从成年斑马鱼中制备新鲜视网膜切片用于前体成像实验

影像视网膜组织可以提供无法从传统生化方法收集的单细胞信息。该协议描述了从斑马鱼的视网膜切片的制备共焦成像。荧光基因编码的传感器或指示染料允许可视化许多生物学过程中的不同的视网膜细胞类型。

该程序的总体目标是为需要荧光蛋白或生物传感器实时成像的实验准备新鲜的斑马鱼视网膜切片。这种方法可以帮助回答视觉研究领域的关键问题，例如钙离子在视网膜内特定细胞类型和细胞区室中的生理和代谢作用。该技术的主要优点是它提供有关活组织中关键代谢物和信号分子的空间和时间信息。

为了能够从斑马鱼中去除视网膜色素上皮或 RPE，在制作组织切片之前将鱼暗适应一小时。对于切片室，在载玻片上涂上指甲油线。使用透明指甲油，画出窄线以创建一个矩形。

干燥后重新涂上指甲油一次。如果腔室将用于静态成像或溶液流量最小的注射实验，则使用注射器将两条平行的凡士林条涂在盖玻片上，长 1 厘米，相距 0.5 厘米。现在准备刀片。

首先，用乙醇清洁双刃剃须刀并风干。然后用剪刀将其剪成大约一厘米的小块。接下来，将切片室放在组织切片机的载物台上，在载物台上水平居中，并用永久性记号笔标记长边以对齐。

然后，将一块刀片装到切片机臂上。固定刀片，使边缘位于滑轨中间并与滑轨表面平行，但不要接触指甲油。然后旋转四分之一圈降低刀臂。

现在，尝试切片滤纸。如果需要，请重新安装 Blade。要继续，使用注射器将一小点果冻沉积在一个 10 厘米的培养皿中，距离中点约 1.5 厘米。

然后用镊子将盖玻片的干燥面压入果冻中。接下来，在距离成像室入口边缘约 1 厘米的地方放另一小点果冻。现在，用一根 20 号针头沿着切片室的中心纵向制作两条一厘米长的平行薄凡士林条，相距约 1 厘米。

然后将斑马鱼转移到盘子中，用宫颈脱臼，不要斩首。现在，使用钢丝环松开一只眼睛周围的结缔组织，然后轻轻地将眼睛向前拉。接下来，用微型剪刀小心地剪开眼睛下方的白色视神经，但不要剪伤眼睛的后部。

接下来，将眼睛转移到一盘冰上的冷林格氏液上。然后收获另一只眼睛。继续在红灯下工作，直到所有 RPE 都被移除。

接下来，将一只眼睛转移到培养皿上的载玻片上的一滴冷林格溶液中。然后将培养皿置于低倍解剖显微镜下，在红光下解剖眼罩。首先，用细镊子刺穿角膜。

接下来，使用镊子和剪刀轻轻去除透明、易碎的角膜和银色巩膜。然后取下并丢弃晶状体和大部分牙膜以隔离眼罩。只需最少的处理即可去除任何残留在眼罩上的脂肪和巩膜，而无需去除视网膜。

如果视网膜与 RPE 分离，请格外小心，以免损坏脆弱的视网膜。现在，重新定位眼罩，开口面朝下，并用新刀片将其切成三分或四分之一。丢弃太弯曲而无法变平的眼罩碎片。

这些碎片通常太小，在任何情况下都无法使用。要安装视网膜切片，请用林格溶液润湿一张滤纸，然后使用扁平镊子将其放在眼罩片旁边。然后将滤纸和纸巾浸入冷的林格氏液中。

接下来，使用镊子将视网膜片定位在滤纸顶部，同时 RPE 和感光器向上。用细镊子轻轻处理眼杯片的边缘，使它们在滤纸中心形成一条线。现在用镊子提起附有视网膜的滤纸并将其放在干纸巾上，使视网膜变平。

大约三秒钟，让液体吸入纸巾的力量使视网膜变平。以这种方式处理所有视网膜碎片，不要让它们变干。现在，滴一滴林格氏液，用细镊子从组织中剥去任何残留的黑色 RPE 片。

轻轻剥离，如果视网膜从纸上掀起，像以前一样吸走更多的溶液，它应该会再次变平。现在将带有视网膜片的纸张转移到载玻片上，并将纸张修剪成一个矩形，在组织行的两侧留下约 0.5 厘米。然后，将滤纸移至准备好的切片室中。

使用镊子将长滤纸边缘推入薄凡士林格液线中，然后将视网膜浸入三到四滴冷林格氏液中。首先，将制剂转移到组织切片机阶段。沿标记线放置长边，并用实验室胶带将腔室末端固定到载物台上。

然后，从一端开始，用力、轻柔地按压切片臂，切割视网膜和滤纸。检查第一片是否被完全切割，然后继续使用千分尺切割大约 400 微米厚的切片。接下来，将带有切片切片的腔室转移到装有准备好的盖玻片的培养皿中，该盖玻片将用作成像梯。

用冷的林格溶液淹没培养皿，然后将其放在解剖显微镜的载物台上。现在，在低放大倍率下，使用镊子固定条带，并通过滑动下面的培养皿将其移动到成像梯上。将切片旋转 90 度，将滤纸边缘埋入果冻中。

保持视网膜浸没并避免与视网膜直接接触很重要。接下来，在梯子中重新定位切片，以便清晰可见 Retina 图层。对于梯子两端的切片，使视网膜朝内朝向其他切片，以尽量减少注射或流动过程中的运动。

丢弃任何不能很好地粘附在纸张上的切片。现在，给组织染色。同时，准备成像室和注射装置。

首先，用 Ringer 溶液冲洗管路，直到没有气泡残留。然后，将管路连接到成像室入口并关闭旋塞。然后，用注射溶液重新填充注射器并将其重新连接到管道上。

现在，使用镊子将准备好的成像梯子转移到成像室中。将其压入入口边缘附近的果冻点中，并用 Ringer 溶液填充腔室以覆盖切片。然后继续进行成像。

使用所描述的技术，可以通过所有视网膜层对完美的横向切片进行成像。稍微旋转时，外部线段的束将可见。使用 PI 染色，可以从分析中去除死细胞。

健康的 PI 阴性光感受器具有刻板型极化细长形态。当在含氧林格氏症中时，它们可以成像长达 4 小时。一种成像策略是可视化视锥光感受器内质网相对于细胞核的动力学。

使用表达 GFP 的组织和锥体 ER，同时用核染料复染。可以采用类似的策略来观察具有表达 GFP 融合肌动蛋白的组织肌动蛋白细胞骨架。使用延时成像，可以观察到细胞动力学，例如视锥光感受器中的胞质钙波动。

例如，在成像室中等张力消耗钠时，GCaMP 可用于可视化不断升高的胞质钙浓度。通过量化来自单个视锥外段、细胞体和突触的荧光反应，可以确定药理学作等过程中的细胞内钙动力学。在尝试此过程时，请务必记住在移除 RPE 之前使用红灯。

切片前小心地压平眼罩，并始终将切片浸没在水中。掌握后，组织解剖、切片和成像准备可以在不到 30 分钟的时间内完成。看完这个视频，你应该对如何制备斑马鱼的视网膜切片有一个很好的了解，以研究细胞区室中特定细胞类型的代谢和生理学。