Name: 人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习检测人端粒酶逆转录蛋白RNA依赖性RNA聚合酶活性的半定量方法。本实验使用HeLa细胞进行免疫沉淀和酶促反应，为研究RNA生物学和TERT功能提供了首个灵敏的检测手段。

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本研究部分由日本医疗研究开发机构（AMED）的癌症治疗创新研究开发项目（P-DIRECT）（15cm0106102h0002，K.M.）和癌症研究与治疗进化项目（P-CREATE）（16cm01061150001，K.M.）；武田科学振兴财团（Y.M.）；高松宫妃癌症研究基金资助项目（13-24520，Y.M.）；以及日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 JP16K07133（Y.M.）资助。

1. 试剂配制
<ol>
	<li>细胞同步化所用试剂
	<ol>
		<li>为制备含有 2.5 mM 胸腺嘧啶的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），将 30.28 mg 胸腺嘧啶溶解于 1 mL 细胞培养级水中，配制成 125 mM 胸腺嘧啶溶液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤该溶液。每 50 mL 添加 10%（vol/vol）胎牛血清（FBS）的 DMEM 中加入 1 mL 新鲜配制的 125 mM 胸腺嘧啶溶液。</li>
		<li>为制备含有 0.1 μg/mL 诺考达唑的 DMEM，将诺考达唑溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 5 μg/μL 的诺考达唑溶液。每 50 mL 添加 10%（vol/vol）FBS 的 DMEM 中加入 1 µL 的 5 µg/µL 诺考达唑溶液。</li>
		<li>为制备含有 0.002%（vol/vol）DMSO 的 DMEM，每 50 mL 添加 10%（vol/vol）FBS 的 DMEM 中加入 1 µL DMSO。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IP-RdRP 实验所用试剂
	<ol>
		<li>配制裂解缓冲液 A：150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl（pH 7.4）和 0.5%（vol/vol）Nonidet P-40（NP-40）。将该试剂储存于 4 °C。</li>
		<li>配制 5x 醋酸盐缓冲液：50 mM 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）-KOH（pH 7.8）、500 mM 醋酸钾和 20 mM MgCl2。将该试剂储存于室温。</li>
		<li>配制洗涤缓冲液 1：1x 醋酸盐缓冲液、10%（vol/vol）甘油、0.1%（vol/vol）Triton X-100 和 0.06x 蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）。洗涤缓冲液 1 应在使用当天或前一天配制，并储存于 4 °C。</li>
		<li>配制 AGC 溶液：1x 醋酸盐缓冲液、10%（vol/vol）甘油和 0.02%（wt/vol）3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸（CHAPS）。将该试剂储存于 4 °C。</li>
		<li>为制备含有 2 mM CaCl2 的 AGC 溶液，每 50 mL AGC 溶液中加入 100 µL 的 1 M CaCl2。将该试剂储存于 4 °C。</li>
		<li>为制备含有 3 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）的 AGC 溶液，每 50 mL AGC 溶液中加入 375 µL 的 0.4 M EGTA（pH 7.5）。将该试剂储存于 4 °C。</li>
		<li>配制洗涤缓冲液 2：1x 醋酸盐缓冲液和 0.02%（wt/vol）CHAPS。将该试剂储存于 4 °C。</li>
		<li>配制 HMD 溶液：0.2 M HEPES-KOH（pH 7.8）、40 mM MgCl2 和 2 mM 二硫苏糖醇（DTT）。将该试剂储存于 -20 °C。 
		注：HMD 溶液应至少每三个月更换一次。</li>
		<li>配制 2x 蛋白酶 K 缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、20 mM EDTA 和 1%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）。将该试剂储存于 -20 °C。</li>
		<li>配制 2x 上样缓冲液：95%（vol/vol）甲酰胺、20 mM EDTA 和 1%（wt/vol）橙 G。将该试剂储存于 -20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HeLa 细胞的制备
注意：准备处于有丝分裂期（经处理）或异步分裂（未经处理）的 HeLa 细胞。将细胞培养在含 5% CO2 的环境中，37 °C 条件下。
<ol>
	<li>HeLa 细胞有丝分裂的同步化
	<ol>
		<li>在 10 cm 培养皿中接种 1 × 106 个 HeLa 细胞，加入 10 mL DMEM 培养基（含 10% (vol/vol) 胎牛血清）。</li>
		<li>接种两天后，弃去原培养基，更换为含 2.5 mM 胸腺嘧啶和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 24 小时。</li>
		<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）(-) 洗涤细胞三次，随后加入含 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 6 小时。</li>
		<li>更换为含 0.1 µg/mL 诺考达唑和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 14 小时。</li>
		<li>轻轻摇动培养皿，收集含有脱落的有丝分裂期细胞的上清液。计数细胞数量，用于 IP-RdRP 检测。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 490 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。 
		注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未处理 HeLa 细胞的制备
	<ol>
		<li>在 10 cm 培养皿中接种 1 × 106 个 HeLa 细胞，加入 10 mL DMEM 培养基（含 10% (vol/vol) 胎牛血清）。</li>
		<li>接种两天后，更换为含 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 30 小时。</li>
		<li>更换为含 0.002% (vol/vol) DMSO 和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 14 小时。</li>
		<li>使用含 1 mM EDTA 的 0.7 mL 胰蛋白酶（2.5 g/L）进行消化，收集细胞。计数细胞数量，用于 IP-RdRP 检测。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 490 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。 
		注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫沉淀-依赖RNA的RNA聚合酶（IP-RdRP）检测
<ol>
	<li>蛋白A-琼脂糖微珠制备
	<ol>
		<li>将1 mL亲和树脂（柱体积500 µL）转移至1.5 mL微量离心管中。以800 x g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>向珠子中加入 800 µL 裂解缓冲液 A，通过反复倒置试管充分混匀。在 800 x g 4 °C下离心3分钟，弃上清液。重复此步骤两次（共洗涤三次）。</li>
		<li>向珠子中加入800 µL裂解缓冲液A，通过反复倒置试管数次充分混匀。将试管置于旋转摇床中，4 °C旋转孵育过夜（或至少4小时）。</li>
		<li>以 800 x 离心试管 g 4 °C下离心3分钟，弃去上清液。</li>
		<li>向珠子中加入500 µL裂解缓冲液A，通过反复倒置离心管充分混匀。将珠子置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解液的制备
	<ol>
		<li>（可选）如果在步骤2中细胞已被冷冻，请将冷冻的细胞置于冰上解冻，直至细胞变得松散。</li>
		<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（无钙镁，PBS (-)）洗涤细胞一次。在 1,450 x g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用预冷的裂解缓冲液A裂解细胞（每1 × 10⁶个细胞加入1 mL裂解缓冲液A）7 通过轻柔吹打混悬细胞。</li>
		<li>在1.5 mL离心管中对样品进行超声处理，条件如下：将超声仪的振幅设为25%，超声10秒。</li>
		<li>以 20,400 x g 4 °C 下离心 15 分钟。</li>
		<li>收集上清液。将上清液各1 mL转移至1.5 mL微量离心管中。 
		注意：所有操作均须在无RNase条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀
	<ol>
		<li>将步骤 3.2.6 得到的裂解液进行预清除，每 1 mL 裂解液中加入 40 µL（珠体积为 20 µL）预清洗的蛋白 A-琼脂糖珠。通过反复倒置离心管充分混匀，并在 4 °C 下旋转孵育样品 30 分钟。</li>
		<li>以 13,000 x g 离心样品 g 在 4 °C 下离心 1 分钟，收集上清液。</li>
		<li>加入40 µL预清洗的蛋白A-agarose微珠（床体积20 µL）和10 µg抗人TERT抗体（克隆号：10E9-2）8 加入预清除的裂解液中，通过反复倒置离心管充分混匀，并于4 °C旋转孵育过夜。</li>
		<li>将样品在 3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。</li>
		<li>用洗涤缓冲液1洗涤磁珠：向磁珠中加入1 mL洗涤缓冲液1，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育5 min。在3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。重复此步骤额外三次。</li>
		<li>用含有 2 mM CaCl 的 AGC 溶液洗涤磁珠一次2：加入1 mL含有2 mM CaCl的AGC溶液2 加入珠子后，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育样品5分钟。随后在3,300 x g 4 °C下离心0.5分钟，弃上清液。</li>
		<li>用微球菌核酸酶（MNase）处理珠子：配制如下所述的MNase反应混合液 表1将珠子用60 µL MNase反应混合液通过轻柔吹打重悬。将样品置于帕尔帖型孵育箱中，于摇床上以20至25 rpm轻轻振荡15分钟，温度为25 °C。 
		注意：此步骤中必须使用往复式摇床，并严格遵守速度限制。不建议使用其他类型的摇床，例如旋转混合器。</li>
		<li>将样品在 3,300 x g 4 °C下离心0.5分钟，弃上清液。</li>
		<li>用含有 3 mM EGTA 的 AGC 溶液洗涤磁珠两次：向磁珠中加入 1 mL 含有 3 mM EGTA 的 AGC 溶液，通过倒置试管充分混匀，并在 4 °C 下旋转孵育 5 分钟。在 3,300 x g 在 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。重复此步骤一次。</li>
		<li>用洗涤缓冲液2洗涤磁珠一次：加入1 mL洗涤缓冲液2 加入珠子后，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育样品5分钟。在3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。在准备 RdRP 反应时，将磁珠置于冰上保存。 
		注意：所有操作均须在无 RNase 条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RdRP 反应
	<ol>
		<li>在新管中按照所述方法配制 RdRP 反应混合液 表 2.</li>
		<li>加入6 µL的[α-32将P]UTP（3,000 Ci/mmol）加入混合物中，用移液器充分混匀。 
		注意：[α-32P]ATP，[α-32P]CTP，或[α-32P]GTP 可用于该反应，以替代[α-32P]UTP</li>
		<li>加入1 µL模板RNA（1 µg/µL），用移液器吹打混匀。 
		注意：为建立 RdRP 检测，建议使用以下 RNA 模板：5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>用移液器将20 µL步骤3.4.3中的RdRP反应混合物重悬珠子。</li>
		<li>将样品置于帕尔帖式培养箱内的摇床转盘上，以32 °C轻轻振荡（20至25 rpm）2小时。</li>
		<li>加入5.4 µL蛋白酶K（20 mg/mL）和45.4 µL 2×蛋白酶K缓冲液至反应混合物中。用移液器吹打混匀，将样品置于帕尔帖式孵育器内的转盘上，以20至25 rpm振荡反应30分钟，温度设为37 °C。</li>
		<li>加入 109.2 µL 无 RNase 水至样品中。</li>
		<li>加入 200 µL 酸性酚-氯仿至样品中。涡旋充分混匀，然后在 21,100 x g 室温下孵育5分钟。将水相转移至新管中。重复此步骤一次。</li>
		<li>向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH = 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀试管，然后在 21,100 x g 4 °C 下离心 20 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用 300 µL 预冷至 -20 °C 的 70%（体积/体积）乙醇洗涤沉淀。在 21,100 x g 4 °C 下离心 15 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，空气干燥沉淀物。 
		注意：所有操作均须在无 RNase 条件下进行。 
		注意：步骤 3.4.11 中获得的沉淀物可在 -20 °C 下保存至少 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNase 处理
	<ol>
		<li>将步骤 3.4.11 中的沉淀重悬于 20 µL 无 RNase 水中。</li>
		<li>在新管中按如下所述配制 RNase 反应混合液 表3.</li>
		<li>向样品中加入180 µL RNase反应混合液，37 °C孵育2小时。</li>
		<li>加入2.3 µL 10%（体积比）SDS至样品中，37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>加入 2 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）至样品中，37 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入205 µL酸性酚-氯仿至样品中。涡旋充分混匀，然后在21,100 x g 室温下孵育5分钟。将水相转移至新管中。</li>
		<li>向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀管内液体，随后在 21,100 x g 4 °C 下离心 20 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用 300 µL 预冷至 -20 °C 的 70%（体积/体积）乙醇洗涤沉淀。将样品在 21,100 x g 4 °C 下离心 15 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，空气干燥沉淀。 
		注意：步骤 3.5.9 中获得的沉淀物可在 -20 °C 下保存至少 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶电泳和放射自显影
	<ol>
		<li>用20 µL无RNase的水重悬样品。</li>
		<li>加入20 µL的2x上样缓冲液。</li>
		<li>将样品在 95 °C 下煮沸 10 分钟。在冰上研磨样品。</li>
		<li>运行凝胶。若模板长度为34个核苷酸（参见步骤3.4.3），则使用7 M 尿素-10%聚丙烯酰胺凝胶进行变性凝胶电泳。</li>
		<li>使用凝胶干燥仪干燥凝胶。</li>
		<li>将胶片与干燥的凝胶置于X射线暗盒中，并在-80 °C下使用增感屏曝光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
<li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

IP-RdRP 检测是一种用于检测人 TERT 的 RdRP 活性的敏感方法。TERT 蛋白在有丝分裂的 HeLa 细胞中高表达，其中 TERT 形成 RdRP 复合物8,9,10这表明有丝分裂期的HeLa细胞是检测RdRP活性的理想材料。在上述方案中，有丝分裂期细胞和非同步化的HeLa细胞分别作为阳性对照和阴性对照。如图所示 图1A在有丝分裂的HeLa细胞中，使用推荐的RNA模板进行RdRP实验，产物在20至30 nt范围内显示出广泛的放射性信号。除HeLa细胞外，我们还在多种不同类型的细胞系中进行了该实验，发现信号模式在不同细胞类型中可能发生变化。9：一些样品仅在约30 nt处显示出强信号，另一些则表现出与HeLa细胞相似的模式。我们还使用了除34 nt模板以外的其他RNA模板进行该检测8，短链和长链（约300 nt）且序列各异的RNA，并已成功利用这些模板获得RdRP产物，尽管可能存在一定的序列偏好性。然而，首次实验建议使用处于有丝分裂期的HeLa细胞以及34 nt的RNA模板。RdRP能够以引物依赖性和引物非依赖性两种方式生成双链RNA11我们已报道，TERT 作为人类 RdRP 可维持这一特性7,9TERT 通过反向引物机制，以具有 3'-折叠结构的 RNA 模板合成双链 RNA7对于34 nt的RNA模板，TERT在不使用引物的情况下合成互补链9为了特异性检测以非引物依赖方式合成的RdRP产物， 即从头合成 合成的RNA产物，[α-32P]NTP 可替换为 [γ-32P]NTP 在 RdRP 反应中的作用9.
在磁珠上的TERT免疫复合物中进行MNase处理是获得理想结果的关键步骤。如果MNase处理时间过长或振荡过于剧烈，RdRP产物将显著减少。为避免此类问题，我们强烈建议严格遵循本实验方案。HMD溶液是另一个影响成功的关键因素。如果发现信号非常微弱，应更换为新配制的HMD溶液。
在整个实验过程中，应格外注意避免RNase污染。核糖核酸酶处理应使用专用设备进行。操作核糖核酸酶后，应立即将接触过RNase的枪头和离心管丢弃，并使用专用溶液清除RNase例如 RNase Quiet) 并更换槽道。
TERT 不仅与 TERC 相互作用，还与多种内源性 RNA 相互作用，我们已报道了其中一部分7。对免疫沉淀-逆转录依赖性 RNA 聚合酶（IP-RdRP）检测方法进行改良，例如在不进行微球菌核酸酶（MNase）处理的情况下实施 IP-RdRP 检测，将能够全面列出 TERT 相关 RdRP 活性的内源性 RNA 模板，并通过生物信息学分析提供其序列特征的指导。我们已成功将该方案应用于组织裂解液。由于 TERT 在多种正常组织和肿瘤组织中均有表达，该检测方法可能有助于研究 TERT 在人类中的非经典酶学功能。

人端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的催化亚基，它利用端粒酶RNA组分（TERC）这一特异性RNA模板来延长端粒1。尽管TERT作为端粒酶的组成部分负责端粒DNA的聚合，但结构与系统发育分析表明，TERT与病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）以及病毒逆转录酶密切相关，并与这些聚合酶共享结构域2,3,4。RdRP是一种以RNA为模板合成互补RNA链的酶。该酶不仅存在于病毒中，也存在于植物、酵母和线虫等模式生物中，RdRP介导的双链RNA合成在这些生物中参与转录和转录后水平的基因沉默5,6。尽管长期以来人类中未发现RdRP，我们在2009年发现人TERT具有RdRP活性7。
我们首先利用重组蛋白证实了TERT的RdRP活性7，然后建立了一种灵敏的 体外 检测内源性TERT的RdRP活性的实验方法8在这里，我们演示了 体外 内源性TERT的RdRP检测（IP-RdRP检测）。该方法首先对内源性TERT进行免疫沉淀（IP），随后进行 体外 RdRP 反应，其中放射性核糖核苷酸被掺入新生的 RNA 链中。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>和光</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合溶液</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS(-)）</td><td>和光</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶脱氧核苷</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus 琼脂糖凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>和光</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl2&amp;bull;6H₂O</td><td>和光</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>那可利得司</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯(10)辛基苯基醚（Triton X-100）</td><td>和光</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete，无EDTA</td><td>罗氏应用科学</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl2&amp;bull;2H2O</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶（MNase）</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP、rATP、rUTP、rGTP，各100 mM</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[α-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP（3,000 Ci/mmol）</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>使用新鲜的RI进行检测</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚-氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE 沉淀载体</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One 核糖核酸酶</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺，去离子</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>橙黄G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>例如，ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>例如，TOMY</td><td>EX-135</td><td>对于步骤 B)</td></tr><tr><td>微型制冷离心机</td><td>例如，KUBOTA</td><td>3740</td><td>对于步骤 6.2</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>在步骤 6.4 中，将微尖（#4422）安装到超声波破碎仪上</td></tr><tr><td>微型制冷离心机</td><td>例如，TOMY</td><td>MX-305</td><td>对于步骤 6.5</td></tr><tr><td>低温培养箱</td><td>例如，Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>在内部设置一个旋转摇床</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>例如，TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>低温培养箱&amp;nbsp;</td><td>例如，TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>设置摇床 &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; 内部，用于步骤 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>用于步骤 7.7、8.5 和 8.6 的摇床</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>例如，TAITEC</td><td>HB-80</td><td>设置摇床 &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; 内部，用于步骤 8.5 和 8.6</td></tr><tr><td>孵育块</td><td>例如，ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

人端粒酶逆转录酶蛋白依赖rna的rna聚合酶活性的半定量检测

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

人端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的催化亚基，通过依赖RNA的DNA聚合酶活性延长端粒。尽管TERT被命名为逆转录酶，但对其结构和系统发育的分析表明，TERT属于右手型聚合酶家族，与病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）以及病毒逆转录酶具有关联性。我们首次鉴定出人TERT具有RdRP活性，该活性可针对模板非编码RNA生成互补RNA链，并在癌细胞中参与RNA沉默过程。为了分析这种非经典的酶活性，我们于2009年开发了基于重组TERT的RdRP检测方法，随后建立了针对内源性TERT的in vitro RdRP检测体系。本文中，我们描述的是后一种方法。简言之，从细胞中分离TERT免疫复合物，与模板RNA及包含放射性标记rNTP的rNTPs共同孵育以进行RdRP反应。为消除单链RNA，将反应产物用RNase I处理，最终产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。放射性标记的RdRP产物可在过夜曝光后通过放射自显影检测。

使用推荐的RNA模板，在过夜曝光后，仅在处于有丝分裂期的HeLa细胞中可观察到20至30个核苷酸（nt）之间的放射性RdRP产物（图1A）。通常，RdRP产物的信号强度呈现两个峰值，分别位于约25 nt和30 nt处，这与通过下一代测序确认的产物大小分布一致9。与有丝分裂细胞相反，未进行同步化的HeLa细胞几乎不产生20–30 nt的放射性产物。所有样本中位于20 nt以下的椭圆形信号为非特异性漂移。
如果在有丝分裂的 HeLa 细胞中仅观察到约 30 nt 的微弱信号产物，则表明 RdRP 反应进行不充分。例如，若微球菌核酸酶（MNase）处理操作过于粗略或不适当，有丝分裂 HeLa 细胞中的信号强度会显著降低（图 1B）。使用陈旧的 HMD 溶液进行 RdRP 反应也会减少产物生成（图 1C）。
<img alt="电泳结果，比较DMSO/诺考达唑对RNA完整性的影响；可见nt标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：有丝分裂期HeLa细胞中内源性TERT的代表性RdRP产物。（A） 经诺考达唑（处理）或DMSO（未处理）处理的HeLa细胞中IP-RdRP检测的三个代表性结果。使用化学合成的34 nt RNA作为模板。（B） 在有丝分裂期HeLa细胞中进行IP-RdRP检测时，使用了不适当的MNase处理。（C） 在有丝分裂期HeLa细胞中进行IP-RdRP检测时，使用新鲜或陈旧的HMD溶液。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微球菌核酸酶，20 U/µL</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微球菌核酸酶缓冲液，10x</td>
			<td>8 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td>51 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：MNase 反应混合液组分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS, 0.07% (wt/vol)</td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMD 溶液</td>
			<td>2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP, 0.4 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂, 40 U/µL</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 RNase 水</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：RdRP反应体系组分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE 核糖核酸酶，10 U/µL</td>
			<td>0.2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反应缓冲液，10x</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td>159.8 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：核糖核酸酶反应体系组分。

人端粒酶逆转录酶（TERT）不仅可合成端粒DNA，还可通过依赖RNA的RNA聚合酶活性合成双链RNA。本文介绍了一种新建立的检测内源性TERT依赖RNA的RNA聚合酶活性的实验方法。

人端粒酶逆转录酶蛋白依赖RNA的RNA聚合酶活性的半定量检测

人端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的催化亚基，通过依赖RNA的DNA聚合酶活性延长端粒……

该方法有助于解答RNA生物学领域中的关键问题，例如RdRP或TERT在人类细胞中的生物学意义是什么？该技术的主要优势在于，该检测方法是首个建立的可灵敏检测细胞中表达的人源RdRP活性的方法。按照文本方案中的描述，首先准备HeLa细胞，然后开始本实验操作。用 10 毫升 PBS 清洗细胞一次。然后，在 4 摄氏度下以 1,450 ×g 离心 5 分钟，并弃去上清液。每 1,000 万细胞加入 1 毫升预冷的裂解缓冲液 A，通过轻柔吹打裂解细胞。将样品置于1.5毫升离心管中，在超声破碎仪上以25%的振幅超声处理10秒。超声处理后，在4°C条件下以20,400 ×g离心15分钟。收集上清液，并将1毫升上清液分别转移至1.5毫升微量离心管中。每毫升裂解液中加入40微升预先洗涤的Protein A-agarose珠进行预清除。通过反复倒置离心管充分混匀，然后在4°C下旋转孵育30分钟。在4°C条件下，以13,000 × g离心样品1分钟，收集上清液。接着，向预清除的裂解液中加入40 µL预洗涤的Protein A-agarose微珠和10 µg抗人TERT抗体。通过反复倒置离心管充分混匀，并在4°C下旋转孵育过夜。在4°C、3,300倍重力下离心30秒后，弃去上清液。接下来，用洗涤缓冲液一洗涤磁珠。向磁珠中加入1毫升洗涤缓冲液一，通过反复倒置试管充分混匀。然后，在 4 °C 条件下旋转样品 5 分钟。在 4 °C 条件下以 3,300 ×g 离心 30 秒。弃去上清液，并重复此步骤额外三次。按照文本方案中所述的 AGC 溶液洗涤步骤，通过轻轻吹打将珠子重悬于 60 微升微球菌核酸酶反应混合液中，以进行微球菌核酸酶处理。随后，将样品置于帕尔帖型孵育箱内的摇床转盘上，于 25 摄氏度轻轻振荡 15 分钟。在 4 摄氏度下以 3,300 ×g 离心 30 秒后，弃去上清液。最后，用含有3毫摩尔EGTA的AGC溶液将珠子洗涤两次，并按照文本方案中的描述用洗涤缓冲液二洗涤一次。在新管中按照文本方案所述配制RdRP反应混合液。向反应混合液中加入6微升α磷酸基团标记有P-32的尿苷三磷酸，用移液器吹打充分混匀。然后，向混合物中加入一微升的模板 RNA，并充分混匀。用 20 微升的 RdRP 反应混合物重悬磁珠。接下来，将样品置于帕尔帖式孵育箱中，在摇床的转盘上以 32 摄氏度轻轻振荡两小时。孵育后，向反应混合物中加入5.4微升浓度为20毫克/毫升的蛋白酶K和45.4微升2倍浓度的蛋白酶K缓冲液。用移液器吹打混匀，并将样品置于Peltier型孵育器中，在37摄氏度下振荡30分钟。向样品中加入109.2微升无RNase的水后，再加入200微升酸性酚-氯仿。在室温下以21,100 × g离心样品5分钟前，先通过涡旋充分混匀。将水相转移至新管中。重复此步骤一次。然后，向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀试管。在 4 °C 条件下，以 21,100 ×g 离心 20 分钟，弃去上清液。接下来，用300 µL预冷的、保存在-20 °C的70%（体积比）乙醇洗涤沉淀。在4 °C条件下，以21,100 ×g离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀在空气中干燥。将沉淀重悬于20微升无RNase的水中。按照文本方案所述，在新管中配制RNase反应混合液。向样品中加入180微升RNase反应混合液。然后，将离心管在37摄氏度下孵育2小时。向样品中加入2.3微升10%（体积比体积）的SDS，并在37摄氏度下孵育15分钟。接着，向样品中加入2微升20毫克/毫升的蛋白酶K，并在37摄氏度下再孵育15分钟。现在，向样品中加入205 µL酸性酚-氯仿。混匀后离心，操作同前，将水相转移至新管中。向水相中加入3 mol/L乙酸钠、沉淀载体和乙醇，随后混匀、离心，并按先前方法洗涤沉淀。图中显示了经诺考达唑或DMSO处理的HeLa细胞以及未经处理的HeLa细胞中IP-RdRP实验的三个代表性结果。实验使用化学合成的34个核苷酸RNA作为模板。经过过夜曝光后，可在20至30个核苷酸之间检测到RdRP产物，且这些产物特异性地存在于处于有丝分裂期的HeLa细胞中。观看本视频后，您应该能够充分理解如何检测人端粒酶逆转录酶（TERT）的RdRP活性。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测

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体外重建活性的 T. castaneum 端粒酶

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

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