培养小胶质细胞的新生和成年的中枢神经系统

我们概述方法从新生儿大脑皮层和脊髓成人的可行的小胶质细胞的高效和快速隔离/文化。解剖和电镀皮质小胶质细胞可以在90分钟内完成，与随后发生〜10天的初始剥离后的小胶质细胞的收获。

该程序的总体目标是从新生小鼠皮层或成年小鼠的脊髓中分离原代小胶质细胞。这是通过首先切除出生后第 0 天或第 2 天的小鼠幼崽或成年脊髓的大脑来实现的。接下来，从新生儿组织中采集皮质或消化脊髓组织。

然后将皮质和脊髓组织细胞培养直至实验使用。最终，收获的新生儿和成人小胶质细胞可以通过免疫荧光显微镜分析。与现有方法（例如为混合皮质板摇动小胶质细胞）相比，我们的新生儿小胶质细胞培养方案的主要优势在于细胞很容易恢复到静止状态，并且可以提供更准确的体内小胶质细胞行为图片。

在成人脊髓的小胶质细胞中培养的主要优点是，在解剖之前，可以在主要影响成人中枢神经系统的病理学背景下引用细胞。Preco 10 厘米组织培养皿，每毫升含 5 微克聚乙烯酸酯或 PDL，用高压灭菌器水稀释在 37 摄氏度下 3 小时后，吸出 PDL 并在开始新生儿小胶质细胞解剖之前用高压灭菌水清洗板一次。在组织培养通风橱中，在紫外线下干燥板 20 分钟。

然后用一把剪刀去除头部后，用浸泡在 70% 乙醇中的 Kim 湿巾对麻醉的产后第 0 天到两只幼崽的头部进行消毒。将每个板的四个头放入含有冰冷的绞纱缓冲盐水溶液的 10 厘米培养皿中。使用弯曲的镊子，将头部固定在眼窝中，然后使用直的微型镊子小心地去除覆盖在颅骨上的皮肤。

然后从小脑附近开始，去除颅骨，注意不要刺穿或损坏皮质。用小抹刀去除大脑，将器官聚集在含有冰冷 HBSS 的新鲜培养皿中。现在从大脑的腹侧开始。

用微型镊子握住小脑以固定组织，然后在中脑的两侧做两个小切口，不要完全切开组织。轻轻地将中脑和小脑从皮质中梳理成一块，应该形成一个凹形。然后分离孤立的皮层，并将单个皮层的内侧朝上定向，以便进一步解剖。

在新生儿和成人方案中，最复杂的步骤之一是充分去除脑膜。去除海马体也很困难。在新生儿方案中，我们使用冰冷的汉克斯缓冲盐水溶液来硬化组织，并使用缓慢、有条不紊的解剖程序来最大限度地减少切碎。

去除位于嗅球对面的新月形海马体，该海马体在皮层的尖端表现为一个小结节。然后将皮层翻转过来观察背侧。接下来，以嗅球为起点，从皮层中取出所有脑膜和嗅球本身。

然后将解剖的皮质拉入含有 14 毫升冰冷 HBSS 的 15 毫升锥形管中。现在从 Cordis 吸出 HBSS，并使用 P 1000 移液器吸头摩擦皮质几次。向组织中加入 4 毫升胰蛋白酶 EDTA，然后在 37 摄氏度下孵育组织。

15 分钟后，用 4 毫升完全小胶质细胞培养基终止酶促反应，然后在 1000 倍 G 和室温下离心细胞悬液 5 分钟。用 4 毫升完全培养基复苏第二次洗涤后，将细胞沉淀悬浮在 10 毫升完全小胶质细胞培养基中，然后通过 40 微米网状细胞过滤器过滤细胞悬液。最后，将细胞以每 10 毫升小胶质细胞培养基 8 个皮质的密度接种在一个 PD L 涂层的 10 厘米组织培养板中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。

细胞培养 10 天后，向组织培养板中加入 400 微升 60 毫摩尔利多卡因的 HBSS 溶液，分离小胶质细胞，并在室温下孵育板 10 至 15 分钟。然后收集重悬的细胞。用 HBSS 冲洗板一次并收集洗涤液以回收任何残留的小胶质细胞。

接下来，向细胞悬液中加入 0.5 摩尔 EDTA 至终浓度为 5 毫摩尔，然后旋转细胞复苏。将上颚悬浮在含 1% FBS 的一毫升 DMEM 中，并通过 trian 蓝排除法确定活细胞的数量。然后以所需的实验密度培养细胞。

例如，对于通过免疫荧光显微镜分析，将细胞以每 18 毫米盖玻片的 2.5 倍 10 至第四个细胞进行铺板，用于成人小胶质细胞组织收集。首先使用 70% 乙醇清洁安乐死成年小鼠的脊柱。然后用剪刀剪开脊髓上方的皮肤，然后继续从 T 1 区到 T 12 区剪断脊髓。

从脊髓两侧切下剩余的肌肉，然后用一只手的指尖轻轻握住脊髓。使用微型剪刀慢慢剪断椎骨，不要刺穿脐带。然后用一对微型镊子慢慢提取脊髓，将脊髓浸入含有冰冷 HBSS 的培养皿中，然后在显微镜下去除所有可见的脑膜。

现在将脊髓切成不粗于两毫米的横向段，以促进有效消化，然后将碎片转移到含有 1 毫升冰冷 HBSS 的 15 毫升锥形管中。为了消化脊髓组织碎片，首先要从脊髓组织中吸出 HBS，注意不要干扰组织。然后将组织在 37 摄氏度的 1 毫升胰蛋白酶中孵育。

30 分钟后，去除胰蛋白酶并加入 3 mL 含血清的原代小胶质细胞培养基以停止酶消化。上下吹打几次以去除组织后，通过 40 微米细胞过滤器过滤细胞悬液。然后将等分试样的细胞悬液与等体积的 DPI 混合，并在荧光显微镜下对细胞进行计数以确定活细胞总数。

最后，将解离的脊髓组织细胞以适当的实验密度接种在 PD L 涂层板中。铺板后 4 小时进行完整的培养基更换，以去除多余的细胞碎片。在第一组图像中，静息和活化的小胶质细胞在接种后 24 小时显示，小胶质细胞表现出分枝或生锈的形态暴露于引发试剂细菌脂多糖导致小胶质细胞形态发生变化，随着细胞被激活，形状更加变形虫。

眼球 1 对巨噬细胞和小胶质细胞表面蛋白具有特异性标记物进行染色，呈绿色，有助于细胞的可视化。明场图像显示整体细胞群，蓝色的 DPI 突出显示了细胞核并指示培养物的纯度。在这张从成年小鼠脊髓中分离的细胞的代表性图像中，获得了大约 7 乘以 10 到第 5 个活细胞。

结合明场和荧光显微镜设置，以可视化 DAPI 阳性细胞以及血细胞计数仪网格，以实现准确的细胞计数。大约两天后，小胶质细胞完全附着在 PD L 包被的培养板上。在这里的培养中，从 Mac 绿小鼠脊髓中分离的小胶质细胞，在小胶质细胞和巨噬细胞启动子 CSF one R 的控制下表达 GFP，显示在明场图像中。

蓝色箭头表示的小胶质细胞和红色箭头表示的星形胶质细胞，一旦掌握，就可以观察到。按照此程序，该技术可以在大约一个小时内完成。可以进行其他方法，如文化适应、小胶质细胞与其他细胞类型，以研究小胶质细胞对其他细胞的影响。

按照此程序，您应该很好地了解如何进行培养新皮层和成体脊髓细胞所需的精细解剖，并将这些细胞用于下游应用。