使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

在这里，我们使用单分子FRET和通过天然氨基酸掺入的位点特异性蛋白质标记来研究mGluR2的构象动力学。这允许在不干扰蛋白质结构的情况下研究蛋白质动力学。原子结构提供了蛋白质的静态图像。

然而，单分子FRET使我们能够实时可视化蛋白质运动和解决方案的全范围。这种方法可用于研究任何蛋白质的动力学。此外，天然氨基酸掺入可用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用以及合成受体的工程。

样品装载和成像优化需要耐心和实践。首先，用记号笔标记要在载玻片上钻的孔。使用Dremel在滑轨上钻小孔，同时将滑轨浸入水中。

在23摄氏度的浴超声仪中用丙酮超声处理载玻片和盖玻片30分钟。从载玻片和盖玻片罐中丢弃丙酮。用水彻底冲洗，并在五摩尔氢氧化钾中超声处理30分钟。

接下来，用水冲洗载玻片和盖玻片，并在甲醇中超声处理两分钟。将罐子装满甲醇，直到氨基盐碱化步骤。将新鲜制备的氨基盐碱化混合物倒入载玻片和盖玻片罐中。

在丢弃溶液之前，在氨基盐碱化混合物中孵育，超声处理并再次孵育载玻片和盖玻片。接下来，在装满水之前用甲醇清洗罐子。然后用水冲洗载玻片。

用空气吹干，然后将它们放入组装盒中。将60毫升聚乙二醇化溶液涂在载玻片上，并在其顶部放置盖玻片。储存前标记非聚乙二醇化的一面。

孵育后，轻轻拆卸，并用水冲洗载玻片和盖玻片。然后通过吹风干燥它们，并将它们放入无菌的50毫升管中，聚乙二醇化表面彼此背对。用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代HEK 293T细胞后，将细胞接种在聚-L/D-赖氨酸盖玻片上。

将标准培养基与AZP补充培养基一起放置，用于生长细胞和代谢性谷氨酸受体2或mGluR2表达。然后用转染试剂转染细胞，孵育24小时，然后用新鲜的AZP补充培养基更换培养基。用炔烃花青染料标记前20分钟，用温热的记录缓冲液或RB清洗盖玻片两次，并将其放入不含AZP的温热标准培养基中。

然后取出标准培养基并用RB洗涤细胞，然后加入新鲜制备的标记溶液。在黑暗中在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，取出标记溶液。

用RB洗涤含有转染细胞的盖玻片两次，并在同一培养基中重新悬浮。接下来，通过在 4 摄氏度下以 1， 000 g 旋转 5 分钟来沉淀细胞，并在将沉淀重新悬浮在 80 至 130 微升裂解溶液中之前除去上清液。通过移液打破沉淀。

然后用箔纸包裹，并将其放在四摄氏度的摇杆上 30 分钟到 1 小时以裂解细胞。通过在20， 000g和4摄氏度下离心20分钟来沉淀不溶性部分。然后将上清液转移到新鲜的冷管中，并将其储存在冰上。

从冰箱中取出载玻片和盖玻片，让它们在室温下在黑暗中加热。通过将双面胶带夹在载玻片和盖玻片之间来组装腔室，确保聚乙二醇化表面形成流动腔的内部。使用移液器吸头按压盖玻片，确保胶带与盖玻片和玻片接触。

将环氧树脂涂在幻灯片的边缘。将40微升500纳摩尔的NeutrAvidin应用于每个泳道，并在加湿的暗盒中孵育。两分钟后，用100微升T50缓冲液洗涤每个腔室通道。

然后加入20纳摩尔生物素化抗体溶液，孵育30分钟，然后用每泳道200微升T50缓冲液洗涤。打开电脑和显微镜。然后打开激光进行预热。

接下来，打开EMCCD相机，然后打开软件。将样品室安装在显微镜载物台上，并逐渐添加蛋白质样品，以实现每个视场约400个分子。用100微升补充有0.3单位原儿茶酸3，4-双加氧酶的成像缓冲液洗涤腔室。

调整增益、采集速率和激光功率，以检测供体和受体通道中的单分子荧光信号。然后激发供体，并获得时间轨迹，直到视野中80%的供体分子被光漂白。在电影的最后，打开640纳米激光直接激发受体，直到一些分子被光漂白。

改变视野，并重复激发供体和受体的步骤，以每个条件收集三部电影。要选择粒子拾取的单分子FRET迹线，请选择供体和受体迹线的总强度随时间稳定的迹线。然后选择供体和受体强度具有反相关变化的迹线。

选择显示单步光漂白和迹线长度超过五秒的供体和受体分子。计算FRET缺陷。最后，按照手稿中描述的步骤，通过隐马尔可夫建模（HMM）识别构象状态。

通过铜催化的环加成反应通过青染料标记AZP，并导致548UAA的有效质膜标记，细胞表面群体用供体和受体荧光团标记。在SDS-PAGE电泳中，在表达548UAA的HEK 293T细胞中观察到250千道尔顿的单条带，这与全长二聚体mGluR2一致。此处显示了供体和受体漂白事件的多个短寿命和长寿命的代表性选择性迹线。

使用HMM分析鉴定构象状态。从理想拟合中提取离散FRET状态之间的转换，并绘制为过渡密度热图。理想化的FRET迹线还可以为每个已识别的确认提供停留时间信息。

此处显示了单分子与供体和受体通道的迹线。此外，单分子FRET揭示了富含mGluR2半胱氨酸的结构域的四种构象状态。高效的峰保存对于单分子下拉至关重要，在此过程中应小心谨慎。

此外，应在影像学检查前立即添加除氧剂。该标记方法和单分子FRET实验已应用于多种受体，为受体激活和调节受体功能的机制提供了新的见解。