人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测

这种方法可以帮助回答 RNA 生物学领域的关键问题，例如 RdRP 或 TERT 在人类细胞中的生物学意义是什么？该技术的主要优点是该测定被确立为检测细胞中表达的人 RdRP 活性的第一种敏感方法。按照文本方案中的说明，从制备 HeLa 细胞开始此过程。

用 10 毫升 PBS 洗涤细胞一次。然后，将样品以 1， 450 倍重力在 4 摄氏度下离心 5 分钟，并弃去上清液。每 1000 万个细胞使用 1 毫升冰冷的裂解缓冲液 A，通过轻柔移液裂解细胞。

在 1.5 mL 试管中以 25% 的超声仪扩增对样品进行超声处理 10 秒。超声处理后，将样品在 4 摄氏度下以 20， 400 倍重力离心 15 分钟。收集上清液，并将上清液各 1 毫升转移到 1.5 毫升微量离心管中。

通过每 1 毫升裂解物添加 40 μL 预洗的蛋白 A-琼脂糖珠子来预澄清裂解物。将试管倒置数次，充分混合。然后，在 4 摄氏度下旋转样品 30 分钟。

将样品在 4 摄氏度下以 13， 000 倍重力离心 1 分钟，并回收上清液。接下来，将 40 μL 预洗的蛋白 A-琼脂糖珠和 10 μg 抗人 TERT 抗体添加到预先澄清的裂解物中。将试管倒置数次，充分混合，并将样品在 4 摄氏度下旋转过夜。

在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心 30 秒后，去除上清液。接下来，用 Wash Buffer One 洗涤微珠。向微珠中加入 1 mL Wash Buffer One，倒置试管充分混匀。

然后，在 4 摄氏度下旋转样品 5 分钟。将样品在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心 30 秒。去除上清液，然后重复此步骤 3 次。

按照文本方案中所述洗涤 AGC 溶液后，通过轻轻移液将微球菌核酸酶重悬于 60 μL 微球菌核酸酶反应混合物中，用微球菌核酸酶处理珠子。然后，在置于 Peltier 型培养箱中的摇床转盘上轻轻摇动样品，在 25 °C 下摇动 15 分钟。在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心样品 30 秒后，去除上清液。

最后，用含有 3 毫摩尔 EGTA 的 AGC 溶液洗涤珠子两次，然后按照文本方案中的说明用洗涤缓冲液 Two 洗涤珠子一次。如文本方案中所述，在新管中制备 RdRP 反应混合物。向反应混合物中加入 6 微升在 α 磷酸基团上标记的三磷酸尿苷，P dash 32，并通过移液充分混合。

然后，向混合物中加入 1 μL 模板 RNA，并充分混合。用 20 μL 得到的 RdRP 反应混合物重悬珠子。接下来，在置于 Peltier 型培养箱中的摇床转盘上轻轻摇动样品，在 32 摄氏度下摇动 2 小时。

孵育后，向反应混合物中加入 5.4 μL 20 mL/mL 蛋白酶 K 和 45.4 μL 2X 蛋白酶 K 缓冲液。通过移液混匀，并在 37 °C 的 Peltier 型培养箱中摇动样品 30 分钟。向样品中加入 109.2 μL 不含 RNase 的水后，加入 200 μL 酸性苯酚-氯仿。

涡旋混匀，然后在室温下以 21 倍比重离心样品 100 分钟，反应 5 分钟。将水相转移到新管中。重复此步骤一次。

然后，向水相中加入 20 微升 3 摩尔乙酸钠（pH 值为 5.2）、4 微升沉淀载体和 250 微升乙醇。充分摇动试管进行混合。将样品在 21， 100 倍重力下在 4 摄氏度下离心 20 分钟，然后弃去上清液。

接下来，用 300 微升每体积 70% 体积的冷乙醇清洗沉淀，储存在零下 20 摄氏度。将样品在 21 倍重力下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。弃去上清液，风干沉淀。

沉淀重悬于 20 μL 不含 RNase 的水中。如文本方案中所述，在新试管中制备 RNase 反应混合物。向样品中加入 180 μL RNase 反应混合物。

然后，将试管在 37 摄氏度下孵育 2 小时。向样品中加入 2.3 微升每体积 10% 体积的 SDS，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后，向样品中加入 2 微升每毫升 20 毫克的蛋白酶 K，并在 15 摄氏度下再孵育 37 分钟。

现在，向样品中加入 205 微升酸性苯酚-氯仿。像以前一样混合和离心后，将水相转移到新管中。向水相中加入三摩尔乙酸钠、沉淀载体和乙醇，然后如前所述混合、离心和洗涤沉淀。

此处显示的是 IP-RdRP 测定在用诺考达唑或 DMSO 处理的 HeLa 细胞中未处理细胞的三个代表性结果。使用化学合成的 34 个核苷酸 RNA 作为模板。暴露过夜后，可以看到 20 至 30 个核苷酸的 RdRP 产物，特别是在有丝分裂期的 HeLa 细胞中。

看完这个视频，你应该对如何检测人 TERT 的 RdRP 活性有了很好的了解。