人精切肺切片中物质的细胞毒性及免疫调节作用的评价
May 9th, 2018
鉴于3Rs 原则, 呼吸道模型作为动物研究的替代品正在演变。特别是对于呼吸物质的风险评估, 缺乏适当的化验方法。在这里, 我们描述了使用人的精密切割肺切片评估机载物质。
这种人类精确切割肺切片的三维模型的总体目标是在使用人体组织的离体模型中评估细胞毒性和免疫调节作用。这些方法可以帮助回答药理学和毒理学领域的关键问题，以评估安全性并帮助评估对天然人类环境中物质的生理反应。该技术的主要优点是，由于使用了新鲜、有活力的人体组织，我们能够模拟人类呼吸系统疾病的细胞毒性或免疫调节作用。
虽然这种方法可以深入了解人类细胞间相互作用、生理学和病理机制，但在呼吸系统疾病中，它也可以用于其他应用以及其他物种。通常，刚接触这种方法的人将难以组织评估人体组织和建立可靠的基础设施。此外，由于肺部的异质性，填充过程需要大量的培训和经验。
要开始此过程，请插入硅胶管并用平行于管的夹子固定气管，以便夹子将组织与硅胶管一起挤压在一起，而不会将其夹住。用夹子关闭所有其他支气管、血管和伤口，以免琼脂糖在填充过程中泄漏。需要良好的解剖学技能来插管主支气管。
肺不宜扩张太多，否则组织会分散注意力，如果组织不够充盈，就无法制作任何 PCLS，因为组织太软。然后，在烧杯中混合等体积的 3% 低胶凝琼脂糖与培养基。使用 15 毫升注射器将混合物滴入肺部。
在用培养基重新填充注射器之前，用手指或夹子夹住导管，以避免气泡和琼脂糖反流。将肺组织切成 3 到 5 厘米的板。用 400 毫升冰冷的 EBSS 填充组织切片机。
立即使用带有取芯工具的半自动螺丝刀从肺板上切下圆柱形组织核心。然后，将组织核心转移到组织切片机的组织支架中。将重物放在组织核心的顶部，然后开始将组织核心切成 PCLS。
应通过打开玻璃圆柱体的夹子，将培养基从组织切片机中排入烧杯中。接下来，将切片从烧杯转移到装有培养基的培养皿中。之后，将培养皿放入培养箱中，并在洗涤步骤之前让培养基加热。
然后，将肺切片小心地转移到 24 孔培养板中，培养基最少为 500 微升，每孔两片。要制备工作溶液的预混液，每个孔稀释 25 μL WST-1 试剂和 225 μL 培养基。接下来，每个孔吸取 250 微升 WST-1 预混液工作溶液，并在 37 摄氏度下孵育板 1 小时。
确保在孵育过程中 PCLS 完全被 WST-1 试剂覆盖。然后，将板以 200 RPM 的转速放在定轨摇床上，小心摇晃 30 秒，以确保 WST-1 试剂充分混合。然后，从 24 孔板的每个孔中吸取 100 微升上清液，一式两份到新的平底 96 孔板中。
使用酶标仪测量每个孔在 450 纳米处的吸收，并从 450 纳米处的吸收减去 630 纳米参考处的吸收。在有或没有测试剂的情况下孵育 PCLS 后，将 50 μL 上清液一式两份转移到新的 96 孔板中。这会从 24 孔板的每个处理孔中生成重复项。
在测定之前，通过将 125 微升催化剂溶液与 6.25 毫升染料溶液彻底混合（用于 96 孔板），制备不含 LDH 试剂工作溶液的预混液。然后，将 50 微升预混液工作溶液移液到已经含有 50 微升上清液的每个孔中。将板在室温下避光孵育 20 分钟。
之后，使用酶标仪测量每个孔在 492 纳米处的吸收，并从 492 纳米处减去 630 纳米参考处的吸收。对于微观评估，请使用 cLSM 执行至少两个随机分布的 Z 堆栈。单击 Ocular 选项卡以选择 10 倍物镜。
单击在线以使用 cLSM 作为标准光学显微镜来查找 PCLS 的表面。然后，单击 Offline 退出 ocular 设置。随后，单击 Acquisition 选项卡并为荧光团打开适当的激光器。
单击 Acquisition 选项卡下的 Light Path，然后为实验设置必要的滤光片和镜子。按下 live 按钮可在屏幕上查看相应图层的 live view。向上或向下移动焦点以找到具有尖锐信号的 PCLS 表面。
随后，将红色乙锭同型二聚体-1 通道的针孔设置为一个空气单位，以便在光收集效率和光学切片之间实现最佳平衡，并相应地调整钙黄绿素通道。增加检测到的增益信号。增加或减少数字偏移以调整背景，使其在激活通道颜色锁定的实时图像表中显示为蓝色。
选中 Z-stacks 框以设置微观体积的上限和下限。慢慢向上或向下移动焦点，直到达到 30 微米的范围，然后按 Set Last 保存。然后，再次单击 Live 以停用实时图像，并单击 Start Experiment 开始成像。
这里显示的是 PCLS 的显微活力图像，它证明了人体组织对去污剂作为一种有效的有毒物质的反应性。通过评估钙黄绿素阳性组织与锭同型二聚体-1 阳性细胞核相比，目视评估毒性作用。尽管供体之间人肺组织的活力不同，但与活组织相比，死细胞核的数量不应超过组织对照的 15%。
该图显示了六氯铂酸铵（一种 SLS）对人体肺组织的免疫调节作用的代表性数据。通过 ELISA 测定细胞外和细胞内 IL-1 α 和 TNF-α 并归一化为总蛋白含量。开发后，这项技术为药理学和基础科学领域的研究人员探索活的人类肺组织内的生理反应铺平了道路。
在此程序之后，可以执行其他终点，如气道收缩，以回答其他问题，例如支气管扩张药物的疗效。看完这个视频后，你应该对如何生成和处理人类精确切割的肺切片有一个很好的大致了解。一旦掌握，这项技术可以在 6 到 8 小时内完成，如果执行得当，第一个结果可以在前 24 小时内获得。
但是，不要忘记，与人类非固定材料一起工作可能会具有传染性，因此在执行此程序时应始终佩戴预防措施，例如防护服。此外，重要的是要记住尽可能在无菌条件下工作。
概述
本研究使用人类精细切割肺片（PCLS）来评估体外环境中的细胞毒性和免疫调节效应，提出了一个三维模型。该模型旨在评估空气中物质的安全性，同时模拟人类呼吸道疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 药理学
- 毒理学
- 呼吸生物学
背景
- 当前用于评估呼吸道物质的测定方法有限。
- 3R原则鼓励采用替代动物研究的方法。
- 人类PCLS可以提供对人类特定反应的洞察。
- PCLS技术的组织和执行存在挑战。
研究目的
- 开发一种评估空气中物质效应的可靠方法。
- 在实验室环境中模拟人类呼吸道疾病。
- 增强对人类组织对有毒物质反应的理解。
使用的方法
- 气管插管和填充琼脂。
- 准备精细切割肺片（PCLS）以进行测定。
- 使用WST-1和LDH测定评估细胞毒性。
- 显微镜评估PCLS的活力和反应性。
主要结果
- PCLS有效地模拟人类呼吸反应。
- 展示了所测试物质的细胞毒性效应。
- 为研究肺组织中细胞间的相互作用提供了平台。
- 强调了PCLS制备中技术技能的重要性。
结论
- 人类PCLS是呼吸道研究的有价值工具。
- 该模型可以改进空气中物质的风险评估。
- 需要进一步发展技术以实现更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human precision-cut lung slices (PCLS) provide an ex vivo model to assess cytotoxicity and immunomodulatory effects of airborne substances using viable human tissue, supporting 3Rs-aligned risk assessment in pharmaceutical and occupational safety testing. The model enables evaluation of pro-inflammatory cytokine release, such as TNF-α and IL-1α, offering mechanistic insight into respiratory tissue responses relevant to target validation and safety profiling. This approach bridges in vitro limitations and in vivo variability, enhancing predictive confidence in early discovery for inhaled therapeutics and toxicant screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of immunomodulatory pathways by measuring cytokine and chemokine secretion in human lung tissue.
- Operational Value: Supports functional target de-risking through ex vivo assessment of substance-induced inflammatory responses.
- Predictive Value: Provides human-relevant data to prioritize compounds based on immunomodulatory potential before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, normalized readouts (e.g., cytokine levels per total protein) for standardized compound evaluation.
- Operational Value: Establishes reproducible viability and inflammation assays using WST-1 and ELISA in a multi-well format.
- Scalability Value: Facilitates medium-throughput screening of substances with defined toxic and immunomodulatory endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains human tissue relevance from discovery through preclinical assessment of respiratory responses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from direct cytotoxicity or specific immunomodulation.
- Continuity Value: Supports progression from acute exposure modeling to chronic or repeated-dose study designs.
Pipeline & Workflow Integration
PCLS function as a human tissue-based platform in early discovery for mechanism probing and safety screening, informing lead identification decisions before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of substance-induced immunomodulation via measurable cytokine outputs in native human lung architecture.
- Screening: Delivers standardized, quantitative viability and inflammation data suitable for assay optimization and compound ranking.
- Analytics: Generates normalized biochemical readouts (e.g., ELISA-based cytokine levels) and viability metrics to compare treatment conditions.
- Translational Research: Offers continuity in assessing human-specific responses across discovery and preclinical stages when supported by follow-up functional assays.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable human tissue platform adaptable to multiple substance classes and respiratory endpoints beyond cytotoxicity.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through human-relevant immunomodulatory profiling.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility across laboratories using defined slicing and culture protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing reliance on animal models and increasing human data early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on human lung tissue responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human tissue handling, agarose perfusion, and precision slicing to ensure slice viability and consistency.
- Dependent on access to fresh human lung tissue and validated infrastructure for tissue preparation and sterile culture.
- Necessitates standardization of slicing thickness, incubation times, and assay normalization (e.g., to total protein) for cross-experiment comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different species or disease-state tissues.
- Limited by donor variability and tissue viability thresholds, requiring QC metrics (e.g., <15% dead nuclei) to ensure data reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
General Preparation of Human PCLS and Subsequent Exposure to Chemicals
4:28
Measurement of Chemically-induced Cytotoxicity in Human PCLS by WST-1 Assay
6:01
LDH Assay
7:29
Microscopic Viability Assay with Confocal Laser Scanning Microscope (cLSM)
9:49
Results: Representative Images of the Three-dimensional Microscopic Staining and Image Rendering of Human PCLS
10:59
Conclusion
