Name: 从成年斑马鱼中制备新鲜视网膜切片用于前体成像实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习从成年斑马鱼制备新鲜视网膜切片的方法，用于活细胞成像实验。该技术利用荧光生物传感器研究视网膜细胞中钙离子的生理与代谢作用，为视觉研究提供时空信息。

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在制定本方案期间，我们感谢Ralph Nelson和Daniel Possin提供的深思熟虑的指导，感谢Eva Ma、Ashley George和Gail Stanton在建立稳定转基因斑马鱼品系方面的工作。本研究工作得到了美国国家科学基金会研究生科研奖学金（NSF GRFP 2013158531）对M.G.的资助，美国国立卫生研究院眼科研究所（NIH NEI 5T32EY007031）对W.C.和M.G.的资助，以及EY026020对J.H.和S.B.的资助。

所有动物实验均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与仪器设备的准备
注意：视网膜色素上皮（RPE）是一层环绕视网膜外侧的深色组织，其色素可能在共聚焦成像时遮蔽视网膜结构特征，并造成组织损伤。 离体在黑暗环境中，斑马鱼的视网膜色素上皮（RPE）会从视网膜上回缩；将斑马鱼进行暗适应处理，有助于在切片和成像前更方便地去除视网膜上的RPE。
<ol>
	<li>将鱼转移到装有鱼水的产卵缸中，然后用深色织物包裹产卵缸，或将产卵缸置于暗柜中。
	<ol>
		<li>在实施安乐死后至少1小时前将斑马鱼置于黑暗环境中适应，以实现视网膜色素上皮（RPE）与视网膜近乎完全的分离。30分钟的暗适应足以去除大部分RPE，但仍有部分可能残留在感光细胞之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加热板上用50 mL烧杯融化约15 mL石蜡油，然后用3 mL无针头注射器吸取3 mL液体。将注射器倒置放入试管架中，让石蜡油冷却固化。</li>
	<li>在一块7 cm × 2.5 cm的普通载玻片上制作可重复使用的切片室。
	<ol>
		<li>使用透明指甲油在载玻片中央绘制细线，形成一个3 cm × 2.5 cm的矩形，待其干燥后，再在线条上添加一层指甲油。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在盖玻片上制备成像梯子以在成像过程中固定切片。切片将构成梯子的横档&#34;run&#34;。
	<ol>
		<li>对于静态成像或溶液流动较少的注射实验，可在18 mm方形玻璃盖玻片上制作由两条扁平且平行的宽条石蜡油组成的石蜡油梯子。使用注射器在盖玻片上相距约0.5 cm处，各涂抹一条长约~1 cm、已冷却的扁平石蜡油条。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备组织切片机。
	<ol>
		<li>用乙醇清洁双刃剃须刀片，晾干。用剪刀将其剪成四等份，先沿长度方向剪成两半，再横向剪断每半片刀片。</li>
		<li>将切片室放置在组织切片机的载物台上，水平居中，并用永久性记号笔标记长边以便对齐。</li>
		<li>将一片刀片安装到组织切片机的刀臂上，确保刀片平放且居中于载玻片上，不接触指甲油线条，然后轻轻拧紧刀具装置。通过旋转调节旋钮¼圈降低刀臂，随后在成像室中央放置一小片滤纸进行试切。若滤纸未被完全切断，则需重新安装刀片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用注射器在直径10 cm的培养皿中心右侧约1.5 cm处放置一个微小的冷却石蜡油点。用镊子将一个成像梯子压入该油点，使石蜡油面朝上。在成像室进液口边缘约1 cm处再制作一个微小的石蜡油点。</li>
	<li>将20号针头安装到石蜡油注射器上并取下针帽。手持针头连接注射器，在切片室中央纵向挤出两条长约1 cm、细而平行的石蜡油条，两条间距约1 cm。</li>
	<li>通过将一段长约4 cm的30号钨丝中心紧密缠绕在一对闭合的镊子上一圈，制作可重复使用的金属眼环工具。通过上下滑动钨丝调节环的直径，使其略大于斑马鱼眼睛，通常约为2–3 mm。将钨丝两端拧紧，并用实验室胶带将其固定在一根6 cm长的木棒末端。</li>
	<li>配制任氏液（Ringer's solution）。
	<ol>
		<li>将50倍浓缩补充液（表1）解冻，并在实验当天早晨新鲜加入HEPES缓冲、不含碳酸氢盐的任氏液（表2）中；在锥形离心管或无菌玻璃瓶中，每10 mL任氏液加入200 µL补充液原液。对于静态成像实验，每次实验至少准备30 mL任氏液。灌流实验所需任氏液体积取决于流速和总实验时间。</li>
		<li>使用数字pH探针或pH试纸检测补充后溶液的pH值是否为7.4，并根据需要使用稀释的NaOH或HCl进行调节。</li>
		<li>将补充后的任氏液置于冰上，使用标准医用氧气瓶和配备软管的减压阀，或可选的灌流用气体鼓泡 manifold，通入100%氧气至少5分钟进行氧合。将氧合后的任氏液密封保存在冰上的锥形离心管或无菌玻璃瓶中，放置于解剖显微镜附近；该溶液用于解剖、成像，以及稀释染料或药理学试剂。</li>
		<li>若实验中使用其他溶液，例如无Na+任氏液（表3），请重复步骤1.9.1–1.9.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜附近准备好培养皿、镊子、显微剪刀及其他工具，并为斑马鱼安乐死准备鱼水冰浴。</li>
</ol>
2. 制备视网膜切片（见图1）
<ol>
	<li>在红光环境下操作，以尽量减少光适应（光适应会使视网膜色素上皮（RPE）更紧密地黏附于视网膜），将斑马鱼浸入冰浴中实施安乐死，直至失去触碰反应，通常需要1-2分钟。将鱼转移至培养皿中，用手术刀进行颈椎脱位，但不要切除头部。</li>
	<li>使用金属环松解眼球周围的结缔组织，一手持金属环轻轻将眼球向前牵拉。另一手持显微剪，在眼球下方剪断白色的视神经，注意不要剪到眼球后部。</li>
	<li>用镊子将眼球转移至盛有冰上冷Ringer液的培养皿中，对另一只眼重复相同操作。在从视网膜上移除RPE之前，始终保持眼球处于黑暗或红光条件下。</li>
	<li>在培养皿内的载玻片上滴加一滴冷Ringer液，于低倍解剖显微镜下解剖眼杯。
	<ol>
		<li>用精细镊子刺穿角膜，然后用镊子或剪刀小心移除透明脆性的角膜和银色的巩膜。移除并丢弃晶状体及大部分巩膜（见图1A），尽量减少对分离后眼杯的操作。</li>
		<li>脂肪组织碎片、少量巩膜以及黑色的RPE可暂时附着在眼杯上，后续再从视网膜上去除。若在步骤2.4.1中视网膜已与RPE分离，则继续执行相同步骤，但需格外小心，避免损伤脆弱的孤立视网膜。</li>
		<li>将眼杯开口朝下（RPE朝上）放置于载玻片上，用新的单刃剃刀一次性将其切成三或四等份（见图1B）。丢弃曲率过大的组织碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将视网膜平铺于滤纸上。
	<ol>
		<li>用Ringer液润湿一片滤纸，并将其置于载玻片上靠近眼杯碎片的位置。操作完整湿润的滤纸时应使用平头镊子，避免刺穿滤纸。加入冷Ringer液，使滤纸和组织均被液体覆盖。</li>
		<li>双手各持一把镊子，小心地将滤纸滑至每块眼杯碎片下方，使RPE和感光细胞朝上，即眼球背面朝上。i.e. 将眼杯碎片沿滤纸中央排成一行（见图1C）。仅用精细镊子夹持眼杯碎片的边缘或角落，轻柔操作。</li>
		<li>为帮助视网膜贴附于滤纸，将湿润滤纸短暂置于干燥纸巾上3秒，以向下吸除多余水分，但切勿使组织干燥。重复此操作，直至眼杯碎片平整贴附于滤纸上。对滤纸底面施加轻微负压有助于展平视网膜，但此步骤非必需。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若眼杯碎片上仍有黑色RPE片层残留，可在组织浸于Ringer液滴中的情况下，用精细镊子从一角开始轻轻剥离RPE（见图1D）。若视网膜从滤纸上抬起，应重复步骤2.5.3中的吸水操作。由于未漂白的视觉色素存在，视网膜可能呈现粉红色。</li>
	<li>如需处理第二只眼，可重复步骤2.4–2.6的视网膜解剖和平铺操作，同时将第一张已平铺的视网膜保持浸没于冷Ringer液中。为简化切片流程，可将两只眼的视网膜碎片置于同一张滤纸上。一旦RPE被完全去除，除非实验要求避光，否则后续操作可在正常室内光线下进行。</li>
	<li>将滤纸置于载玻片上，用单刃剃刀修剪成矩形，使视网膜排列线两侧各保留约0.5 cm滤纸。将滤纸转移至预置的切片槽中，用镊子将滤纸长边压入细条状石蜡油线内，并用3–4滴冷Ringer液浸没视网膜。 
	注：某些染料（如脂溶性染料）最好在此阶段、切片前加载至平铺样本中。染料可在此处加载，随后用纸巾吸除并用切片槽中的Ringer液清洗。例如，C12 558/568 BODIPY在室温（通常为23–27 °C）下以约5 µg/mL浓度孵育15分钟，可强烈标记视网膜细胞膜和感光细胞外节（见图4A），之后用过量Ringer液冲洗。</li>
	<li>将切片槽转移至组织切片机载物台上，使长边对准标记线，并用实验室胶带固定槽体两端。从一端开始，以稳定而轻柔的压力操作切片臂，切割视网膜和滤纸。检查首片是否完全切下，然后使用微米计切割约400 µm厚的切片。</li>
	<li>组装成像梯架。
	<ol>
		<li>将含有切片后视网膜组织的切片槽置于步骤1.7中的培养皿内，紧邻成像梯架（见图1E）。向培养皿中加入冷Ringer液，完全浸没其内容物。</li>
		<li>使用镊子并在切片保持浸没状态下，通过将培养皿从左向右滑动，轻柔地将滤纸条带及视网膜转移至梯架上。注意避免直接接触视网膜组织。将切片旋转90°，并将滤纸边缘埋入石蜡油中。</li>
		<li>用镊子精细调整梯架上视网膜切片的位置，使在解剖显微镜下可清晰观察到视网膜各层结构（见图1G）。对于梯架两端的切片，确保组织朝内面向其他切片，以减少注射或液体流动过程中组织的移动。丢弃任何未能良好贴附于滤纸上的视网膜切片（见图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需染色，可在成像前于此阶段向视网膜切片中加载染料，并用过量Ringer液冲洗。 
	注：Propidium iodide（PI）和Hoechst 33342可分别强烈标记死细胞和所有细胞的细胞核（见图2B），当以5 µg/mL浓度在室温下与视网膜切片共孵育20分钟时效果显著。Tetramethylrhodamine（TMRM）在1 nM浓度下室温孵育30分钟，可积聚于整个视网膜中活跃呼吸的线粒体内。</li>
	<li>在切片染色期间，准备成像室和注射装置。使用注射器用Ringer液冲洗管路并排除气泡，将管路开放端连接至成像室入口，并关闭旋塞阀。取下注射器，装入待注射试剂，再重新连接至管路。</li>
	<li>用镊子将带有视网膜切片的盖玻片转移至成像室，将其压入成像室入口边缘附近的石蜡油点中（见图1H）。向成像室中加入Ringer液，完全覆盖切片。</li>
</ol>
3. 视网膜切片成像
<ol>
	<li>将装满溶液的成像腔室连同连接的注射装置一起放置在直立式共聚焦显微镜的载物台上，显微镜需配备20倍或40倍水浸物镜。使用载物台夹固定成像腔室。</li>
	<li>将水浸物镜移至阶梯状样本上方，在透射光较弱的条件下对阶梯一端的切片进行聚焦。逐个检查切片的横断面方向、感光细胞外节段的存在情况以及切片与滤纸之间的牢固黏附性。</li>
	<li>选择最佳切片进行延时成像，并设置显微镜软件以进行延时图像采集。表4列出了针对不同荧光标记物和染料的典型成像参数。 
	注意：图像采集速率将根据所使用的显微镜、荧光标记物以及研究的生物学过程而有所不同。例如，在使用GCaMP3和红色染料成像感光细胞内钙动态时，可采用800×800像素分辨率、2 µs/像素扫描速度以及10秒的帧率。
	<ol>
		<li>如条件允许，可利用软件追踪切片中的物理标志结构（如感光细胞外节段、细胞体、细胞核），以辅助延时成像过程中的重新定位。同时设置软件以实时监测整个切片的荧光变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始成像并监测基线荧光信号。当切片整体荧光趋于稳定（通常在2–5分钟内）后，继续进行实验。进行注射时，打开注射器旋塞，然后缓慢推动并回抽活塞两次，以促进溶液混合。 
	注意：例如，可通过注射质子载体CCCP的浓缩溶液，使其在成像腔室中的终浓度达到1 µM，从而抑制线粒体功能。这将引发由GCaMP报告的感光细胞胞质中显著的Ca2+激增，随后出现由TMRM报告的线粒体膜电位持续下降。</li>
	<li>实验过程中密切监测切片是否发生漂移，并利用软件根据物理标志结构进行微调校正。通常在注射或灌流过程中，Z方向的漂移量小于&#60; 5 µm。</li>
</ol>
4. 在溶液更换或持续灌流的灌注实验期间对视网膜切片进行成像
注意：在进行灌注实验时对视网膜切片进行成像，其中溶液被更换或持续流动，其设置与静态成像或注射实验类似，但需进行以下修改。
<ol>
	<li>在步骤 1.4 中描述的凡士林梯架之外，可使用更坚固的石蜡梯架，以在溶液流动期间稳定固定视网膜切片。
	<ol>
		<li>在盖玻片上放置两条无味牙科蜡制成的小平行圆柱体，间距约为 0.5 cm。在平坦表面上，用拇指将每个圆柱体压平，并向盖玻片的平行边缘方向延展。使用 #1 盖玻片在两条压平的蜡条上横向划痕（见图 1E右侧），然后用刮刀在蜡条之间涂抹一层薄薄的凡士林。</li>
		<li>在步骤 2.10.2 组装成像梯架时，使用精细镊子将切好的滤纸边缘压入蜡条的划痕中（图 1G）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤 2.12 准备灌流系统时，将预充氧的溶液注入注射器储液罐，或使用可选的气体歧管对每个储液罐中的溶液进行氧合。用任氏液冲洗所有管路，确保所有管路在打开时均能顺畅流动，并排除大体积气泡。</li>
	<li>在步骤 2.13 填充成像室之前，使用注射器在盖玻片每个暴露的角落上方再点加一滴凡士林，以防止其在液体流动过程中发生侧向滑动。</li>
	<li>当成像室注满液体并安装在显微镜载物台上后，打开吸液装置并连接吸液管路。测试任氏液的流动情况，并使用微调装置将吸液管定位在流出室上方，使其在成像室溢出前缓慢吸走少量液体（通常在溶液液面上方约 1 mm 处，对应 2 mL/min 的流速）。在步骤 3.4 选择切片期间，保持任氏液持续流动。</li>
	<li>在步骤 3.4 进行灌流实验时，通过关闭第一种溶液的旋塞并同时打开第二种溶液的旋塞，切换溶液流动。
	<ol>
		<li>例如，为去除成像室中的细胞外 Na+，可使用两个分别装有任氏液或无 Na+ 溶液的注射器储液罐（表 3）。先用任氏液建立基线，然后切换至无 Na+ 溶液。此操作将导致感光细胞外段及胞体内的胞质 Ca2+ 显著升高（见图 4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于重力驱动的灌流系统，应监测每个储液罐中溶液的液面高度，以确保成像过程中流速恒定。根据需要补充充氧的溶液，或通过气体歧管持续通入氧气以维持氧合状态。</li>
</ol>

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<li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2%2B+Pools+in+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li>
<li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+by+vital+dyes+of+M%C3%BCller+glial+cells+in+retinal+wholemounts%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cytometry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

离体成像新鲜斑马鱼视网膜切片已被证明是研究光感受器生物学的一种多功能工具20,21,22，其独特之处在于能够在成熟且完全分化的视网膜中对单个细胞进行分析。经过练习后，即使使用来自同一视网膜区域的连续切片，也有可能利用单条鱼的组织开展多项实验。除了有关制备两栖动物视网膜切片用于电生理学研究的挑战与建议14外，成像实验还有一些重要的注意事项。
对于感光细胞而言，细胞存活率通常与细胞形态相关，因此在处理脆弱的视网膜时应尽量轻柔，尤其是在视网膜色素上皮（RPE）被去除后。切片完成后，应使用精细镊子将切片从切片室中水平轻轻滑出（图1F），以转移至梯状支架上，避免直接垂直提起切片；同时始终确保切片浸没在任氏液中。若条件允许，应将视网膜切片梯状支架组装在共聚焦显微镜附近，以尽量减少运输过...

斑马鱼（Danio rerio）因其体型小、发育迅速以及具有脊椎动物的器官系统，已在医学和基础科学研究中得到广泛应用1。斑马鱼幼体天然透明，结合成熟的转基因技术，使得在活体动物中对细胞过程进行精细观察成为可能。已有多种基因编码的荧光生物传感器被靶向定位至特定的斑马鱼细胞，用于检测 Ca2+ 2、过氧化氢3、凋亡激活4 和 ATP5。
体内成像技术在斑马鱼幼鱼中的应用推动了神经科学领域的突破，包括脑回路图谱的绘制6以及中枢神经系统疾病药物的研发7。斑马鱼非常适合视觉研究，因为其视网膜具有高等脊椎动物的层状结构和神经元类型，并表现出显著的视觉行为8,9。多种类似于人类疾病的视网膜变性已在斑马鱼中成功建模并开展研究10,11，包括对视网膜内单个感光细胞退化的活体成像2,12。
尽管 体内 幼鱼斑马鱼成像是一种有价值的工具，但随着鱼类的生长和色素沉积的发育，成像难度会增加，且某些药理学处理无法渗透到整个动物体内。此外，某些细胞过程会随着发育和年龄发生变化，使得后期时间点对于理解成年动物的功能及疾病进展至关重要。生化方法如免疫印迹、定量PCR、O2 消耗以及代谢组学分析可以为视网膜整体生物学特性提供重要线索，但难以区分疾病所影响的各类细胞类型的特异性贡献。对分离的视网膜组织进行成像 离体 绕过这些问题，而对平铺的视网膜进行成像可提供观察外层视网膜的视角13，更深层的内层视网膜结构被遮蔽。横向视网膜切片（如固定后免疫组织化学分析中所呈现的切片）能够清晰显示所有视网膜层和细胞类型，但仅能提供正常功能及疾病过程中动态变化的单一静态图像。
在此，我们介绍一种生成方法 离体 用于成像的成年斑马鱼视网膜横切片。该方法类似于用于电生理学和形态学研究的两栖动物和斑马鱼视网膜切片制备方法14,15，时间延时成像的重要改进方法 离体 使用共聚焦显微镜进行成像。在灌流给予药理学试剂的同时，利用共聚焦显微镜实时监测脑片中生物传感器或染料的荧光反应。尽管该方法最初是为成像感光细胞而开发，但若使用适当的荧光标记物，也可用于可视化穆勒细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞或视网膜神经节细胞。此外，可通过将脑片加载荧光性细胞膜通透染料，以报告细胞活力、囊泡运输、线粒体功能或氧化还原状态。这种多功能的制备方法可实现对视网膜中多种亚细胞过程的可视化观察，包括 Ca2+ 动态、信号转导和代谢状态。

<table><tbody><tr><td>斑马鱼</td><td>华盛顿大学南湖联盟水生生物设施</td><td></td><td>在本单位内维持为稳定的转基因品系</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>费舍尔科技公司</td><td>19-090-843</td><td>用于凡士林注射器</td></tr><tr><td>3 mL滑动式针头注射器</td><td>费舍尔科技公司</td><td>14-823-436</td><td>用于凡士林注射器</td></tr><tr><td>20号 3.8 cm滑动式针头</td><td>费舍尔科技公司</td><td>14-826-5B</td><td>用于凡士林注射器</td></tr><tr><td>普通 7 cm × 2.5 cm 显微镜载玻片</td><td>费舍尔科技公司</td><td>12-550-A3</td><td>用于眼球杯解剖、切片室</td></tr><tr><td>Seche Vite透明指甲油</td><td>亚马逊</td><td>B00150LT40</td><td>用于切片室</td></tr><tr><td>18 mm × 18 mm #1 玻璃盖玻片</td><td>费舍尔科技公司</td><td>12-542A</td><td>用于成像梯度</td></tr><tr><td>无味牙科蜡</td><td>亚马逊</td><td>B01K8WNL5A</td><td>用于成像梯度</td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>Stoelting公司</td><td>51427</td><td>用于组织切片</td></tr><tr><td>带数字千分尺的组织切片机</td><td>Stoelting公司</td><td>51415</td><td>用于组织切片</td></tr><tr><td>滤纸 — 白色网格混合纤维素，直径13 mm，孔径0.45 &amp;micro;m</td><td>EMD Millipore公司</td><td>HAWG01300</td><td>用于视网膜固定时的滤纸</td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>费舍尔科技公司</td><td>FB0875712</td><td>用于鱼类安乐死、解剖、成像梯度组装</td></tr><tr><td>15 cm平头木制涂药棒</td><td>费舍尔科技公司</td><td>23-400-112</td><td>用于制作金属丝眼环工具</td></tr><tr><td>30号（直径0.25 mm）钨丝</td><td>费舍尔科技公司</td><td>AA10408G6</td><td>用于制作金属丝眼环工具</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>G8270</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>L-乳酸钠</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>L7022</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>P2256</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>G3126</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;还原型L-谷胱甘肽</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>G4251</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>A5960</td><td>补充剂储备液的组分</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>S7653</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>KCl</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>P9333</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>C3881</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>S8282</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>M0250</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>H3375</td><td>Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>费舍尔科技公司</td><td>BP152</td><td>无Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>费舍尔科技公司</td><td>02-003-063</td><td>无Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>P5655</td><td>无Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Ringer溶液的组分</td></tr><tr><td>50 mL锥形离心管</td><td>Denville科技公司</td><td>C1062-P</td><td>Ringer溶液的容器</td></tr><tr><td>Vannas剪刀 — 8 cm，斜角5 mm刀片</td><td>世界精密仪器公司</td><td>501790</td><td>用于眼球杯解剖的微型剪刀</td></tr><tr><td>瑞士镊子 — #5，11 cm，直头，尖端0.06 × 0.07 mm</td><td>世界精密仪器公司</td><td>504510</td><td>用于眼球杯解剖和切片操作的精细镊子</td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>费舍尔科技公司</td><td>12-640</td><td>用于眼球杯解剖和修剪滤纸</td></tr><tr><td>EMD Millipore滤纸镊</td><td>费舍尔科技公司</td><td>XX6200006P</td><td>用于操作湿润滤纸的平头镊子</td></tr><tr><td>C&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt; 558/568 BODIPY</td><td>费舍尔科技公司</td><td>D3835</td><td>标记活细胞核；室温下孵育5 &amp;micro;g/mL，持续15分钟</td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>P3566</td><td>标记死细胞核；室温下孵育5 &amp;micro;g/mL，持续20分钟</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>费舍尔科技公司</td><td>62249</td><td>标记活细胞核；室温下孵育5 &amp;micro;g/mL，持续20分钟</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明甲酯（TMRM）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>T668</td><td>标记功能完整、带负电荷的线粒体；室温下孵育1 nM，持续30分钟</td></tr><tr><td>组织灌流室</td><td>Cell MicroControls公司</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td><td>用于注射或灌流的成像室</td></tr><tr><td>2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖（NBDG）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>N13195</td><td>荧光葡萄糖类似物，在安乐死前30分钟口服给予斑马鱼</td></tr><tr><td>奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>FV1000</td><td>用于在单细胞分辨率下观察切片的荧光信号</td></tr><tr><td>羰基氰-3-氯苯腙（CCCP）</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>C2759</td><td>实验试剂，可消除线粒体呼吸；处理切片至终浓度为1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>微型吸液器定位器</td><td>Cell MicroControls公司</td><td>FL-1</td><td>用于灌流</td></tr><tr><td>灌流多通管、气体鼓泡多通管、流量阀、60 cc注射器架</td><td>Warner Instruments公司</td><td>各种</td><td>用于灌流</td></tr></tbody></table>

制备成年斑马鱼新鲜视网膜切片用于 离体 成像实验

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

视网膜是一种复杂的组织，负责启动并整合视觉的最初步骤。视网膜细胞功能障碍是多种致盲性疾病的显著特征，而未来疗法的开发依赖于对不同类型视网膜细胞正常功能的基础性理解。由于特定细胞类型的贡献在视网膜细胞环境中被稀释，因此通过生化方法获取此类信息已被证明具有挑战性。得益于越来越多的基因编码荧光生物传感器，活体视网膜成像能够在亚细胞水平上观察多种生物学过程。然而，该技术迄今仅限于蝌蚪和斑马鱼幼体、离体视网膜的最外层，或在活体动物中进行较低分辨率的视网膜成像。本文介绍一种用于生成活体 离体 用于活体成像的成年斑马鱼视网膜切片，通过共聚焦显微镜进行观察。该制备方法可获得横断面切片，完整保留所有视网膜层及大多数细胞类型，适用于灌流条件下开展共聚焦成像实验。利用在特定视网膜细胞类型或细胞器中表达荧光蛋白或生物传感器的转基因斑马鱼，可从结构完整的视网膜中获取单细胞水平的信息。此外，还可将荧光指示剂染料加载至视网膜切片，进一步提升该方法的适用性。本方案最初开发用于Ca²⁺成像2+ 在斑马鱼的视锥光感受器内，但通过使用适当的标记物，该方法可被调整用于测量Ca2+ 或代谢物在穆勒细胞、双极细胞和水平细胞、小胶质细胞、无长突细胞或视网膜神经节细胞中的分布。由于视网膜色素上皮在切片过程中被去除，因此该方法不适用于研究此类细胞。经过练习，可从单只动物获取连续切片用于多个实验。这种可调整的技术为研究视网膜细胞生物学中的诸多问题提供了有力工具，Ca2+以及能量稳态。

切片的稳定定位和横向方位对于成功进行药物注射或灌注成像至关重要。在共聚焦成像前，应仔细检查并根据需要重新调整切片位置，以确保所有视网膜层均清晰可见（图2A，切片ii）。若切片轻微向前旋转（图2A，切片iii），则可观察到外节束，此时可用镊子进行微调，使目标视网膜层聚焦清晰。与滤纸黏附不良的切片（图2A，切片i）或仍保留视网膜色素上皮（RPE）的切片（图2A，切片iv）不应用于时间序列成像。
细胞活力对于观察生理过程至关重要 离体；建议使用细胞活力染料（如碘化丙啶，PI）来检测细胞活性，以便在进行视网膜切片操作时评估细胞健康状况。所有切片切缘附近的死细胞会将PI富集于细胞核中<strong class...

成像视网膜组织可提供传统生化方法无法获取的单细胞信息。本方案描述了用于共聚焦成像的斑马鱼视网膜切片制备方法。利用荧光遗传编码传感器或指示染料，可在不同类型的视网膜细胞中可视化多种生物学过程。

视网膜是一种复杂的组织，负责启动并整合视觉的第一步。视网膜细胞功能障碍是多种致盲性疾病的典型特征……

本实验的主要目标是制备可用于活体成像荧光蛋白或生物传感器实验的斑马鱼视网膜新鲜切片。该方法有助于回答视觉研究领域中的一些关键问题，例如钙离子在视网膜特定细胞类型及细胞区室中的生理与代谢作用。该技术的主要优势在于，能够在活体组织中提供有关关键代谢物和信号分子的空间与时间动态信息。为了能够从斑马鱼中去除视网膜色素上皮（RPE），在制备组织切片前，需将鱼置于黑暗环境中适应一小时。对于切片用的载玻片，在载玻片上用指甲油画线。使用透明指甲油，绘制细线以形成一个矩形。干燥后重新涂抹一次封片剂。如果该培养皿将用于静态成像，或进行溶液流动极少的注射实验，则使用注射器在盖玻片上涂抹两条平行的凡士林条带，每条长一厘米，间隔0.5厘米。现在准备刀片。首先，用乙醇清洁双面剃须刀片，并使其自然风干。然后使用剪刀将其剪成约一厘米长的小段。接下来，将切片室放置在组织切片机的载物台上，水平居中放置，并用永久性记号笔在长边上做标记以用于对齐。然后，将一片刀片安装到切片机的刀臂上。固定刀片，使其刃口位于载玻片中央上方，并与载玻片表面平行，但不接触指甲油。接着，将刀臂向下旋转四分之一圈。现在，尝试切割滤纸。如有需要，重新安装刀片。接下来，用注射器在直径10厘米的培养皿中距离中点约1.5厘米处，滴加一个微小的果冻点。然后用镊子将盖玻片干燥的一面压入琼脂糖凝胶中。接着，在成像室入口边缘约一厘米处，再放置一小滴琼脂糖凝胶。现在，使用20号针头在切片室中央沿纵向涂抹两条长约一厘米、相距约一厘米的细长平行石蜡油条带。然后将斑马鱼转移至培养皿中，并进行颈椎脱位处死，但不切除头部。接着，使用金属环松解眼球周围的结缔组织，再轻柔地将眼球向前拉出。随后，用显微剪刀小心剪断眼球下方的白色视神经，但不要剪到眼球后部。接下来，将眼睛转移至盛有冰冷林格液的培养皿中，并置于冰上。随后摘取另一只眼睛。在所有视网膜色素上皮（RPE）被去除之前，持续在红光下操作。接下来，将一只眼睛转移至培养皿中玻璃载片上的一滴冷的任氏液中。然后将培养皿置于低倍解剖显微镜下，在红光条件下解剖眼杯。首先，用精细镊子刺穿角膜。接下来，使用镊子和剪刀轻轻去除透明脆性的角膜和银色的巩膜。然后移除并丢弃晶状体以及大部分巩膜，以分离出眼球杯。在尽量减少操作的前提下，清除仍附着在眼球杯上但未脱离视网膜的任何脂肪和巩膜组织。如果视网膜与视网膜色素上皮层（RPE）发生分离，则需格外小心操作，以避免损伤脆弱的视网膜。接下来，将眼球杯状结构开口朝下重新放置，并使用新刀片将其切成三份或四份。丢弃那些曲度过大而无法展平的眼球杯碎片。这些碎片通常过小而无法在任何情况下使用。用任氏液润湿一片滤纸，用平头镊子将其放置在眼杯碎片旁边，以固定视网膜切片。然后将滤纸和组织浸入冷的任氏液中。接下来，使用镊子将视网膜组织块放置在滤纸表面，使视网膜色素上皮（RPE）和光感受器朝上。用精细镊

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从成年斑马鱼中制备新鲜视网膜切片用于前体成像实验

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。...

斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

该视频展示了一种从斑马鱼胚胎中培养原代视网膜神经节细胞的方法。早期胚胎经过解剖以分离眼球，随后通过机械方法将眼球解离成视网膜神经节细胞悬液。该细胞悬液被接种于涂有黏附性蛋白的盖玻片上进行培养，以促进轴突的发育。...

从斑马鱼胚胎中建立原代视网膜神经节细胞培养

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

我们介绍一种在成年斑马鱼中逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）的高效方法。...

成年斑马鱼视网膜神经节细胞的逆行荧光染料标记

已有多种光损伤方案被用于损伤感光细胞，从而诱导成年斑马鱼的视网膜再生反应。本方案描述了一种改进的方法，适用于有色系动物，并可损伤整个视网膜中绝大多数的视杆细胞和视锥细胞。...

一种用于成年斑马鱼视网膜再生研究的新型光损伤模型

斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。...

成年转基因斑马鱼视网膜外植体的培养及其通过多光子显微镜进行的活细胞成像

本方案描述了通过关联超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜图像，获得斑马鱼视网膜亚细胞蛋白定位结果所需的各个步骤。...

相关超分辨率显微镜与电子显微镜技术解析斑马鱼视网膜中蛋白质的定位

本文介绍了一种实验方法，可用于对成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统进行简便分析，作为长期血管病变（与新生血管形成及结构改变相关）研究中的快速检测手段。...

通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。...

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。...

活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

学习从成年斑马鱼制备新鲜视网膜切片的方法，用于活细胞成像实验。该技术利用荧光生物传感器研究视网膜细胞中钙离子的生理与代谢作用，为视觉研究提供时空信息。

制备成年斑马鱼新鲜视网膜切片用于离体成像实验

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