Name: 使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习使用单分子FRET和位点特异性标记技术研究mGluR2的构象动力学。该方法可在不扰动蛋白质结构的情况下实时可视化蛋白质运动，为研究蛋白质相互作用和合成受体工程提供新途径。

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感谢 Reza Vafabakhsh 实验室成员的讨论。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R01GM140272（资助给 R.V.）、西北大学生命科学 Searle 领导力基金，以及芝加哥生物医学联盟在芝加哥社区信托 Searle 基金支持下（资助给 R.V.）提供资助。B.W.L. 受美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）培训项目 T32GM-008061 资助。

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作者声明无竞争利益。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类位于细胞膜上、可启动信号转导的蛋白质。许多GPCRs由多个结构域组成，其信号传导依赖于这些结构域之间的协同相互作用。为了调控这类膜受体的性质，理解其多个结构域的动态行为至关重要。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种荧光技术，能够实时检测蛋白质的构象及其动态变化11,32。本文描述了一种结合smFRET、单分子下拉（SiMPull）和全内反射荧光（TIRF）显微镜的方法，用于直接观察固定在钝化表面上的单个蛋白质的重排过程5,11,33。FRET对距离高度敏感，可作为一种适用于探测分子内变化（3–8 nm）的纳米级标尺。与传统的生物物理方法相比，smFRET特别适用于在约10 ms时间尺度上研究大尺度的构象动态，并且所需样品体积小（每次实验约1 fmol）。此外，与核磁共振（NMR）<sup cla...

信息在质膜上的传递在很大程度上依赖于膜受体的功能1。配体与受体结合后会引起受体的构象变化并使其激活。这一过程通常具有变构特性2。G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类中最大的膜受体家族，包含超过800个成员3。由于GPCRs几乎参与所有细胞过程，已成为治疗药物开发的重要靶点。在经典的GPCR信号转导模型中，激动剂激活导致受体发生构象变化，进而通过Gα亚基的核苷酸结合口袋中GDP被GTP取代，从而激活异源三聚体G蛋白复合物。via。随后，活化的Gα-GTP和Gβγ亚基调控下游效应蛋白的活性，推动信号级联反应的进行4,5。该信号转导过程本质上依赖于配体改变受体三维结构的能力。深入理解配体实现这一作用的分子机制，对于开发新型治疗药物以及设计合成受体和传感器至关重要。
代谢型谷氨酸受体（mGluRs）属于C类G蛋白偶联受体家族，在介导谷氨酸的慢速神经调制效应以及调节神经元兴奋性方面具有重要作用6,7在所有G蛋白偶联受体（GPCRs）中，C类GPCRs在结构上具有独特性，因其以强制性二聚体形式发挥功能。代谢型谷氨酸受体（mGluRs）包含三个结构域：捕蝇草（Venus flytrap, VFT）结构域、富含半胱氨酸结构域（cysteine-rich domain, CRD）和跨膜结构域（transmembrane domain, TMD）。8激活过程中的构象变化十分复杂，涉及局部与全局构象的耦合，其传播距离可达12 nm，同时还包括二聚体间的协同效应。目前，中间构象状态、各状态的时间顺序以及状态间转换速率仍不清楚。通过实时追踪单个受体的构象变化，可以识别激活过程中短暂存在的中间态以及构象变化的序列。这一目标可通过单分子荧光共振能量转移技术实现。9,10 单分子FRET（smFRET），近期已应用于可视化mGluR2激活过程中构象变化的传播11FRET实验中的一个关键步骤是通过在目标蛋白中特定位点插入供体和受体荧光团，从而构建FRET传感器。本研究采用了非天然氨基酸（UAA）插入策略12,13,14,15 克服典型位点特异性荧光标记技术的局限性，这些局限性包括需要构建无半胱氨酸突变体或插入较大的遗传编码标签。该方法使得mGluR2中连接配体结合域与信号传导域的关键紧凑型别构连接区的构象重排得以被观察。本方案提供了在mGluR2上进行单分子FRET实验的逐步操作指南，包括利用非天然氨基酸（UAA）实现mGluR2位点特异性标记，并通过铜催化的叠氮-炔环加成反应连接荧光团的方法。此外，本方案还描述了膜蛋白的直接捕获及数据分析方法。此处所述方案亦适用于研究其他膜蛋白的构象动力学。

<table><tbody><tr><td>(+)-L-抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>4-叠氮-L-苯丙氨酸</td><td>Chem-Impex International</td><td>Cat # 06162</td><td></td></tr><tr><td>548UAA</td><td>Liauw 等，2021</td><td></td><td>转染质粒</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (2022)</td><td>https://www.adobe.com/</td><td>RRID:SCR_010279</td><td>软件，算法</td></tr><tr><td>氨基胍（盐酸盐）</td><td>Cayman Chemical</td><td>81530</td><td></td></tr><tr><td>氨基硅烷</td><td>Aldrich</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>2.8 L 超声清洗机</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>2.8 L 超声水浴</td></tr><tr><td>生物素-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td></td></tr><tr><td>BTTES</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1237-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜（II）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 451657-10G</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-306</td><td>样品腔室</td></tr><tr><td>Cy3 炔烃</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>TA117-5</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 炔烃</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>TA116-5</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310 1 GM</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>DDM-CHS (10:1)</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310-CH210 1 ML</td><td>含胆固醇去垢剂</td></tr><tr><td>定义型胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Di01-R405/488/561/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>陷波滤光片</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U</td><td>相机</td></tr><tr><td>ET542lp</td><td>Chroma</td><td></td><td>长通发射滤光片</td></tr><tr><td>FF640-FDi01</td><td>Semrock</td><td></td><td>发射二向色滤光片</td></tr><tr><td>FLAG标签抗体</td><td>Genscript</td><td>A01429</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Invitrogen T7279</td><td>TetraSpeck 微球</td><td>球形微珠</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherfinest</td><td>12-544-4</td><td>样品腔室</td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 6106-04-3</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 12022001</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBioReagents</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>OptoSplit II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>激光器</td><td>Oxxius</td><td></td><td>四线激光合束器</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td>Barnstead</td><td></td><td>去离子水装置</td></tr><tr><td>m-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>NF03-405/488/532/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>二向色镜</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985091</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>OptiMEM/低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro (2020b)</td><td>https://www.originlab.com/</td><td>RRID:SCR_014212</td><td>数据分析与绘图软件</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pIRE4-Azi</td><td>Addgene</td><td>质粒 # 105829</td><td>转染质粒</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # P2636</td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸（PCA）</td><td>HWI group</td><td>99-50-3</td><td></td></tr><tr><td>smCamera (版本 1.0)</td><td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td><td></td><td>相机软件</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>FisherBioReagents</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Whatman UNIFLO</td><td>Cat#9914-2502</td><td>液体过滤</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>53188-07</td><td></td></tr></tbody></table>

利用单分子fret可视化膜受体的构象动力学

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

细胞对外部信号作出响应的能力对于细胞的发育、生长和存活至关重要。为了响应环境中的信号，细胞必须能够识别并处理该信号。这一任务主要依赖于膜受体的功能，其作用是将信号转化为细胞内的生化语言。G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类中最大的膜受体蛋白家族。在GPCRs中，代谢型谷氨酸受体（mGluRs）是一个独特的亚类，以强制性二聚体形式发挥作用，并具有一个包含配体结合位点的大型胞外结构域。近年来对mGluRs的结构研究取得了进展，加深了对其激活过程的理解。然而，mGluRs在激活和调节过程中大规模构象变化的传播机制仍不清楚。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种强大的技术，可用于在单个蛋白质水平上可视化并量化生物分子的结构动态。为了可视化mGluR2激活的动态过程，研究人员开发了基于非天然氨基酸（UAA）插入的荧光构象传感器，实现了对蛋白质的位点特异性标记，同时不干扰受体的天然结构。本文所述方案详细说明了如何开展这些实验，包括新型UAA标记方法、样品制备以及smFRET数据的采集与分析。这些策略具有普适性，可推广应用于研究多种膜蛋白的构象动态。

基于非天然氨基酸的FRET传感器的表达与荧光标记 
本文讨论了在mGluR2（548UAA）的CRD结构域中插入非天然氨基酸（AZP）并进行荧光标记的代表性结果11。如前所述，为将AZP插入mGluR2，需共表达经改造的翻译系统，该系统包括修饰的tRNA合成酶及其互补tRNA（pIRE4-Azi），同时共表达通过定点突变在第548位引入琥珀密码子的mGluR2（图2A、B）。AZP可通过铜催化的环加成反应被氰基染料标记（图2C），从而实现548UAA在细胞质膜上的有效标记（图2D）。为验证548UAA全长蛋白的翻译以及二聚体受体的完整性，对表达经Cy5标记的548UAA的HEK293T细胞裂解液进行了SDS-PAGE&#160;电泳分析。结果显示在250 kDa处出现单一蛋白条带，与全长二聚体mGluR2的位置一致（<strong cl...

本研究介绍了一种利用位点特异性标记技术在G蛋白偶联受体（GPCRs）上开展单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验的详细操作流程 通过 非天然氨基酸（UAA）整合。本方案提供了单分子FRET样品制备、实验操作及数据分析的逐步指导。

利用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

细胞对外部信号作出反应的能力对其发育、生长和存活至关重要。为响应来自……的信号，细胞需……

在此，我们采用单分子FRET技术，并通过天然氨基酸掺入实现位点特异性蛋白质标记，以研究mGluR2的构象动态。该方法可在不干扰蛋白质结构的前提下研究其动态特性。原子结构仅能提供蛋白质的静态图像。然而，单分子FRET技术使我们能够在实时和溶液环境中观察蛋白质运动的完整范围。该方法可用于研究任何蛋白质的动力学过程。此外，通过引入天然氨基酸，还可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用以及合成受体的构建。样品加载和成像优化需要耐心和练习。首先，用记号笔在玻片上标记需要钻孔的位置。将玻片浸入水中，使用Dremel工具在玻片上钻出小孔。将载玻片和盖玻片置于丙酮中，在23摄氏度的水浴超声仪中超声处理30分钟。倒掉盛放载玻片和盖玻片的容器中的丙酮。用清水充分冲洗，并在5摩尔的氢氧化钾溶液中超声处理30分钟。接着，用水冲洗载玻片和盖玻片，并在甲醇中超声处理两分钟。将载玻片和盖玻片浸泡在装有甲醇的容器中，直至进行氨基硅烷化步骤。将新配制的氨基硅烷化混合液倒入盛有载玻片和盖玻片的容器中。将载玻片和盖玻片在氨基硅烷化混合液中孵育、超声处理，然后再孵育，之后弃去溶液。接着，用甲醇清洗玻璃瓶，然后注入水。随后用水冲洗载玻片。用气流吹干，并将它们放入组装盒中。在载玻片上加入60毫升PEG化溶液，然后在其上方放置盖玻片。储存前标记非PEG化的一侧。孵育后，轻轻拆开装置，用水冲洗载玻片和盖玻片。然后用空气吹干，并将它们放入无菌的50毫升离心管中，使PEG修饰的表面彼此相对。用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代HEK 293T细胞后，将细胞接种到聚-L/D-赖氨酸包被的盖玻片上。将细胞培养于添加了AZP的培养基中，并表达代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）。随后使用转染试剂对细胞进行转染，并在转染后24小时更换为新鲜的含AZP培养基。在使用炔烃氰染料标记前20分钟，用预热的记录缓冲液（RB）清洗盖玻片两次，并将其置于不含AZP的预热标准培养基中。然后移除标准培养基，并用RB洗涤细胞，再加入 freshly prepared 标记溶液。在37°C避光孵育15分钟。孵育结束后，移除标记溶液。用 RB 缓冲液将含有转染细胞的盖玻片洗涤两次，并重新悬浮于相同的培养基中。接着，在 4 摄氏度下以 1,000 g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，然后将沉淀重悬于 80 至 130 微升裂解液中。通过移液吹打使沉淀充分分散。然后用锡箔纸包裹，在 4 °C 的摇床上放置 30 分钟至 1 小时，以裂解细胞。在 20,000 g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟，沉淀不溶性组分。然后将上清液转移至新的预冷离心管中，并置于冰上保存。从冷冻箱中取出载玻片和盖玻片，置于暗处室温下回温。通过将双面胶带条夹在载玻片与盖玻片之间组装流动池，确保聚乙二醇化（PEGylated）表面朝内形成流动池的内壁。使用移液器吸头按压盖玻片，确保胶带与盖玻片和载玻片紧密贴合。在载玻片边缘涂抹环氧树脂。向每条泳道加入40微升500纳米浓度的NeutrAvidin，并在湿润避光盒中孵育。两分钟后，用100微升T50缓冲液洗涤每个通道泳道。然后加入20纳摩尔的生物素化抗体溶液，孵育30分钟，随后每孔用200微升T50缓冲液洗涤。打开计算机和显微镜，接着开启激光器进行预热。接下来，打开EMCCD相机并启动软件。将样品室安装到显微镜载物台上，逐渐加入蛋白质样品，使每视野约有400个分子。用100微升成像缓冲液洗涤样品室，缓冲液中需添加0.3单位原儿茶酸3,4-双加氧酶。调节增益、采集速率和激光功率，以在供体和受体通道中均能检测到单分子荧光信号。随后激发供体，并持续采集时间轨迹，直至视野中80%的供体分子发生光漂白。在视频结束时，打开640纳米激光器直接激发受体，直至部分分子发生光漂白。更换视野，重复供体和受体激发的步骤，每种条件下采集三段视频。在选择用于单分子FRET轨迹的颗粒时，应挑选供体和受体信号总强度随时间保持稳定的轨迹，随后从中选择供体与受体强度呈反相关变化的轨迹。选择显示单步光漂白且轨迹长度超过五秒的供体和受体分子。计算FRET效率缺失值。最后，按照论文中描述的步骤，通过隐马尔可夫模型（HMM）鉴定构象状态。通过铜催化的环加成反应实现了氰基染料对AZP的标记，从而有效标记了548UAA的质膜，细胞表面群体被供体和受体荧光团标记。在SDS-PAGE电泳中，表达548UAA的HEK 293T细胞中观察到一条250千道尔顿的单一条带，与全长二聚体mGluR2的位置一致。此处展示了供体和受体漂白事件中多个短寿命和长寿命的代表性选择性轨迹。使用隐马尔可夫模型（HMM）分析确定构象状态。从理想化的拟合结果中提取离散FRET状态之间的转换，并绘制为转换密度热图。理想化的FRET轨迹还可提供每种已识别构象的停留时间信息。此处展示了单分子在供体和受体通道中的轨迹。此外，单分子FRET揭示了mGluR2半胱氨酸富集区的四种构象状态。高效的峰保留对于单分子下拉实验至关重要，因此在该过程中应格外注意。此外，应在成像前立即加入氧清除剂。该标记方法及单分子FRET实验已应用于多种受体，为受体激活机制及受体功能调控提供了新的见解。

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生物化学

使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

我们将介绍一种在单细胞水平上结合荧光技术测量膜蛋白离子转运动力学及构象变化位点特异性分析的方法。该技术适用于离子通道、转运蛋白和离子泵，并可用于确定蛋白质亚基之间的距离限制。...

研究膜蛋白的构象动力学 原位 采用位点特异性荧光标记

荧光共振能量转移（FRET）显微技术是一种利用多种生物传感器作为报告分子，实时监测活细胞内信号事件的强有力方法。本文介绍如何使用市售组件构建定制化的落射荧光FRET成像系统，以及如何利用该系统开展FRET实验。...

使用单分子生物传感器通过FRET显微镜实时监测活细胞中的信号事件

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

检测G蛋白偶联受体对G蛋白选择性激活的简便方法，目前仍是细胞信号转导领域尚未解决的挑战。本文通过将G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白肽段成对锚定，构建了基于福斯特共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活细胞中以可控浓度探测构象变化。...

使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

本文介绍了一种用于单分子水平高精度FRET实验的方案。此外，该方法还可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域中的三种构象状态。精确测定距离是基于FRET实验构建结构模型的第一步。...

单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。...

自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。...

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使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

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单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

学习使用单分子FRET和位点特异性标记技术研究mGluR2的构象动力学。该方法可在不扰动蛋白质结构的情况下实时可视化蛋白质运动，为研究蛋白质相互作用和合成受体工程提供新途径。

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