植物标本DNA高效提取及高通量测序文库构建

本实验方案的总体目标是提高从腊叶标本中分离出的双链DNA数量及其后续高通量测序文库的产量，从而最大化其在系统发育基因组学研究中的应用价值。该方法能够释放那些因样本严重降解而原本无法用于基因组测序项目的腊叶标本的潜在用途。该技术的主要优势在于其具有足够的稳健性，可利用稀有且具有重要历史意义的腊叶标本，而无需进行大规模的破坏性取样。

该技术可扩展系统发育取样项目中的分类群取样深度。物种获取是一个限制性步骤，但通过本方案，可方便地将历史馆藏材料用于这些研究。在预冷的研钵中加入液氮和30至50毫克灭菌沙子，用于研磨预先选定的一平方厘米腊叶标本组织，直至形成细粉。

充分研磨对于成功分离DNA至关重要。应注意确保样品被完全粉碎。接下来，将冷冻粉末加入两支2毫升离心管中，填充量不得超过管体积的一半。

然后向每个管中加入 600 µL 温热的 CTAB 溶液。通过颠倒和涡旋充分混匀粉末。随后将样品置于保持在 65 °C 的水浴中孵育 1 至 1.5 小时。

在此期间，每15分钟涡旋一次。然后在室温下以10,000 g离心5分钟。离心后，将约500微升上清液转移至一组新的、已标记的干净离心管中。

向每管上清液中加入 4 µL 浓度为 10 毫克/毫升的 RNase A。然后通过倒置或移液混匀管内溶液。将样品置于保持在 37 °C 的加热块或水浴中孵育 15 分钟。

待离心管恢复至室温后，向样品中加入约 500 µL 的 25:24:1 酚-氯仿-异戊醇混合液。通过反复倒置或移液混匀管内溶液。然后在室温下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。

将上层水相（约400微升）转移至一组新的已标记离心管中。向每根离心管中的水相加入约400微升24:1氯仿-异戊醇混合液。通过反复吹打或颠倒混匀样品。

然后在 12,000 g 离心 5 分钟，将约 300 微升上层水相转移至预冷并标记好的离心管中。接着加入 300 微升预冷的异丙醇和 12 微升 2.5 摩尔的醋酸钠。然后将离心管置于 -20 摄氏度孵育 30 至 60 分钟。

孵育结束后，从冷冻机中取出样品。随后，在室温下以12,000 g离心15分钟。离心后，用约300至500微升70%乙醇洗涤沉淀。

再次以 12,000 g 离心 10 分钟。然后小心移去上清液，注意不要扰动沉淀。接着将沉淀在空气中干燥，并将 DNA 溶解于 50 µL 的 1× Tris-EDTA 缓冲液中。

在0.2毫升的聚合酶链式反应管中加入1至16微升的分离DNA和2微升的片段化反应缓冲液。用无核酸酶水将终体积调至18微升。接着，加入2微升双链DNA片段化酶，短暂涡旋混匀约三秒钟。

然后将样品在37摄氏度下于热循环仪中孵育8.5分钟。孵育结束后，向各管中加入5微升0.5摩尔的EDTA。加入25微升无核酸酶水，以调节剪切后的DNA总体积至50微升。

然后将45 µL室温保存的SPRI磁珠加入50 µL打断的DNA中，通过上下吹打充分混匀。将含有样品的管子静置5分钟。随后将管子转移至磁力架上，再静置5分钟。

小心地吸出上清液。接着，向置于磁力架上的各管中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇，在室温下静置 30 秒。30 秒后，小心地移除上清液。

将管盖打开，在磁力架上让磁珠晾干5分钟。然后从磁力架上取下离心管，用55 µL 0.1X Tris-EDTA缓冲液将DNA从磁珠上洗脱下来。通过反复吹打充分混匀DNA。

然后在室温下孵育样品5分钟。再次将离心管置于磁力架上，静置约2分钟，直至溶液澄清。移除52 µL上清液，然后按照文本方案中所述进行DNA定量分析。

向50微升经纯化和剪切的DNA中加入3微升内切酶、磷酸化尾端酶以及7微升反应缓冲液。通过反复吹打充分混匀DNA与其他组分。然后离心管子以去除气泡。

离心后，将样品转移至PCR仪并设置程序。将接头稀释25至50倍，以获得0.6至0.3微摩尔的工作浓度。对于高通量短读长测序，向各管中加入30微升连接反应主混合液、1微升连接增强剂和2.5微升接头。

用移液器上下吹打，充分混匀管内溶液。再次离心管子以去除所有气泡。然后在20摄氏度下孵育15分钟。

向各管中加入 3 µL 商业化的尿嘧啶-DNA 糖基化酶与 DNA 糖基化酶-裂解酶内切核酸酶 VIII 混合液。将总体积调整至 96.5 µL。充分混匀各组分，并在热循环仪中于 37 °C 孵育 15 分钟。

在离心管中，通过将所有试剂加入已纯化并连接接头的DNA中来配制聚合酶链式反应混合液。然后通过涡旋充分混匀反应体系。涡旋结束后，立即将样品放入热循环仪中，并启动热循环扩增程序。

向样品中加入约 25 µL 室温保存的磁珠，通过反复吹打混匀。将样品孵育 5 分钟。然后将试管转移至磁力架上，再静置 5 分钟。

五分钟后，将上清液转移至一组新的已标记离心管中。接着，向上清液中加入六微升室温保存的 SPRI 磁珠，并充分混匀。样品孵育五分钟后，将离心管置于磁力架上，再静置五分钟。

移除并弃去上清液。然后向置于磁力架上的各管中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇。接着，在室温下孵育 30 秒。

30 秒后，小心移除上清液，并将管盖打开，让磁珠在磁力架上空气中干燥 5 分钟。现在将离心管从磁力架上取下。用 33 µL 的 0.1X Tris-EDTA 缓冲液洗脱磁珠上的目标 DNA，并充分混匀。

充分混匀后，室温孵育5分钟。然后将离心管转移至磁力架上，静置约2分钟，直至溶液变澄清。用移液器吸取30 µL上清液至2 mL离心管中用于储存。

为了展示标本馆DNA的提取效果，使用从不同标本馆标本中分离出的双链DNA进行琼脂糖凝胶电泳。采用10毫克叶片组织，将分离得到的约3.56至2,610纳克双链DNA上样至琼脂糖凝胶。凝胶结果显示，所有泳道中的标本馆DNA均呈拖尾弥散状，表明其已发生降解。

接下来，为了展示从10份腊叶标本DNA中回收高质量测序文库的效果，进行了琼脂糖凝胶电泳。在上样至琼脂糖凝胶前，将约1.26至464纳克的腊叶标本DNA进行酶法片段化，并用90%磁珠体积进行纯化。琼脂糖凝胶结果显示，从10份腊叶标本DNA中均成功回收了高质量的测序文库。

最终的测序文库在300至500个碱基对之间显示出一条主条带。为了展示来自标本馆材料DNA的鸟枪法测序结果，获得了TK 686叶绿体基因组的环形图谱。该序列显示了DNA的总长度、反向重复区域以及大片段和小片段单拷贝区域的存在。

一旦掌握，该技术可在不到13小时内完成24个样本的实验，其中实际操作时间仅约8小时。在该步骤完成后，可对所得文库进行其他方法（如序列捕获）以生成用于系统发育研究的核基因数据。