在ANA筛查中利用新型HEp-2 ELITE/DFS70基因敲除底物同时区分单特异性与混合型DFS70模式

本实验的总体目标是展示一种改进的间接免疫荧光检测方法，该方法采用新型HEp-2细胞基质——致密细颗粒样70（dense fine speckled 70）蛋白敲除基质，用于筛查抗核自身抗体，并同时确认单特异性及混合型致密细颗粒样70荧光模式。该新型HEp-2基质采用标准的间接免疫荧光实验流程和判读标准，用于检测具有临床意义的抗核抗体（antinuclear autoantibodies，简称ANAs）。其主要优势在于可在筛查阶段有效区分致密细颗粒样70模式与疾病相关均质型、颗粒型或其他难以判读的混合型荧光模式。

演示该操作的将是来自我们质量控制实验室的技术员 Sofia Badanin。对于底物载玻片，请使用每张载玻片上带有12个孔的玻璃载玻片，每个孔内含有常规的HEp-2细胞，或常规细胞与致密细颗粒70基因敲除HEp-2细胞的混合物。在加样前，将装有底物载玻片的袋子置于室温下平衡，以获得最佳性能，并防止载玻片表面产生冷凝水。

此步骤应耗时10至15分钟。待基底载玻片平衡至室温后，用手指小心取出载玻片，避免载玻片与袋内壁接触。标记载玻片，并将其放入已铺有湿润纸巾的孵育 chamber 中，以防止样品和结合物孵育过程中载玻片干燥。

将阴性对照、阳性对照以及稀释后的患者血清分别加入到玻片上的各个反应孔中，每孔约50微升，然后将玻片放入孵育室。抗核抗体（ANA）检测是筛查自身免疫性疾病的首要步骤。必须避免玻片上患者样本之间的交叉污染，以最大限度减少假阳性或假阴性结果的出现。

为防止孔间交叉污染，请避免过度填充孔。将孵育室的盖子盖上，将载玻片在室温下孵育30分钟。如果患者血清中存在任何抗核抗体（ANA），在此期间其将结合到各孔中存在的细胞上。

孵育期结束后，从孵育 chamber 中取出玻片。用手握住玻片的标签端，用约 10 毫升重悬的磷酸盐缓冲液洗涤缓冲液轻轻冲洗 10 至 15 秒。立即将玻片转移至装有 PBS 洗涤缓冲液的 Coplin 瓶中，浸泡 10 分钟。

对所有剩余的载玻片重复此步骤。每次仅从 Coplin 染色缸中取出一张载玻片。为去除载玻片上多余的 PBS 洗涤缓冲液，可轻轻将载玻片在纸巾上轻拍或吸干。

向每个孔中轻柔地加入一滴异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG荧光结合物。然后，将载玻片放入密闭的染色孵育室中孵育30分钟。孵育结束后，从孵育室中取出载玻片。

握住载玻片的标签端，用约10毫升PBS洗涤缓冲液轻轻冲洗，方法同前。立即将载玻片转移至装有PBS洗涤缓冲液的考普林瓶中，浸泡10分钟。将试剂盒中提供的盖玻片放置在干燥的纸巾上。

在盖玻片的底边，沿直线滴加3至4滴封片介质。接着，从盛有洗涤缓冲液的考普林瓶中一次取出一张载玻片。为去除多余的洗涤缓冲液，轻轻将载玻片在纸巾上轻敲或按压。

避免在载玻片上残留过多洗涤缓冲液、对盖玻片施加过大压力或引入气泡。这些因素均可能影响细胞形态、荧光模式以及反应强度。将载玻片轻轻放于盖玻片上，先将载玻片的下边缘接触盖玻片的边缘，再缓缓放下。

这能使盖玻片上的封片介质流向载玻片的上边缘，并尽量减少气泡的形成，以免气泡干扰各孔的观察。在暗室中使用荧光显微镜，并配备异硫氰酸荧光素滤光片组观察载玻片。在显微镜下以200倍或更高的放大倍数检查样本是否存在特异性的亮绿色荧光，以最终判断结果是否为阳性及其荧光模式。

观察阳性对照和阴性对照。阳性对照的细胞核中会显示明亮的绿色荧光。阴性对照在荧光显微镜下不会显示特异性的绿色荧光。

记录每个孔的阳性或阴性结果，并针对阳性样本注明 ANA 模式。HEp-2 致密细颗粒 70 基因敲除基质可保留所有主要的核内和胞质模式。致密细颗粒模式的特征是在间期细胞核中呈现均匀分布的细颗粒状染色，并在有丝分裂期的染色质中可见。

同时存在表达致密细颗粒70抗原的传统HEp-2细胞和不表达该抗原的基因工程HEp-2细胞，有助于准确区分致密细颗粒70模式，同时保留传统HEp-2基质的所有优势。将针对主要疾病相关抗核抗体（ANA）模式呈阳性的血清与致密细颗粒70模式阳性血清等比例混合后，在传统HEp-2基质和HEp-2致密细颗粒70基因敲除基质上进行检测。图中红色箭头指示处于有丝分裂期的细胞。

黄色箭头指示传统的 HEp-2 细胞核，蓝色箭头指示经基因改造的 HEp-2 细胞核。对于图中所示的所有反应组合，致密细颗粒 70 基因敲除底物在同一视野下显示出未修饰细胞与工程化细胞之间的明显强度差异。这有助于区分单特异性与混合型致密细颗粒 70 反应。

针对核抗原和胞质抗原的自身抗体在系统性自身免疫性疾病中非常常见。由抗DFS70自身抗体（也称为PSIP1蛋白）引起的致密细颗粒型荧光模式，在健康人群中被发现具有很高的检出率。此外，这些DFS70自身抗体既可单独出现，也可与其他疾病相关的抗核抗体（ANAs）共同存在。

因此，临床实验室准确区分该模式与其他疾病相关模式显得至关重要。例如，与系统性红斑狼疮相关的混合型均质颗粒型模式可能被误判为DFS70模式，从而需要进行多项确证性检测。采用HEp-2细胞基质的间接免疫荧光法被公认为抗核抗体（ANA）筛查的金标准方法。

然而，检测的准确性在很大程度上依赖于技术人员的操作技能、各步骤的规范执行以及对结果图谱的准确判读。相比之下，通过对比常规HEp-2细胞和DFS70基因敲除底物的应用，表明这种新型底物在筛查抗核抗体（ANA）时，能够高置信度地区分出DFS70荧光模式。利用这种改进的HEp-2底物，对单一阳性及混合型DFS70模式的进一步判读也相对简化。

新型底物采用标准的间接免疫荧光方案以及针对所有临床相关抗核抗体（ANA）模式的既定判读标准。