人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测
2018年6月12日
人端粒酶逆转录 (叔) 合成不仅端粒长度 DNA, 而且还通过 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的双链 rna。在这里, 我们描述了一个新建立的检测 rna 依赖 rna 聚合酶活性的内源性叔。
这种方法可以帮助回答 RNA 生物学领域的关键问题，例如 RdRP 或 TERT 在人类细胞中的生物学意义是什么？该技术的主要优点是该测定被确立为检测细胞中表达的人 RdRP 活性的第一种敏感方法。按照文本方案中的说明，从制备 HeLa 细胞开始此过程。
用 10 毫升 PBS 洗涤细胞一次。然后，将样品以 1， 450 倍重力在 4 摄氏度下离心 5 分钟，并弃去上清液。每 1000 万个细胞使用 1 毫升冰冷的裂解缓冲液 A，通过轻柔移液裂解细胞。
在 1.5 mL 试管中以 25% 的超声仪扩增对样品进行超声处理 10 秒。超声处理后，将样品在 4 摄氏度下以 20， 400 倍重力离心 15 分钟。收集上清液，并将上清液各 1 毫升转移到 1.5 毫升微量离心管中。
通过每 1 毫升裂解物添加 40 μL 预洗的蛋白 A-琼脂糖珠子来预澄清裂解物。将试管倒置数次，充分混合。然后，在 4 摄氏度下旋转样品 30 分钟。
将样品在 4 摄氏度下以 13， 000 倍重力离心 1 分钟，并回收上清液。接下来，将 40 μL 预洗的蛋白 A-琼脂糖珠和 10 μg 抗人 TERT 抗体添加到预先澄清的裂解物中。将试管倒置数次，充分混合，并将样品在 4 摄氏度下旋转过夜。
在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心 30 秒后，去除上清液。接下来，用 Wash Buffer One 洗涤微珠。向微珠中加入 1 mL Wash Buffer One，倒置试管充分混匀。
然后，在 4 摄氏度下旋转样品 5 分钟。将样品在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心 30 秒。去除上清液，然后重复此步骤 3 次。
按照文本方案中所述洗涤 AGC 溶液后，通过轻轻移液将微球菌核酸酶重悬于 60 μL 微球菌核酸酶反应混合物中，用微球菌核酸酶处理珠子。然后，在置于 Peltier 型培养箱中的摇床转盘上轻轻摇动样品，在 25 °C 下摇动 15 分钟。在 4 摄氏度下以 3， 300 倍重力离心样品 30 秒后，去除上清液。
最后，用含有 3 毫摩尔 EGTA 的 AGC 溶液洗涤珠子两次，然后按照文本方案中的说明用洗涤缓冲液 Two 洗涤珠子一次。如文本方案中所述，在新管中制备 RdRP 反应混合物。向反应混合物中加入 6 微升在 α 磷酸基团上标记的三磷酸尿苷，P dash 32，并通过移液充分混合。
然后，向混合物中加入 1 μL 模板 RNA，并充分混合。用 20 μL 得到的 RdRP 反应混合物重悬珠子。接下来，在置于 Peltier 型培养箱中的摇床转盘上轻轻摇动样品，在 32 摄氏度下摇动 2 小时。
孵育后，向反应混合物中加入 5.4 μL 20 mL/mL 蛋白酶 K 和 45.4 μL 2X 蛋白酶 K 缓冲液。通过移液混匀，并在 37 °C 的 Peltier 型培养箱中摇动样品 30 分钟。向样品中加入 109.2 μL 不含 RNase 的水后，加入 200 μL 酸性苯酚-氯仿。
涡旋混匀，然后在室温下以 21 倍比重离心样品 100 分钟，反应 5 分钟。将水相转移到新管中。重复此步骤一次。
然后，向水相中加入 20 微升 3 摩尔乙酸钠（pH 值为 5.2）、4 微升沉淀载体和 250 微升乙醇。充分摇动试管进行混合。将样品在 21， 100 倍重力下在 4 摄氏度下离心 20 分钟，然后弃去上清液。
接下来，用 300 微升每体积 70% 体积的冷乙醇清洗沉淀，储存在零下 20 摄氏度。将样品在 21 倍重力下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。弃去上清液，风干沉淀。
将沉淀重悬于 20 μL 不含 RNase 的水中。如文本方案中所述，在新试管中制备 RNase 反应混合物。向样品中加入 180 μL RNase 反应混合物。
然后，将试管在 37 摄氏度下孵育 2 小时。向样品中加入 2.3 微升每体积 10% 体积的 SDS，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后，向样品中加入 2 微升每毫升 20 毫克的蛋白酶 K，并在 15 摄氏度下再孵育 37 分钟。
现在，向样品中加入 205 微升酸性苯酚-氯仿。像以前一样混合和离心后，将水相转移到新管中。向水相中加入三摩尔乙酸钠、沉淀载体和乙醇，然后如前所述混合、离心和洗涤沉淀。
此处显示的是 IP-RdRP 测定在用诺考达唑或 DMSO 处理的 HeLa 细胞中未处理细胞的三个代表性结果。使用化学合成的 34 个核苷酸 RNA 作为模板。暴露过夜后，可以看到 20 至 30 个核苷酸的 RdRP 产物，特别是在有丝分裂期的 HeLa 细胞中。
看完这个视频，你应该对如何检测人 TERT 的 RdRP 活性有了很好的了解。
概述
本研究提出了一种新型检测方法，用于检测内源性人类端粒酶逆转录酶（TERT）的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）活性。该方法对于理解RdRP和TERT在人类细胞中的生物学作用具有重要意义。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- TERT合成端粒DNA并表现出RdRP活性。
- 理解RdRP的作用对于RNA生物学至关重要。
- 这种检测方法是第一种用于检测人类RdRP活性的敏感方法。
- HeLa细胞用于实验程序。
研究目的
- 建立一种用于检测人类细胞中RdRP活性的敏感检测方法。
- 探索TERT和RdRP的生物学意义。
- 为RNA生物学的未来研究提供可靠的方法。
使用的方法
- HeLa细胞的制备和使用裂解缓冲液A进行裂解。
- 用Protein A-agarose珠预先清除裂解液。
- 使用抗人TERT抗体进行免疫沉淀。
- 通过一系列酶促反应和洗涤检测RdRP活性。
主要结果
- 成功检测到HeLa细胞中的RdRP产物。
- 结果表明在有丝分裂阶段存在RdRP活性。
- 检测方法显示对TERT介导的RdRP活性具有特异性。
- 该方法为TERT在RNA生物学中的作用提供了见解。
结论
- 该检测方法是研究人类细胞中RdRP活性的宝贵工具。
- 研究结果增强了对TERT功能的理解，超越了端粒维护。
- 未来的研究可以利用这种方法进一步探索RNA生物学。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables detection of RNA-dependent RNA polymerase activity in human TERT, providing mechanistic insight into non-canonical enzymatic functions relevant to RNA biology and cancer research. It supports target validation by clarifying TERT's role beyond telomere maintenance, aiding in the de-risking of therapeutic hypotheses involving RNA silencing pathways. The method offers a sensitive, cell-based approach to evaluate TERT-mediated RdRP activity, informing early discovery decisions in oncology and RNA-targeted therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates TERT's RNA-dependent RNA polymerase activity to clarify its biological significance in human cells.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking TERT to RNA silencing mechanisms in cancer contexts.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing direct evidence of non-canonical enzymatic function for hypothesis-driven target assessment.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Establishes a sensitive, reproducible method for detecting endogenous RdRP activity in cell lysates.
- Operational Value: Enables standardized immunoprecipitation-based workflows for consistent RdRP product detection.
- Operational Value: Facilitates quantitative analysis via radiolabeled nucleotide incorporation and gel electrophoresis for activity measurement.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects TERT's RdRP activity to mitotic phase-specific function in HeLa cells, supporting disease-relevant system modeling.
- Translational Value: Provides a mechanistic bridge between telomere maintenance and RNA biology in cancer phenotypes.
- Translational Value: Supports risk-adjusted advancement by clarifying TERT's multifunctional role in cellular pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target de-risking and mechanistic insight are prioritized before assay development or screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of TERT's non-canonical functions in RNA silencing and regulatory networks.
- Analytics: Generates quantitative RdRP product readouts via autoradiography to compare activity across conditions or treatments.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable immunoprecipitation-activity assay platform adaptable to other RNA-modifying enzymes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining TERT's RNA polymerase activity independent of telomere synthesis.
- Operational Value: Delivers a standardized, sensitive protocol for detecting low-abundance RdRP activity in cellular systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying target multifunctionality and potential off-target RNA effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TERT-targeting strategies based on RNA-mediated mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, radioactive nucleotide handling, and nucleic acid electrophoresis.
- Dependent on access to scintillation detection, phosphorimaging, or autoradiography equipment for product visualization.
- Necessitates RNase-free environments and controlled incubation conditions to preserve RNA integrity and enzyme activity.
- Involves optimization considerations for antibody specificity, bead blocking, and template RNA design across cell types.
- Limited by the need for radioactive labeling, which may require radiation safety protocols and waste management procedures.
