植物细胞类型的分离与转录组分析

单细胞或特定细胞类型的转录组分析能够检测到因异质性而被掩盖的基因表达细微差异，是揭示复杂细胞内调控机制的有力工具。通过荧光激活细胞分选后接RNA测序（RN-seq）分析，可实现单细胞或大量细胞类型的高灵敏度转录本检测，并可与多种其他组学方法兼容。首次使用本实验方案的研究人员需特别注意原生质体分选和RNA-seq文库构建中的某些步骤。

除了 Jun Zhang 外，本实验室的博士后 Rongrong Xie 博士也将协助演示该实验步骤。首先，将拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型和荧光标记品系的种子放入 20% 次氯酸钠溶液中，在室温下使用旋转培养仪孵育 15 分钟，以对种子进行灭菌。在无菌操作台中操作时，用双蒸水将种子冲洗三至五次。

将野生型和报告基因品系的种子接种于含0.8%（重量/体积）琼脂的半浓度MS培养基上。在4摄氏度条件下对植物进行两天的分层处理，随后在23摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下垂直培养五天。

在实验前，将称为溶液A和溶液B的原生质体制备溶液置于冰上轻轻解冻。使用洁净的刀片或剪刀切下植物的根部，并将根切成约0.5厘米长的小段。将切碎的根浸入1.5毫升溶液B中，随后在室温下轻轻旋转孵育1.5至2小时。

将获得的根原生质体通过40微米孔径的滤网过滤，并用一至两毫升溶液A冲洗滤网。将滤液合并后，在4摄氏度下以300 × g离心五分钟。用移液器弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500至600微升溶液A中，并立即置于冰上。进行细胞分选时，将重悬的细胞溶液转移至一个新的5毫升试管中。

填充鞘液箱并检查废液箱。然后打开荧光激活细胞分选仪（FACS）设备。在分选仪上执行仪器设置和自动校准步骤。

选择荧光通道，并使用无荧光的野生型植株作为基线对照。根据荧光强度以及前向散射和侧向散射的单细胞信号调整分选门。向1.5毫升收集管中加入500 µL溶液A后，开始分选，每管收集2,000至3,000个细胞。

分选后，立即将样品置于冰上。在4°C条件下，以300 G离心含有细胞的收集管5分钟，然后用移液器吸除上清液。取2 µL分选后的细胞，使用荧光显微镜检测荧光。

若非立即使用，将分选后的细胞保存在负80摄氏度。进行单细胞索引分选时，将带膜的96孔板放入适配器中。校准板的位置，使液滴落入板的中心孔。

从96孔板中取出膜，并将96孔板放入适配器中。分选时选择单细胞分选模式，输入目标分选细胞数为1，然后开始分选。

实验开始前，使用表面去污剂和75%乙醇清洁实验台。所有设备仅用于测序文库制备。向分选后的样品中加入1 µL新配制的混合液A后，用无菌研杵充分研磨。

使用无 RNase 的水将体积补至 14 微升。然后将每个样品转移至 0.2 毫升薄壁 PCR 管中。接着配制混合液 B。向每管含有样品的 PCR 管中加入 4.4 微升混合液 B，并通过轻柔吹打混匀。

将样品在72摄氏度孵育三分钟。孵育后，立即将样品置于冰上，使寡聚dT与poly-A尾杂交。配制逆转录反应体系，即混合液C，每管样品中加入21.6 µL。

将样品在普通PCR仪中按照逆转录程序进行逆转录反应。向逆转录反应产物中加入40.8 µL freshly prepared预扩增反应混合液或混合液D，运行预扩增程序。当反应刚刚进入指数扩增阶段时，可通过定量PCR确定扩增循环数。

为了纯化预扩增反应产物，将预扩增产物从PCR管转移至1.5毫升离心管中。向每个样品中加入48微升AMPure XP磁珠，并通过移液轻轻混匀，然后进行孵育。将含有样品和磁珠的1.5毫升离心管置于磁力分离架上静置五分钟。

小心弃去样品的上清液，注意不要扰动磁珠。用200微升80%乙醇重悬磁珠后，将其置于磁力分离架上静置3分钟。弃去含乙醇的上清液后，将样品在离心管中室温干燥10分钟。

将磁珠重悬于20微升无核酸酶水中，室温孵育5分钟。然后将磁珠置于磁力分离架上5分钟。使用移液器将每管上清液中的18微升转移至新的1.5毫升离心管中。

最后，按照文中所述步骤对预文库进行表征，随后进行文库构建、纯化和定量。荧光拟南芥标记品系是通过将荧光蛋白与在特定靶细胞类型中表达的基因融合，或利用增强子捕获品系而构建的。根据荧光强度以及前向散射和侧向散射单细胞信号，成功分选出了带有荧光特异性标记的原生质体。

通过明场和荧光成像对分选后的细胞进行观察。展示了约 2,000 个木质部极中柱鞘细胞、侧根原基细胞、内皮层或皮层细胞以及侧根冠细胞的 RNA 测序文库的代表性结果。即使经过大小筛选，含有引物或接头二聚体峰的小片段文库仍可进行测序。

文库大小分布异常表明文库制备失败。对基因表达模式进行了分析。在四种根部细胞类型中任一种富集的基因被聚类，并在热图中展示，以显示不同细胞类型间基因表达的特异性。

通过正确的设门与分选以及防止RNA降解，获得高质量和高纯度的目标细胞，是成功构建文库的关键。在单细胞模式的RNA测序中，近年来已报道多种整合了唯一分子标识符（unique molecular identifier）的方法，显著提升了检测性能。