Name: 植物标本标本的鲁棒 DNA 分离与高通量测序库建设 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 学习从植物标本中高效分离DNA并构建高通量测序文库的完整实验方案。该方法利用液氮研磨和CTAB提取技术，可从降解的历史标本中获得足量双链DNA，为系统发育基因组学研究提供可靠的分子数据支持。

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感谢 Taylor AuBuchon-Elder、Jordan Teisher 和 Kristina Zudock 在采集标本馆标本方面的协助，以及密苏里植物园提供用于破坏性取样的标本馆标本。本研究工作得到了美国国家科学基金会资助（项目编号：DEB-1457748）的支持。

1. 实验开始前
<ol>
	<li>通过将 20 g 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、10 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）40、100.0 mL 1 M Tris（pH 8.0）、40 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）、280.0 mL 5 M NaCl 和 400.0 mL 试剂用水混合，然后用试剂级水定容至 1 L，配制新鲜的 CTAB 缓冲液17。调节 pH 至 8.0。 
	注意：可根据不同分类群中的次生化合物，在 CTAB 缓冲液中添加其他试剂。有关添加剂试剂的完整列表，请参见 Allen 等18。</li>
	<li>每 5 mL CTAB 缓冲液中加入 10 µL β-巯基乙醇。 
	注意：可按 50 mL 批量配制，室温保存 3–4 周。
	<ol>
		<li>将 CTAB 溶液置于 65 °C 水浴中加热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将研钵和研杵置于 -20 °C 冷冻至少 20 分钟。</li>
	<li>标记 4 套 2 × n 个 2 mL 离心管（其中 n = 样品数量）。将其中一套标记好的离心管放在冰上。</li>
	<li>将异丙醇置于冰上或 -20 °C 冰箱中预冷。</li>
	<li>从冰箱中取出固相可逆固定化（SPRI）磁珠（见材料表），使其恢复至室温（至少 30 分钟）。</li>
	<li>配制 80% 乙醇。</li>
	<li>选择用于提取的标本馆标本，每份标本取约 1 cm2 或 10 mg 组织，优先选用叶片材料。</li>
</ol>
2. DNA 提取
<ol>
	<li>使用预冷的研钵和研杵研磨约 1 cm2 预选的标本组织。加入液氮和 30–50 mg 灭菌沙子，研磨至组织成为细粉。 
	注意：理想情况下使用 10 mg 或更多的组织，但在某些情况下更少量也可行。液氮挥发后，根据需要补充，直至组织完全研碎。另一种常用的破碎细胞和组织的方法是使用珠磨机。然而，该方法在本实验所用样本中效果不佳。</li>
	<li>将冷冻粉末转移至两个 2 mL 离心管中（填充量不超过管体积的一半）。向每管加入 600 µL 温热的 CTAB 溶液，并通过倒置和涡旋充分混匀。 
	注意：由于标本材料的数量和质量通常较低，进行两次重复的 DNA 提取有助于获得更高的得率。</li>
	<li>将样品在 65 °C 水浴中孵育 1–1.5 小时，每隔 15 分钟涡旋一次。</li>
	<li>在 10,000 x g 条件下离心样品 5 分钟。将上清液转移至一组新的标记管中（约 500 µL）。按照标准非含氯废弃物处理程序弃去沉淀。</li>
	<li>向每管加入 4 µL RNase-A（10 mg/mL），通过倒置或移液混匀。将样品在 37 °C 金属浴或水浴中孵育 15 分钟。</li>
	<li>当试管恢复至室温后，向每管加入等体积（约 500 µL）的 25:24:1 苯酚:氯仿:异戊醇混合液。通过反复移液和/或倒置充分混匀。在 12,000 x g 条件下离心 15 分钟。将水相（上层）转移至一组新的标记管中（约 400 µL）。将有机相弃入含氯废液容器中。 
	注意：若植物材料中预期含有大量次生代谢物，可重复步骤&#160;2.6。</li>
	<li>向每管加入等体积（约 400 µL）的 24:1 氯仿:异戊醇混合液。通过反复移液和/或倒置充分混匀。在 12,000 x g 条件下离心 15 分钟。将水相（上层）转移至一组预冷的标记管中（约 300 µL）。将有机相弃入含氯废液容器中。</li>
	<li>向每管加入等体积（约 300 µL）预冷的异丙醇和 12 µL 2.5 M 醋酸钠。在 -20 °C 条件下孵育 30–60 分钟。 
	注意：孵育时间可延长（最长至过夜），但孵育时间越长，DNA 质量越低。</li>
	<li>从冰箱中取出样品，在 12,000 x g 条件下离心 15 分钟。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。用新鲜的 70% 乙醇（约 300–500 µL）重悬沉淀进行洗涤。对于每对重复样品，将两个独立的沉淀合并至同一管中，并加入相应乙醇。 
	注意：应先用乙醇将样品合并至同一管中，再继续后续操作。无需分别对每个样品单独进行乙醇洗涤。</li>
	<li>在 12,000 x g 条件下离心 10 分钟。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。将沉淀在空气中干燥。 
	注意：可使用干燥金属浴加快干燥（温度不超过 65 °C）。注意避免样品过度干燥，否则会降低最终 DNA 得率。</li>
	<li>将提取的 DNA 溶于 50 µL 1x TE 缓冲液中。长期保存可置于 -20 °C 冰箱，若计划在一周内使用可存放于 4 °C。</li>
</ol>
3. 质量控制（QC）
<ol>
	<li>进行琼脂糖凝胶电泳以进行质量检测。
	<ol>
		<li>通过加入54 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱、27.5 g硼酸和3.75 g乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐，并用试剂级水定容至5 L，配制1×三羟甲基氨基甲烷/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液。</li>
		<li>将1 g琼脂糖加入100 mL的1×TBE缓冲液中，制备1%琼脂糖凝胶。将溶液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解。加入0.01%核酸凝胶染料（参见材料表）。将烧瓶冷却至温热可触。充分搅拌混匀。将琼脂糖倒入凝胶模具中，静置至完全凝固。</li>
		<li>取3 µL样品、2 µL试剂级水和1 µL 6×上样染料混合。按顺序将样品加入凝胶孔中，并记录样品排列顺序。</li>
		<li>在60–70 V电压下电泳60–70分钟。使用适当的曝光和对焦在紫外光下成像。 
		注意：清晰的高分子量条带表明DNA质量较高，而弥散条带通常提示DNA降解。大多数标本馆样本存在DNA降解现象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行双链DNA定量分析（参见材料表），以确定双链DNA的含量。
	<ol>
		<li>使用2 µL样品进行分析。 
		注意：标本馆材料通常含量极低，因此定量分析时无需稀释。本步骤中仅使用1.26 ng总双链DNA即可成功构建文库。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA 剪切
注意：这是商用双链片段化酶试剂盒方案（参见材料表）的优化版本。
<ol>
	<li>将双链DNA片段化酶涡旋3秒后置于冰上。</li>
	<li>在无菌的0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中，将1–16 µL分离得到的DNA与2 µL配套的片段化反应缓冲液混合。用无核酸酶水将总体积补至18 µL。加入2 µL双链DNA片段化酶，涡旋混匀3秒。 
	注意：所需DNA量取决于DNA浓度（目标为管中总量达到200 ng）。</li>
	<li>将样品在37 °C孵育8.5分钟。孵育结束后立即向各管中加入5 µL 0.5 M EDTA。 
	注意：此步骤必须在孵育结束后立即进行，以终止反应，防止DNA过度剪切。</li>
</ol>
5. 磁珠纯化
<ol>
	<li>通过涡旋振荡使 SPRI 磁珠充分混匀。</li>
	<li>加入 25 µL 无核酸酶水，将剪切后的 DNA 总体积调整至 50 µL。向 50 µL 剪切 DNA 中加入 45 µL 室温 SPRI 磁珠（90% 体积），并通过反复吹打充分混匀。 
	注意：以样品总体积的 90% 加入磁珠可去除最小的 DNA 片段，这些片段通常小于 200 个碱基对。</li>
	<li>将样品室温孵育 5 分钟。将离心管置于磁力架上静置 5 分钟，小心移除并弃去上清液。 
	注意：操作时需避免扰动磁珠，因为磁珠上结合有目标 DNA。</li>
	<li>将离心管保持在磁力架上，加入 200 µL 新配制的 80% 乙醇。室温孵育 30 秒后，小心移除并弃去上清液。重复此步骤一次。在磁力架上打开管盖，将磁珠空气干燥 5 分钟。 
	注意：避免磁珠过度干燥，否则可能导致 DNA 回收率降低。</li>
	<li>将离心管从磁力架上取下。加入 55 µL 0.1x TE 缓冲液，通过反复吹打使 DNA 从磁珠上洗脱，并充分混匀。室温孵育 5 分钟。将离心管放回磁力架，等待溶液变澄清（约 2 分钟）。</li>
	<li>吸取 52 µL 上清液。对样品进行 DNA 定量分析，以检测回收量及用于文库构建的初始浓度。 
	注意：已有使用总双链 DNA 估计量低于 1.25 ng 的样品成功构建文库的案例，但在每种情况下均需进行重新扩增。</li>
</ol>
6. 文库构建
注意：这是市售文库试剂盒的修改版本（参见材料表中的实验方案）。
<ol>
	<li>末端修复
	<ol>
		<li>向50 µL经纯化并剪切的DNA中加入3 µL内切酶和磷酸化尾端修饰酶，以及7 µL配套反应缓冲液。通过反复吹打充分混匀。短暂离心以去除气泡。 
		注意：总体积应为60 µL。</li>
		<li>将样品放入热循环仪中，程序设置如下：20 °C孵育30分钟，65 °C孵育30分钟，然后保持在4 °C。 
		注意：加热盖温度应设置为≥75 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接头连接
	<ol>
		<li>将接头稀释25–50倍（工作浓度为0.6–0.3 µM）。向各管中加入30 µL连接反应主混合液、1 µL连接增强剂和2.5 µL用于高通量短读长测序的接头。 
		注意：总体积应为93.5 µL。</li>
		<li>通过反复吹打充分混匀。短暂离心以去除气泡。将反应管在20 °C孵育15分钟。</li>
		<li>向各管中加入3 µL市售的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）与DNA糖基化酶-裂解酶Endonuclease VIII的混合物（参见材料表）。确保总体积为96.5 µL。充分混匀后，使用热循环仪在37 °C孵育15分钟。 
		注意：加热盖温度应设置为≥47 °C。原始市售方案在接头连接步骤后进行片段大小选择，并以磁珠纯化作为最后步骤。本方案为获得更高得率，调整了这两个步骤的顺序，将大小选择作为最终步骤执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化以去除酶和小片段
	<ol>
		<li>通过涡旋振荡使磁珠充分混匀。</li>
		<li>向各管中加入78 µL SPRI磁珠（80%体积），并通过反复吹打充分混匀。 
		注意：加入相当于样品总体积80%的磁珠，旨在去除最短的DNA片段（通常短于250个碱基对）。更严格地去除小片段DNA的目的在于：(i) 去除过量的接头；(ii) 在后续步骤中优先扩增较长的DNA片段。</li>
		<li>让样品孵育5分钟。将反应管置于磁力架上5分钟。小心移除并弃去含有不在目标大小范围内的DNA的上清液。 
		注意：操作时请勿扰动吸附有目标DNA的磁珠。</li>
		<li>将反应管保持在磁力架上，加入200 µL新鲜的80%乙醇。室温孵育30秒后，小心移除并弃去上清液。重复此步骤一次。在磁力架上打开管盖，将磁珠空气干燥5分钟。 
		注意：避免磁珠过度干燥，否则可能导致DNA回收率降低。</li>
		<li>将反应管从磁力架上取下。通过加入17 µL 0.1x TE缓冲液洗脱DNA，反复吹打充分混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟。将反应管放回磁力架，等待溶液变澄清（约2分钟）。</li>
		<li>吸取15 µL上清液用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增
	<ol>
		<li>向15 µL经纯化的接头连接DNA中加入25 µL高保真PCR主混合液、5 µL高通量短读长测序文库制备5'引物和5 µL高通量短读长测序文库制备3'引物。 
		注意：总体积应为50 µL。</li>
		<li>充分涡旋混匀。将样品放入热循环仪中，采用表1中列出的扩增程序进行PCR。 
		注意：由于起始DNA量较低，需要较多的扩增循环数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>循环步骤</td>
			<td>温度&#160;</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火/延伸</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>75 s</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存</td>
			<td>4 °C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：PCR方案的变性、退火和延伸时间及温度。 温度和时间已针对本方案中所列试剂进行了优化。若更换试剂，应重新优化温度和时间。
<ol start="5">
	<li>目标文库大小的片段筛选 
	注意：此磁珠步骤将去除目标范围以上和以下的片段。
	<ol>
		<li>通过涡旋振荡使 SPRI 磁珠充分混匀。</li>
		<li>加入 25 µL（50% 体积）室温磁珠，通过反复吹打充分混匀。让样品孵育 5 分钟。将管子置于磁力架上，静置 5 分钟。小心移除上清液并转移至一组新的标记管中。 
		注意：此体积可根据所需文库大小进行调整。上清液中含有目标大小的 DNA 片段。在第一次磁珠孵育中，磁珠结合了较大的文库片段。这些片段被去除，以富集 400–600 碱基对范围内的片段。上清液中为较小的片段。</li>
		<li>向上清液中加入 6 µL 室温 SPRI 磁珠，通过反复吹打充分混匀。让样品孵育 5 分钟。将管子置于磁力架上，静置 5 分钟。 
		注意：此体积可根据所需文库大小，依照步骤 6.5.2 进行调整。</li>
		<li>小心移除并弃去上清液。 
		注意：注意不要扰动含有目标 DNA 的磁珠。在第二次磁珠孵育中，磁珠结合了在去除最大 DNA 片段后剩余的片段。这些片段通常处于目标大小范围内。</li>
		<li>将管子置于磁力架上，加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇。室温孵育 30 秒，然后小心移除并弃去上清液。重复一次。在磁力架上打开管盖，将磁珠风干 5 分钟。 
		注意：避免磁珠过度干燥，否则可能导致 DNA 回收率降低。</li>
		<li>将管子从磁力架上取下。用 33 µL 0.1x TE 缓冲液洗脱磁珠上的 DNA 目标物，并通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。将管子置于磁力架上，等待溶液变澄清（约 2 分钟）。吸取 30 µL 上清液，转移至 2 mL 管中（见材料表）用于储存。 
		注意：文库可在 -20 ˚C 长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质量控制
	<ol>
		<li>对 DNA 文库进行质量控制检测。参考步骤 3.1 和 3.2。 
		注意：对于 DNA 文库，以 96 V 电压电泳约 45 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库再扩增：若文库量不足时可选此步骤。 
	注意：文库浓度低于 10 nM 的样品可使用以下步骤进行再扩增。低浓度文库的再扩增可获得适用于测序的产物，但可能引起碱基组成多样性的轻微偏移；然而已有数据（表 3）表明，对于某些指标而言，这种偏移可忽略不计。
	<ol>
		<li>使用 0.1x TE 将通用再扩增引物稀释 10 倍。</li>
		<li>向 15 µL 低浓度文库中加入 25 µL 高保真 PCR 预混液、5 µL 稀释后的通用再扩增引物 1（AATGATACGGCGACCACCGA）和 5 µL 稀释后的通用再扩增引物 2（CAAGCAGAAGACGGCATACGA）。注意：总体积应为 50 µL。</li>
		<li>通过涡旋振荡充分混匀。将样品放入热循环仪，使用表 1中列出的参数进行扩增： 
		注意：由于输入 DNA 量较少，需要较多的扩增循环数。</li>
		<li>磁珠纯化</li>
		<li>通过涡旋振荡使 SPRI 磁珠充分混匀。加入 45 µL 室温 SPRI 磁珠（90% 体积），并通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>让样品孵育 5 分钟。将管子置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
		<li>小心移除并弃去含有非目标 DNA 的上清液。 
		注意：注意不要扰动含有目标 DNA 的磁珠。</li>
		<li>将管子置于磁力架上，加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇。室温孵育 30 秒，然后小心移除并弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
		<li>在磁力架上打开管盖，将磁珠风干 5 分钟。 
		注意：避免磁珠过度干燥，否则可能导致目标 DNA 回收率降低。</li>
		<li>将管子从磁力架上取下。用 33 µL 0.1x TE 缓冲液洗脱磁珠上的 DNA 目标物，并通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。将管子置于磁力架上，等待溶液变澄清（约 2 分钟）。</li>
		<li>吸取 30 µL 上清液。文库可在 -20 °C 长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质量控制
	<ol>
		<li>对 DNA 文库进行质量控制检测。参考步骤 3.1 和 3.2。对于 DNA 文库，以 96 V 电压电泳约 45 分钟。 
		注意：若凝胶中出现双条带，可能是再扩增步骤中引物耗尽所致。可通过重复步骤 6.9 并在 表 1 所示 PCR 程序中仅使用一个循环来去除这些条带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争利益。

本文介绍的方法是一种从干燥植物标本中提取DNA并构建测序文库的全面且可靠的方案。该方法具有良好的重复性，且基本无需根据标本质量进行调整，因此适用于大规模基于标本馆的测序项目。方案中包含一个可选的低产量文库再扩增步骤，使得低质量、低含量、稀有或具有重要历史价值的样本也能够被纳入测序范围，而这些样本通常难以满足常规测序要求。
初始DNA得率的重要性 
由于初始标本保存方式的影响，从标本馆材料中提取的DNA通常会发生降解11，年龄不足300年的标本其DNA降解程度可与数百至数千年前动物遗骸中提取的DNA相当31,32。因此，优化初始DNA得率对于获得足量高质量的双链DNA（dsDNA）以成功构建测序文库至关重要。对于禾本科物种，通过在初始研磨步骤中联合使用灭菌砂和液氮，可更彻底地破坏细胞壁并释放核酸，从而实现最佳的DNA得率。该方法可同时增加理想的较长双链DNA片段和不理想的较短片...

标本馆收藏是系统发育学1,2,3、群体遗传学4,5、保护生物学6、入侵物种生物学7以及性状演化8等研究中物种多样性与基因组多样性的重要潜在来源。能够获取丰富多样的物种、种群、地理来源和时间点，凸显了标本馆作为&#34;宝库&#34;9的价值。历史上，源自标本馆材料的DNA降解问题一直阻碍基于PCR的研究，常使研究人员只能使用高拷贝数的分子标记，例如叶绿体基因组区域或核糖体RNA的内转录间隔区（ITS）。标本及其DNA的质量因保存方法的不同而存在广泛差异9,10，其中干燥过程中受热导致的双链断裂和DNA片段化是最常见的损伤形式，造成了所谓的90% DNA“锁闭”现象，严重限制了基于PCR的研究11。除片段化外，标本馆基因组学中第二普遍的问题是污染，例如来自内生真菌13，或在采集后、装订前死亡个体所获得的真菌污染12；不过，若具备合适的真菌数据库，该问题可通过生物信息学手段解决（见下文）。第三个但较少见的问题是胞嘧啶脱氨作用（C/G→T/A）引起的序列修饰14，尽管据估计其在标本馆标本中的发生率较低（约0.03%）11。随着高通量测序（HTS）技术的发展，利用短读长和足够的测序深度可克服片段化问题12,15，使得即使DNA质量较低的大量标本也能获得基因组水平的数据，甚至在某些情况下实现全基因组测序15。
标本馆样本的使用日益频繁，已成为系统发育研究项目中越来越重要的组成部分16。当前利用标本馆标本进行高通量测序（HTS）面临的一个挑战是，如何在无需针对单个样本优化方法的前提下，及时、稳定地从大量物种中获得足量的双链DNA——这是测序流程的必要前提。本文展示了一种适用于标本馆标本的DNA提取与文库构建方案，该方案在现有方法基础上加以改进，以实现快速且可重复的结果。该方法可在13小时内完成从样本到24个样本文库的全部流程，其中实际操作时间为8小时；若需要进行可选的再扩增步骤，则总耗时为16小时，操作时间为9小时。同时处理更多样本也是可行的，但受限于离心机容量和技术操作能力。该方案仅需常规实验室设备（如PCR仪、离心机和磁力架），无需使用雾化器或超声波破碎仪等特殊设备进行DNA片段化。
DNA 质量、片段大小和数量是限制腊叶标本在高通量测序实验中应用的关键因素。已有其他方法用于提取腊叶标本 DNA 并构建高通量测序文库，证明仅使用 10 ng DNA 即可有效进行测序16；然而这些方法需要通过实验确定文库构建所需的最适 PCR 循环数。当可扩增的双链 DNA（dsDNA）含量极低时，这种方法变得不切实际，因为某些腊叶标本仅能提供足够进行一次文库构建的 DNA 量。本文所介绍的方法无论样本质量如何，均采用固定的 PCR 循环次数，因此在文库优化步骤中不会损失任何 DNA。若文库未达到测序所需的最低量，则通过重新扩增步骤进行补充。许多腊叶标本稀有且材料有限，使得在多数情况下难以合理化进行破坏性取样。为应对这一问题，本方案允许在文库构建过程中投入少于 1.25 ng 的 dsDNA，从而扩大了可用于高通量测序的样本范围，并最大限度减少了对标本的破坏性取样需求。
以下实验方案已针对禾本科植物进行了优化，并已在数百种不同物种的标本馆样本上进行了测试，尽管我们预计该方案也可应用于许多其他植物类群。方案中包含一个可选的恢复步骤，可用于挽救低质量和/或稀有样本。基于对两百余份标本馆样本的测试结果，该方案适用于组织投入量少且质量较低的样本，从而通过最小破坏性取样实现稀有标本的保护。本文结果表明，该方案能够构建高质量文库，可用于基于系统发育基因组学的测序项目。

<table><tbody><tr><td>Veriti 热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 系列微量离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>电泳系统</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2（超纯水）</td><td>ELGA&amp;nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>研钵</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>瓷质</td></tr><tr><td>研杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>瓷质</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 条形管及盖</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>液氮短期储存罐</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>磁力环架&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>加热搅拌器</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 × TE 缓冲液</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp PLUS DNA 标准分子量标记</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>超纯</td></tr><tr><td>紫色上样染料（6 ×）</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA 片段化酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina）&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 多重接头引物组（适用于 Illumina）</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>双索引引物组 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 热启动高保真 PCR 预混液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 ×</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>苯酚溶液</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 证明</td></tr><tr><td>二氧化硅砂</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>再扩增引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>见正文</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物标本dna高效提取及高通量测序文库构建

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

标本馆是可用于多种生物学研究的宝贵植物材料来源。使用标本馆标本面临诸多挑战，包括样本保存质量参差、DNA降解以及对稀有标本的破坏性取样。为了在大规模测序项目中更有效地利用标本馆材料，亟需一种可靠且可扩展的DNA提取与文库构建方法。本文展示了一种稳健、从头到尾的完整实验流程，用于从标本馆标本中提取DNA并构建高通量测序文库，且无需针对单个样本进行流程调整。该流程专为低质量的干燥植物材料优化设计，通过改进组织研磨、调整文库片段大小选择，并引入可选的低产量文库再扩增步骤，整合并优化了现有方法。对低产量DNA文库进行再扩增，可挽救来自不可替代且潜在重要价值的标本馆标本的样本，避免进一步的破坏性取样，且在常见的系统发育学应用中不会引入可察觉的测序偏差。该流程已在数百种禾本科植物中测试验证，预期在其他植物类群中经适当验证后亦可适用。该方法的局限性在于DNA极度降解（片段长度不在理想大小范围内）以及某些植物材料中存在的次生代谢物，后者可能抑制DNA的纯净提取。总体而言，该流程提供了一种快速而全面的方法，可在不到13小时的时间内完成24个样本的DNA提取与文库构建，其中实际操作时间仅需约8小时，且所需调整极少。

DNA 提取与最终文库产量 
在本研究中，通过使用五十个不同样本验证了该实验方案在分离腊叶标本DNA及构建高质量测序文库方面的有效性，其中最古老的样本来自1920年，最新的样本来自2012年（表 2）。每个样本使用约10 mg叶片组织进行DNA提取。若条件允许，优先选择更绿的叶片组织，且不选用有明显真菌污染的组织。虽然也可使用发黄或褐色的组织进行提取，但预期产量会较低。初始提取获得的总双链DNA（dsDNA）含量范围为3.56 ng至2,610 ng。与预期一致，从标本馆标本中提取的DNA高度降解（图1A, 补充材料 图1）。部分提取物用于酶切剪切（1.26–464 ng）。尽管标本馆DNA在保存过程中已发生剪切，但为优化实验流程，仍需进行额外剪切以提高文库总产量。剪切后双链DNA的总回收量范围为 &lt;输入的双链DNA中有1%至51%得以保留，...

本文展示了一种从标本馆材料中提取DNA并构建高通量测序文库的详细方案，包括对质量极差的DNA进行挽救的方法。

植物标本DNA高效提取及高通量测序文库构建

标本馆是植物材料的宝贵来源，可用于多种生物学研究。使用标本馆标本与……相关

本实验方案的总体目标是提高从腊叶标本中分离出的双链DNA数量及其后续高通量测序文库的产量，从而最大化其在系统发育基因组学研究中的应用价值。该方法能够释放那些因样本严重降解而原本无法用于基因组测序项目的腊叶标本的潜在用途。该技术的主要优势在于其具有足够的稳健性，可利用稀有且具有重要历史意义的腊叶标本，而无需进行大规模的破坏性取样。该技术可扩展系统发育取样项目中的分类群取样深度。物种获取是一个限制性步骤，但通过本方案，可方便地将历史馆藏材料用于这些研究。在预冷的研钵中加入液氮和30至50毫克灭菌沙子，用于研磨预先选定的一平方厘米腊叶标本组织，直至形成细粉。充分研磨对于成功分离DNA至关重要。应注意确保样品被完全粉碎。接下来，将冷冻粉末加入两支2毫升离心管中，填充量不得超过管体积的一半。然后向每个管中加入 600 µL 温热的 CTAB 溶液。通过颠倒和涡旋充分混匀粉末。随后将样品置于保持在 65 °C 的水浴中孵育 1 至 1.5 小时。在此期间，每15分钟涡旋一次。然后在室温下以10,000 g离心5分钟。离心后，将约500微升上清液转移至一组新的、已标记的干净离心管中。向每管上清液中加入 4 µL 浓度为 10 毫克/毫升的 RNase A。然后通过倒置或移液混匀管内溶液。将样品置于保持在 37 °C 的加热块或水浴中孵育 15 分钟。待离心管恢复至室温后，向样品中加入约 500 µL 的 25:24:1 酚-氯仿-异戊醇混合液。通过反复倒置或移液混匀管内溶液。然后在室温下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。将上层水相（约400微升）转移至一组新的已标记离心管中。向每根离心管中的水相加入约400微升24:1氯仿-异戊醇混合液。通过反复吹打或颠倒混匀样品。然后在 12,000 g 离心 5 分钟，将约 300 微升上层水相转移至预冷并标记好的离心管中。接着加入 300 微升预冷的异丙醇和 12 微升 2.5 摩尔的醋酸钠。然后将离心管置于 -20 摄氏度孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，从冷冻机中取出样品。随后，在室温下以12,000 g离心15分钟。离心后，用约300至500微升70%乙醇洗涤沉淀。再次以 12,000 g 离心 10 分钟。然后小心移去上清液，注意不要扰动沉淀。接着将沉淀在空气中干燥，并将 DNA 溶解于 50 µL 的 1× Tris-EDTA 缓冲液中。在0.2毫升的聚合酶链式反应管中加入1至16微升的分离DNA和2微升的片段化反应缓冲液。用无核酸酶水将终体积调至18微升。接着，加入2微升双链DNA片段化酶，短暂涡旋混匀约三秒钟。然后将样品在37摄氏度下于热循环仪中孵育8.5分钟。孵育结束后，向各管中加入5微升0.5摩尔的EDTA。加入25微升无核酸酶水，以调节剪切后的DNA总体积至50微升。然后将45 µL室温保存的SPRI磁珠加入50 µL打断的DNA中，通过上下吹打充分混匀。将含有样品的管子静置5分钟。随后将管子转移至磁力架上，再静置5分钟。小心地吸出上清液。接着，向置于磁力架上的各管中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇，在室温下静置 30 秒。30 秒后，小心地移除上清液。将管盖打开，在磁力架上让磁珠晾干5分钟。然后从磁力架上取下离心管，用55 µL 0.1X Tris-EDTA缓冲液将DNA从磁珠上洗脱下来。通过反复吹打充分混匀DNA。然后在室温下孵育样品5分钟。再次将离心管置于磁力架上，静置约2分钟，直至溶液澄清。移除52 µL上清液，然后按照文本方案中所述进行DNA定量分析。向50微升经纯化和剪切的DNA中加入3微升内切酶、磷酸化尾端酶以及7微升反应缓冲液。通过反复吹打充分混匀DNA与其他组分。然后离心管子以去除气泡。离心后，将样品转移至PCR仪并设置程序。将接头稀释25至50倍，以获得0.6至0.3微摩尔的工作浓度。对于高通量短读长测序，向各管中加入30微升连接反应主混合液、1微升连接增强剂和2.5微升接头。用移液器上下吹打，充分混匀管内溶液。再次离心管子以去除所有气泡。然后在20摄氏度下孵育15分钟。向各管中加入 3 µL 商业化的尿嘧啶-DNA 糖基化酶与 DNA 糖基化酶-裂解酶内切核酸酶 VIII 混合液。将总体积调整至 96.5 µL。充分混匀各组分，并在热循环仪中于 37 °C 孵育 15 分钟。在离心管中，通过将所有试剂加入已纯化并连接接头的DNA中来配制聚合酶链式反应混合液。然后通过涡旋充分混匀反应体系。涡旋结束后，立即将样品放入热循环仪中，并启动热循环扩增程序。向样品中加入约 25 µL 室温保存的磁珠，通过反复吹打混匀。将样品孵育 5 分钟。然后将试管转移至磁力架上，再静置 5 分钟。五分钟后，将上清液转移至一组新的已标记离心管中。接着，向上清液中加入六微升室温保存的 SPRI 磁珠，并充分混匀。样品孵育五分钟后，将离心管置于磁力架上，再静置五分钟。移除并弃去上清液。然后向置于磁力架上的各管中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇。接着，在室温下孵育 30 秒。30 秒后，小心移除上清液，并将管盖打开，让磁珠在磁力架上空气中干燥 5 分钟。现在将离心管从磁力架上取下。用 33 µL 的 0.1X Tris-EDTA 缓冲液洗脱磁珠上的目标 DNA，并充分混匀。充分混匀后，室温孵育5分钟。然后将离心管转移至磁力架上，静置约2分钟，直至溶液变澄清。用移液器吸取30 µL上清液至2 mL离心管中用于储存。为了展示标本馆DNA的提取效果，使用从不同标本馆标本中分离出的双链DNA进行琼脂糖凝胶电泳。采用10毫克叶片组织，将分离得到的约3.56至2,610纳克双链DNA上样至琼脂糖凝胶。凝胶结果显示，所有泳道中的标本馆DNA均呈拖尾弥散状，表明其已发生降解。接下来，为了展示从10份腊叶标本DNA中回收高质量测序文库的效果，进行了琼脂糖凝胶电泳。在上样至琼脂糖凝胶前，将约1.26至464纳克的腊叶标本DNA进行酶法片段化，并用90%磁珠体积进行纯化。琼脂糖凝胶结果显示，从10份腊叶标本DNA中均成功回收了高质量的测序文库。最终的测序文库在300至500个碱基对之间显示出一条主条带。为了展示来自标本馆材料DNA的鸟枪法测序结果，获得了TK 686叶绿体基因组的环形图谱。该序列显示了DNA的总长度、反向重复区域以及大片段和小片段单拷贝区域的存在。一旦掌握，该技术可在不到13小时内完成24个样本的实验，其中实际操作时间仅约8小时。在该步骤完成后，可对所得文库进行其他方法（如序列捕获）以生成用于系统发育研究的核基因数据。

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科研

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Genetics

遗传学

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