制备成年斑马鱼新鲜视网膜切片用于 离体 成像实验

本实验的主要目标是制备可用于活体成像荧光蛋白或生物传感器实验的斑马鱼视网膜新鲜切片。该方法有助于回答视觉研究领域中的一些关键问题，例如钙离子在视网膜特定细胞类型及细胞区室中的生理与代谢作用。该技术的主要优势在于，能够在活体组织中提供有关关键代谢物和信号分子的空间与时间动态信息。

为了能够从斑马鱼中去除视网膜色素上皮（RPE），在制备组织切片前，需将鱼置于黑暗环境中适应一小时。对于切片用的载玻片，在其表面用指甲油画线。使用透明指甲油，绘制细线以形成一个矩形。

干燥后重新涂抹一次封片剂。如果该培养皿将用于静态成像，或进行溶液流动极少的注射实验，则使用注射器在盖玻片上涂抹两条平行的凡士林条带，每条长一厘米，间隔0.5厘米。现在准备刀片。

首先，用乙醇清洁双面剃须刀片，并使其自然晾干。然后使用剪刀将其剪成约一厘米长的小段。接下来，将切片室放置在组织切片机的载物台上，水平居中放置，并用永久性记号笔在长边上做标记以用于对齐。

然后，将一片刀片安装到切片机臂上。固定刀片，使刀刃位于载玻片中央上方，并与载玻片表面平行，但不接触指甲油。接着，将刀片臂向下旋转四分之一圈。

现在，尝试切割滤纸。如有需要，重新安装刀片。接下来，用注射器在直径10厘米的培养皿中距离中点约1.5厘米处，滴加一个微小的果冻点。

然后用镊子将盖玻片干燥的一面压入琼脂糖凝胶中。接着，在成像室入口边缘约一厘米处再放置一小滴琼脂糖凝胶。现在，使用20号针头在切片室中央沿纵向涂抹两条长约一厘米、相距约一厘米的细长平行石蜡油条带。

然后将斑马鱼转移至培养皿中，进行颈椎脱位处死，但不切除头部。接着，使用金属环松解眼球周围的结缔组织，轻柔地将眼球向前拉出。随后，用显微剪刀小心剪断眼球下方的白色视神经，但不要剪到眼球后部。

接下来，将眼睛转移至盛有冰冷林格液的培养皿中，置于冰上。随后摘取另一只眼睛。在去除全部视网膜色素上皮（RPE）之前，持续在红光下操作。

接下来，将一只眼睛转移至培养皿中玻璃载片上的一滴冷林格氏液中。然后将培养皿置于低倍解剖显微镜下，在红光条件下解剖眼杯。首先，用精细镊子刺穿角膜。

接下来，使用镊子和剪刀轻轻去除透明脆性的角膜和银色的巩膜组织。然后移除并丢弃晶状体以及大部分巩膜，以分离出眼杯。在尽量减少操作的前提下，去除仍附着在眼杯上的脂肪和巩膜残余组织，但不得损伤视网膜。

如果视网膜与视网膜色素上皮层（RPE）发生分离，则需格外小心操作，以避免损伤脆弱的视网膜。现在，将眼球杯状结构开口朝下重新放置，并使用新刀片将其切成三份或四份。丢弃那些曲度过大而无法展平的眼球杯碎片。

这些碎片通常过小而无法在任何情况下使用。用任氏液润湿一片滤纸，用平头镊子将其放置在眼杯碎片旁边，以固定视网膜切片。然后将滤纸和组织浸入冷的任氏液中。

接下来，使用镊子将视网膜组织块放置在滤纸表面，使视网膜色素上皮（RPE）和光感受器朝上。用精细镊子轻轻夹取眼杯组织块的边缘，将其调整方向，排列成一条直线并置于滤纸中央。然后，用镊子夹起附有视网膜的滤纸，将其放置在干燥的纸巾上，以压平视网膜组织。

让液体被纸巾吸走的力量持续约三秒钟，以压平视网膜。以这种方式处理所有视网膜组织块，但注意不要使其干燥。现在，滴加一滴林格氏液，并用精细镊子剥离组织上残留的任何黑色RPE层。

轻轻剥离，如果视网膜从纸片上翘起，可再次用滤纸吸去多余溶液，视网膜应会重新展平。现在将带有视网膜组织片的纸片转移至载玻片上，并将纸片修剪成矩形，使组织排布的每一侧保留约 0.5 厘米的纸边。随后，将滤纸转移至已准备好的切片室中。

用镊子将长条滤纸的边缘压入薄层凡士林线条中，然后将视网膜浸入三到四滴冰冷的林格氏液中。首先，将制备好的样品转移至组织切片机载物台上。将长边对准标记线，并用实验室胶带将腔室两端固定在载物台上。

然后，从一端开始，用切片臂以稳定而轻柔的压力切割视网膜和滤纸。检查第一片是否已完全切开，随后使用千分尺继续切出约 400 微米厚的切片。接下来，将含有切片的样本室转移至装有已准备好的盖玻片的培养皿中，该盖玻片将作为成像的梯度支架。

用冷的任氏液充满培养皿，并将其置于解剖显微镜的载物台上。在低倍镜下，用镊子夹住一条组织，通过滑动下方的培养皿将其移至成像支架上。将切片旋转90度，并将滤纸边缘埋入琼脂中。

保持视网膜浸没并避免直接接触视网膜非常重要。接下来，重新调整切片在梯架上的位置，使视网膜各层清晰可见。对于梯架两端的切片，应使视网膜朝向内侧，朝向其他切片，以尽量减少注射或液体流动过程中的移动。

弃去与纸张贴合不良的任何切片。现在对组织进行染色。同时，准备成像室和注射装置。

首先，用林格氏液冲洗管路，直至无气泡残留。然后，将管路连接至成像室的入口并关闭旋塞阀。接着，用注射溶液重新填充注射器，并将其重新连接至管路。

现在，使用镊子将制备好的成像梯度转移至成像室中。将其压入进样口边缘附近的琼脂糖凝胶小滴内，并用任氏液填充成像室以浸没组织切片。随后进行成像操作。

利用所述技术，可对视网膜所有层次进行完全横断的切片成像。当切片轻微旋转时，可观察到外节束状结构。通过PI染色，可在分析中排除死细胞。

健康的PI阴性感光细胞具有典型的极化细长形态。在含氧林格液中，可对其进行长达四小时的成像观察。一种成像策略是可视化锥状感光细胞内质网相对于细胞核的动态变化。

利用表达GFP并具有视锥细胞外节的组织，同时使用核染料进行反染色。类似的方法可用于观察表达GFP融合肌动蛋白的组织中的肌动蛋白细胞骨架。通过延时成像，可观察视锥光感受器中细胞质钙离子波动等细胞动态过程。

例如，在成像室中等渗去除钠离子的同时，可利用 GCaMP 观察胞质内钙离子浓度的上升。通过定量单个视锥细胞外段、胞体和突触的荧光反应，可确定药理学干预等条件下的细胞内钙动力学变化。在进行该操作时，需注意在去除视网膜色素上皮（RPE）之前应使用红光。

切片前需仔细将眼杯压平，并始终保持切片完全浸没。一旦掌握技巧，组织解剖、切片及成像前处理可在30分钟内完成。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备斑马鱼视网膜切片，以研究特定细胞类型在细胞区室中的代谢与生理特性。