲洗，方法同前。立即将载玻片转移至装有PBS洗涤缓冲液的考普林瓶中，浸泡10分钟。将试剂盒中提供的盖玻片放置在干燥的纸巾上。在盖玻片的底边，沿直线滴加3至4滴封片介质。接着，从盛有洗涤缓冲液的考普林瓶中一次取出一张载玻片。为去除多余的洗涤缓冲液，轻轻将载玻片在纸巾上轻敲或按压。避免在载玻片上残留过多洗涤缓冲液、对盖玻片施加过大压力或引入气泡。这些因素均可能影响细胞形态、荧光模式以及反应强度。将载玻片轻轻放于盖玻片上，先将载玻片的下边缘接触盖玻片的边缘，再缓缓放下。 这能使盖玻片上的封片介质流向载玻片的上边缘，并尽量减少气泡的形成，以免气泡干扰各孔的观察。在暗室中使用荧光显微镜，并配备异硫氰酸荧光素滤光片组观察载玻片。在显微镜下以200倍或更高的放大倍数检查样本是否存在特异性的亮绿色荧光，以最终判断结果是否为阳性及其荧光模式。观察阳性对照和阴性对照。阳性对照的细胞核中会显示明亮的绿色荧光。阴性对照在荧光显微镜下不会显示特异性的绿色荧光。记录每个孔的阳性或阴性结果，并针对阳性样本注明 ANA 模式。HEp-2 致密细颗粒 70 基因敲除基质可保留所有主要的核内和胞质模式。致密细颗粒模式的特征是在间期细胞核中呈现均匀分布的细颗粒状染色，并在有丝分裂期的染色质中可见。同时存在表达致密细颗粒70抗原的传统HEp-2细胞和不表达该抗原的基因工程HEp-2细胞，有助于准确区分致密细颗粒70模式，同时保留传统HEp-2基质的所有优势。将针对主要疾病相关抗核抗体（ANA）模式呈阳性的血清与致密细颗粒70模式阳性血清等比例混合后，在传统HEp-2基质和HEp-2致密细颗粒70基因敲除基质上进行检测。图中红色箭头指示处于有丝分裂期的细胞。黄色箭头指示传统的 HEp-2 细胞核，蓝色箭头指示经基因改造的 HEp-2 细胞核。对于图中所示的所有反应组合，致密细颗粒 70 基因敲除底物在同一视野下显示出未修饰细胞与工程化细胞之间的明显强度差异。这有助于区分单特异性与混合型致密细颗粒 70 反应。针对核抗原和胞质抗原的自身抗体在系统性自身免疫性疾病中非常常见。由抗DFS70自身抗体（也称为PSIP1蛋白）引起的致密细颗粒型荧光模式，在健康人群中被发现具有很高的检出率。此外，这些DFS70自身抗体既可单独出现，也可与其他疾病相关的抗核抗体（ANAs）共同存在。因此，临床实验室准确区分该模式与其他疾病相关模式显得至关重要。例如，与系统性红斑狼疮相关的混合型均质颗粒型模式可能被误判为DFS70模式，从而需要进行多项确证性检测。采用HEp-2细胞基质的间接免疫荧光法被公认为抗核抗体（ANA）筛查的金标准方法。然而，检测的准确性在很大程度上依赖于技术人员的操作技能、各步骤的规范执行以及对结果图谱的准确判读。相比之下，通过对比常规HEp-2细胞和DFS70基因敲除底物的应用，表明这种新型底物在筛查抗核抗体（ANA）时，能够高置信度地区分出DFS70荧光模式。利用这种改进的HEp-2底物，对单一阳性及混合型DFS70模式的进一步判读也相对简化。新型底物采用标准的间接免疫荧光方案以及针对所有临床相关抗核抗体（ANA）模式的既定判读标准。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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了解使用新型HEp-2 DFS70敲除底物进行间接免疫荧光检测的方法，用于筛查抗核抗体并同时鉴别单特异性和混合性DFS70模式。该技术可提高自身免疫疾病诊断的准确性。

在ANA筛查中利用新型HEp-2 ELITE/DFS70基因敲除底物同时区分单特异性与混合型DFS70模式

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