植物标本标本的鲁棒 DNA 分离与高通量测序库建设

该方案的总体目标是增加从植物标本中分离的双链 DNA 和随后的高通量测序文库的数量，最大限度地提高它们在系统发育研究中的实用性。这种方法释放了植物标本的潜力，否则由于广泛的样品降解，这些标本对于基因组序列的测序项目没有用。这种技术的主要优点是它足够坚固，可以使用稀有且具有历史意义的植物标本，而无需进行广泛的破坏性采样。

该技术扩展了系统间隔项目中分类单元采样的深度。物种采集是一个限制步骤，但通过此协议，历史收藏可以很容易地用于这些研究。加入液氮和 30 至 50 毫克消毒沙子，在预冷的研钵和研杵中将一厘米见方的预选植物标本组织研磨成细粉。

充分研磨对于成功分离 DNA 至关重要。并且应注意将样品完全粉碎。接下来，将冷冻粉末添加到两个 2 毫升的试管中，填充不超过试管体积的一半。

然后向每个试管中加入 600 微升温热的 CTAB 溶液。通过倒置和涡旋彻底混合粉末。然后将样品在 65 摄氏度的水浴中孵育 1 至 1.5 小时。

同时，每 15 分钟涡旋一次。然后在室温下以 10， 000 g 离心样品 5 分钟。离心后，将大约 500 μL 的上清液转移到一组新的、新鲜的标记管中。

向上清液中，向每团调理中加入 4 微升每毫升 10 毫克的 RNase A。然后通过倒置或移液混合试管的内容物。将样品置于 37 °C 的加热块或水浴中孵育 15 分钟。

试管达到室温后，向样品中加入大约 500 μL 的 25：24：1 苯酚、氯仿、异戊醇混合物。然后通过倒置或重复移液混合试管的内容物。然后将样品在室温下以 12， 000 g 离心 15 分钟。

将大约 400 μL 的上层水层转移到一组新标记的试管中。向每个试管中的水层中加入大约 400 μL 的 24：1 氯仿、异戊醇混合物。通过重复移液或倒置充分混合样品。

然后将试管以 12， 000 g 离心 5 分钟，并将大约 300 μL 的上层水层转移到预冷的标记试管中。接下来，加入 300 微升预冷的异丙醇和 12 微升 2.5 摩尔乙酸钠。然后将试管在零下 20 摄氏度下孵育 30 到 60 分钟。

孵育后，从冰箱中取出样品。接下来，在室温下以 12， 000 g 离心样品 15 分钟。离心后，用大约 300 至 500 微升 70% 乙醇洗涤沉淀。

同样，将试管以 12， 000 g 离心 10 分钟。然后在不干扰沉淀的情况下，小心地去除上清液。接下来，风干沉淀，并将 DNA 溶解在 50 μL 1X Tris-EDTA 缓冲液中。

在 0.2 mL 聚合酶链反应管中加入 1 至 16 μL 分离的 DNA 和 2 μL 的片段化反应缓冲液。用无核酸酶的水将最终体积调整至 18 微升。接下来，加入 2 μL 双链 DNA 片段化酶，并将混合物短暂涡旋几秒钟。

然后将样品在 37 摄氏度下在热循环仪中孵育 8.5 分钟。孵育后，向试管中加入 5 微升 0.5 摩尔 EDTA。加入 25 μL 无核酸酶的水，将剪切的 DNA 总体积调节至 50 μL。

然后将 45 微升维持在室温下的 SPRI 珠子添加到 50 微升剪切的 DNA 中，并通过上下移液将两者充分混合。将装有试管的样品放置 5 分钟。然后将试管转移到磁板上，再等待 5 分钟。

小心排出上清液。接下来，将 200 微升新鲜的 80% 乙醇添加到磁力架上的试管中，并在室温下再等待 30 秒。30 秒后，小心去除上清液。

打开试管盖，在磁力架上风干磁珠 5 分钟。然后从磁架上取下试管，在 55 μL 0.1X Tris-EDTA 缓冲液中洗脱磁珠上的 DNA。通过重复移液彻底混合 DNA。

然后将样品在室温下孵育 5 分钟。同样，将试管放在磁力架上，等待溶液在大约 2 分钟内澄清。去除 52 μL 上清液，然后按照文本方案中的概述进行 DNA 定量分析。

向 50 μL 清洁和剪切的 DNA 中，加入 3 μL 核酸内切酶、磷酸盐拖尾酶和 7 μL 反应缓冲液。通过上下吹打彻底混合 DNA 和其他组分。然后旋转试管以去除气泡。

旋转后，将样品转移到热循环仪并设置程序。将接头稀释 25 至 50 倍，以达到 0.6 至 0.3 微摩尔的工作浓度。对于高通量短读长测序，向试管中加入 30 μL 连接预混液、1 μL 连接增强剂和 2.5 μL 接头蛋白。

通过上下移液彻底混合试管的内容物。再次旋转试管以去除任何气泡。然后将试管在 20 摄氏度下孵育 15 分钟。

向试管中加入 3 微升尿嘧啶-DNA 糖基化酶和 DNA 糖基化酶裂解酶核酸内切酶 VIII 的商业混合物。将总体积调整为 96.5 微升。充分混合组分，并在 37 摄氏度下在热循环仪中孵育 15 分钟。

在试管中，将所有试剂添加到清洁的接头蛋白连接的 DNA 中，制备聚合酶链式反应混合物。然后涡旋将反应充分混合。涡旋结束后，将样品放入热循环仪中并开始热循环仪扩增设置。

向样品中加入约 25 μL 保持在室温下的磁珠，并通过重复移液混合。将样品孵育 5 分钟。然后将试管转移到磁力架上，再等待 5 分钟。

5 分钟后，将上清液去除到一组新的标记试管中。接下来，向上清液中加入 6 微升保持室温的 SPRI 珠子并充分混合。孵育样品 5 分钟后，将试管转移到磁板上，再等待 5 分钟。

取出并丢弃上清液。然后将 200 微升新鲜的 80% 乙醇添加到磁力架上的试管中。接下来，将试管在室温下孵育 30 秒。

30 秒后，小心地取出上清液，打开试管盖，将磁珠风干 5 分钟，同时仍然放在磁力架上。现在从磁铁上取下管子。将磁珠中的靶标 DNA 洗脱到 33 μL 0.1X Tris-EDTA 缓冲液中，并充分混合。

适当混合后，在室温下孵育 5 分钟。然后将试管转移到磁力架上，等待约 2 分钟，直到溶液变清。将 30 微升上清液移液到 2 毫升试管中储存。

为了显示植物标本 DNA 的分离，用从不同植物标本中分离的双链 DNA 运行琼脂糖凝胶。使用 10 毫克叶组织，几乎 3.56 比 2，将分离的 610 ng 双链 DNA 加载到琼脂糖凝胶上。凝胶在所有泳道中以弥散形式显示降解的植物标本 DNA。

接下来，为了显示从 10 个植物标本中分离的 DNA 中回收高质量的测序文库，运行琼脂糖凝胶。在上样到琼脂糖凝胶上之前，对大约 1.26 至 464 ng 分离的植物标本 DNA 进行酶促剪切，并用 90% 的珠子体积进行纯化。琼脂糖凝胶显示从 10 个植物标本的 DNA 中回收了高质量的测序文库。

最终测序文库显示 300 至 500 个碱基对之间的一条带。然后显示植物标本来源的 DNA 的鸟枪序列，获得了 TK 686 叶绿体基因组的圆图。该序列显示了 DNA 的总长度、倒置的重复区域以及大大小小的单拷贝区域的存在。

一旦掌握，该技术可以在不到 13 小时的时间内对 24 个样品进行，只需大约 8 小时的主动动手作时间。在此程序之后，可以对所得文库执行其他方法，例如序列捕获，以生成用于系统发育研究的核数据。