Name: 培养小胶质细胞的新生和成年的中枢神经系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习从新生和成年小鼠中枢神经系统中分离和培养小胶质细胞的方法。该方案可在90分钟内完成皮质小胶质细胞的解剖和接种，约10天后收获细胞，使细胞恢复静息状态，为研究神经炎症和神经退行性疾病提供更准确的体外模型。

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感谢Tsirka实验室成员提供的建议和有益的评论。本研究由以下资助项目支持：SET获得R01NS42168，RB获得12PRE12060489，LT获得NSF-3MT IGERT和Turner博士论文奖学金，JCN获得NSF-3MT IGERT。

1. 解剖（第0天）
<ol>
	<li>通过低温诱导 p0-2 小鼠幼崽麻醉。用浸有 70% 乙醇的 Kimwipe 擦拭幼崽头部，以消毒组织。</li>
	<li>使用剪刀去除头部，每 10 cm 培养皿使用 4 只幼崽。将头部置于含有冰冻 Hank's 缓冲液的培养皿中。</li>
	<li>使用弯头镊子穿过眼眶固定头部，并用直头显微镊小心去除覆盖颅骨的皮肤。</li>
	<li>用直头显微镊去除颅骨，注意避免刺破或损伤大脑皮层。最有效的方法是从靠近位于头部基部的小脑区域开始去除，因为该区域将被弃去。</li>
	<li>用小刮勺取出脑组织，并将（4 只）脑组织放入盛有冰冻 Hank's 缓冲液的新培养皿中。</li>
	<li>从此时起的所有步骤均使用显微镊，并在解剖显微镜下操作。从脑腹侧开始，通过夹住小脑固定组织，在中脑两侧各做两个小切口。注意不要完全切断组织，因为在此区域皮层覆盖中脑。</li>
	<li>轻柔地将中脑和小脑作为一个整体从两侧皮层中分离出来。两个皮层应呈凹面形状。</li>
	<li>分开两个皮层，将其中一个皮层内侧朝上放置，以便进一步解剖。海马体可能难以观察，但它位于嗅球的对侧，嗅球表现为皮层尖端的一个小结节。</li>
	<li>去除呈新月形的海马体。翻转皮层以观察其背侧。</li>
	<li>以嗅球为起点，从皮层上去除所有脑膜以及嗅球本身。</li>
	<li>解剖好的皮层应放入含有 14 ml 冰冷 Hank's 缓冲盐水的 15 ml 锥形管中。</li>
</ol>
2. 细胞培养（第0天）
<ol>
	<li>在10 cm组织培养皿中加入用无菌水稀释的5 μg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL），37 °C孵育3小时进行预包被。</li>
	<li>吸除PDL溶液，用无菌水洗涤培养皿一次，然后在超净台内紫外线下干燥20分钟。此步骤应在解剖操作前立即进行。</li>
	<li>从含有每4个脑组织皮层的离心管中吸除Hank's缓冲液，每管加入4 ml 1×胰蛋白酶/EDTA溶液，使用p1000枪头反复吹打组织，随后将离心管置于37 °C培养箱中孵育15分钟。</li>
	<li>每管加入4 ml完全小胶质细胞培养基以终止酶消化反应，混匀后在1.5K rpm条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用4 ml完全培养基重复洗涤一次。将细胞重悬于10 ml完全小胶质细胞培养基（DMEM含10% FBS、1%丙酮酸钠、0.08%庆大霉素）中，经40微米孔径的细胞滤网过滤。</li>
	<li>按每10 ml培养基接种8个皮层组织的密度，将细胞接种至10 cm组织培养皿中，置于37 °C、5% CO2的组织培养箱中培养（参见成年小胶质细胞实验方案）。</li>
</ol>
（第3天）
<ol>
	<li>用完全小胶质细胞培养基更换所有细胞培养皿中的培养液。</li>
</ol>
（第 10 天）
<ol>
	<li>向10 cm组织培养板的培养基中加入400微升60 mM利多卡因HBSS溶液（用于解离小胶质细胞），室温（RT）孵育10–15分钟。</li>
	<li>收集培养板中的培养基/细胞悬液，并用Hank's缓冲液洗涤培养板一次。收集洗涤液以回收残留的小胶质细胞。</li>
	<li>向细胞悬液中加入5 mM EDTA（pH 8.0），使其终浓度达到50 μM，或按1/100比例稀释。</li>
	<li>以1,000 × g（1,500 rpm）离心5分钟，沉淀细胞，然后重悬于1 ml含1% FBS的DMEM培养基中。</li>
	<li>计数活细胞数量（参照成年小胶质细胞3.1/3.2步骤），按所需实验密度将细胞分种至组织培养板中。通常从一个含有4个脑皮层组织的10 cm培养板中可收获约1×106个小胶质细胞。进行免疫荧光染色时，建议每18 mm盖玻片接种2.5×104个细胞。</li>
	<li>使用前至少静置24小时，使小胶质细胞充分恢复至其分支状静息状态。</li>
</ol>
实验方案文本：（成年小胶质细胞）
1. 组织采集
<ol>
	<li>将组织培养板用多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine, PDL）在 37 °C 下包被 3 小时，或在 4 °C 下过夜。使用前立即用高压灭菌水洗涤一次。</li>
	<li>通过 CO2 窒息法处死小鼠，并确认动物死亡。用 70% 乙醇清洁脊髓区域。</li>
	<li>使用剪刀剪开脊髓上方的皮肤；然后从 T1 至 T12 区域将脊髓剪出。去除附着在脊髓两侧的残余肌肉组织。</li>
	<li>用显微剪刀缓慢剪开椎骨，同时用手指轻轻夹持脊髓组织。注意避免刺破脊髓，因其组织非常柔软。使用显微镊子缓慢将脊髓完整取出。</li>
	<li>将脊髓置于含有冰上预冷的 HBSS 的培养皿中。在体视显微镜下，用显微镊子去除所有可见的脑膜组织。</li>
	<li>将脊髓切成足够小的横向片段，以产生多个组织块。为确保有效消化，每个片段厚度不应超过 2 mm。将脊髓组织块转移至含有 1 ml 冰上预冷 HBSS 的 15 ml 锥形管中。在进行消化步骤前，将管子置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 组织消化
<ol>
	<li>从含有脊髓组织的15 ml锥形管中吸除HBSS。注意不要吸走任何组织块。</li>
	<li>加入1 ml胰蛋白酶溶液（含2.5 g/L辐照猪胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA的HBSS），于37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>为终止消化，移除胰蛋白酶溶液，并加入3 ml含血清的原代小胶质细胞培养基以停止酶消化反应。</li>
	<li>用移液器反复吹打使组织解离，然后使用40 μm细胞滤网过滤细胞悬液。</li>
</ol>
3. 细胞计数与铺板
<ol>
	<li>将细胞悬液与 DAPI 溶液等体积混合。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>以每毫升 5–7×105 个细胞的密度接种于多聚赖氨酸包被的 35 × 10 mm 培养皿中。若接种密度过低，即使将细胞培养于面积小于 35 × 10 mm 培养皿的 12 孔板中，也会抑制细胞生长。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小胶质细胞不仅调节中枢神经系统的正常功能，还参与对多种病理状态的炎症反应。小胶质细胞通过功能性突触重塑在维持大脑正常稳态中发挥重要作用15。在神经发生级联过程中，它们参与清除海马齿状回中的神经前体细胞4, 16。因此，有必要建立一种可用于研究新生期和成年期小胶质细胞的培养体系，以覆盖从发育到成年整个过程中小胶质细胞所承担的多种不同功能。我们提出了一种快速且高效的方法，用于从成年脊髓和新生脑组织中培养小胶质细胞。在成年组织中获得的细胞悬液中，小胶质细胞占比达70%，其余主要为星形胶质细胞；而新生小胶质细胞培养物的纯度接近100%。
	鉴于星形胶质细胞在调控小胶质细胞活化状态中的作用17-19，优化培养条件以提高培养物纯度显得尤为重要。尽管将细胞悬液与等体积的DAPI Fluoromount混合可实现准确的细胞计数，但该方法无法区分小胶质细胞与其他细胞类型。为了提高成年小胶质细胞制备的纯度，可将来源于MacGreen小鼠的细胞悬液与表达GFP的髓系细胞共同孵育GFP包被的Dynabeads20。另一...

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，其结构和功能最接近外周巨噬细胞1。最近研究表明，出生后的小胶质细胞来源于原始髓系前体细胞，并在胚胎发育第八天之前即已生成，这一发现颠覆了以往认为出生后的造血前体细胞是成年大脑中小胶质细胞来源的观点2。小胶质细胞在多种神经系统疾病中发挥关键作用，能够通过释放促炎性或抗炎性细胞因子快速响应感染或损伤3。因此，小胶质细胞构成了中枢神经系统中一个独立的功能单元，可通过干预调控疾病进程。建立稳定且可重复的新生期或成年小胶质细胞分离与培养方法，对未来的研究具有重要意义。
小胶质细胞已被证实是多种脑部病理过程中的关键参与者。近年来研究发现，小胶质细胞在正常脑发育和功能中也发挥着重要作用，例如通过吞噬海马齿状回中过量的神经前体细胞 1, 4小胶质细胞还可调节多种影响脊髓的神经系统疾病，例如多发性硬化症（MS）、神经病理性疼痛和脊髓损伤。 5-7脊髓小胶质细胞与脑小胶质细胞在响应激活信号时表现出不同的反应 8, 9，可能是由于局部环境的差异所致。因此，建立一个合适的 体外 用于培养和研究脊髓小胶质细胞的系统。新生小胶质细胞在受到刺激后产生的促炎性细胞因子一氧化氮显著多于成年细胞 体外 使用 IFN-γ 或 TNF-α 刺激10,11 进一步凸显了在特定疾病背景下研究小胶质细胞时使用成体细胞的必要性。
我们在实验室中培养新生小胶质细胞所采用的方案是近期方法的一种改进，该方法通过振荡混合胶质细胞培养物，以期将小胶质细胞从细胞培养瓶表面分离下来 12. 我们还描述了一种基于Yip首次报道的方案，从成年小鼠脊髓中培养小胶质细胞的方法， 等13该方法相较于其他现有方案，能够更快地培养成体细胞。 14最终获得的细胞悬液中，70%为小胶质细胞，其余为星形胶质细胞。尽管本方法培养物的纯度低于其他已发表的方法 13该培养体系可用于研究小胶质细胞在体外对多种激活刺激的反应，也适用于主要影响脊髓且以强烈炎症反应为主要特征的疾病研究。
所述所有实验方案均已获得石溪大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

<table><tbody><tr><td>EDTA，5 mM</td><td>Invitrogen</td><td>15567-028</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因，60 mM</td><td>Sigma</td><td>L-5647</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，1×</td><td>Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Cellgro</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Biowittaker</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸，100 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td>按1:20稀释</td></tr><tr><td>HBSS，1×</td><td>Cellgro</td><td>20-023-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

培养来自新生期和成年中枢神经系统的小胶质细胞

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的巨噬细胞样细胞，因此在生理和病理过程中具有至关重要的作用，例如发育过程中的CNS成熟、多发性硬化症以及脊髓损伤。当神经元受到损伤或刺激时，例如在多发性硬化症中观察到的轴突损伤或中风引起的缺血性脑损伤，小胶质细胞可被激活并募集参与反应。这些具有免疫活性的CNS细胞还被认为在非病理条件下参与突触可塑性。我们采用从新生期和成年组织中培养小胶质细胞的实验方案，旨在最大化活细胞数量的同时，尽量减少混杂因素，例如其他CNS细胞类型的存在以及细胞培养中的碎片。我们使用体积较大且易于识别的CNS结构（例如 皮层、脊髓节段），从而使整个过程具有可行性与可重复性。使用成年细胞是替代新生脑小胶质细胞的合适选择，因为许多被研究的病理主要影响出生后的脊髓。这些培养系统还可用于直接检测可能抑制或促进小胶质细胞激活的化合物的作用。由于小胶质细胞的激活可影响成年CNS中疾病的进程，因此有必要建立体外系统，用于培养和研究新生期与成年期的小胶质细胞。

静息状态和活化状态的小胶质细胞示例见图1。接种后24小时观察小胶质细胞（图1a），呈现分支状（静息）形态。经细菌脂多糖（LPS）这一启动试剂处理后，小胶质细胞形态发生改变，细胞被激活（图1b）。
接种细胞计数的示例如图2所示。由于存在细胞碎片，将DAPI Fluoromount（而非台盼蓝）与等体积的细胞悬液混合后，加入血细胞计数板进行细胞计数，方法见文献4, 13。使用荧光显微镜观察DAPI阳性细胞。采用明场模式有助于准确计数存在的细胞（图2）。每只小鼠脊髓可获得约7×105个细胞。
将细胞接种于PDL包被的35 × 10 mm组织培养皿中。我们发现PDL包被是关键步骤，因为若培养皿未包被，细胞无法贴壁和生长。小胶质细胞在培养约两天后可完全贴附于培养皿表面（图3）。本实验使用了Ma...

我们概述了从新生小鼠大脑皮层和成年小鼠脊髓中高效、快速分离和培养活体小胶质细胞的方法。皮层小胶质细胞的解剖与接种可在90分钟内完成，初次解剖后约10天可进行后续的小胶质细胞收获。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的巨噬细胞样细胞，因此在生理和病理条件下均发挥至关重要的作用。

本实验的总体目标是从新生小鼠的大脑皮层或成年小鼠的脊髓中分离原代小胶质细胞。首先取出出生后第0天或第2天的幼鼠或成年小鼠的脑组织或脊髓组织。随后，从新生小鼠脑组织中分离大脑皮层，或对脊髓组织进行消化处理。随后将皮层和脊髓组织细胞进行培养，直至实验使用。最终，收获的新生期和成年小胶质细胞可通过免疫荧光显微镜进行分析。与现有方法（如对混合皮层培养板进行振荡分离小胶质细胞）相比，本研究所采用的新生期小胶质细胞培养方案的主要优势在于，细胞能够迅速恢复至静息状态，从而更准确地反映小胶质细胞在体内的行为特征。成年脊髓小胶质细胞培养的主要优势在于，这些细胞可用于研究主要影响成年中枢神经系统的病理过程。在解剖前，使用5微克/毫升的多聚赖氨酸（PDL）溶于高压灭菌水，预先包被10厘米组织培养皿。在37摄氏度孵育3小时后，吸除PDL溶液，并在开始新生小胶质细胞解剖前，用高压灭菌水洗涤培养皿一次。随后在组织培养超净台内，用紫外灯照射培养皿20分钟以干燥。然后用剪刀取下出生后第零至第二天幼鼠的头部，再用浸有70%乙醇的无尘纸擦拭头部进行消毒。将四个头部置于含有冰冻Hanks平衡盐溶液的10厘米培养皿中，每皿四个。使用弯头镊子通过眼眶固定头部，然后用直头显微镊子小心去除覆盖颅骨的皮肤。然后从靠近小脑处开始，去除颅骨，注意不要刺破或损伤脑皮层。使用小刮勺将脑组织取出，并置于含有冰冷HBSS的新鲜培养皿中。现在从脑的腹侧开始操作。用显微镊子夹住小脑以固定组织，然后在中脑两侧各做一个小切口，注意不要完全切断组织。轻轻分离中脑和小脑，使其与大脑皮层整体脱离，形成一个凹面形状。随后将分离出的大脑皮层分开，并将单个皮层内侧朝上放置，以便进一步解剖。在新生期和成年期方案中，最复杂的步骤之一是充分去除脑膜。此外，海马体的去除也较为困难。在新生期方案中，我们使用冰冻的Hanks平衡盐溶液使组织变硬，同时采用缓慢、系统性的解剖程序，以尽量减少组织撕裂。移除位于嗅球对侧的新月形海马体，该海马体在大脑皮层尖端表现为一个小结节。然后将皮层翻转，以观察其背侧。接下来，以嗅球为起点，从皮层上彻底去除所有脑膜以及嗅球本身。然后将解剖出的皮层组织转移至一个含有14毫升冰上预冷的HBSS的15毫升锥形管中。现在吸除Cordis中的HBSS，并使用P1000移液枪头将皮层组织吹打数次。向组织中加入4毫升胰蛋白酶EDTA，随后在37摄氏度下孵育组织。孵育15分钟后，加入4毫升完全小胶质细胞培养基以终止酶反应，然后在室温下以1000 × g离心5分钟，沉淀细胞悬液。用4毫升完全培养基再次洗涤后，将细胞沉淀重悬于10毫升完全小胶质细胞培养基中，随后通过40 µm孔径的细胞筛网过滤细胞悬液。最后，将细胞以每10毫升小胶质细胞培养基接种八个脑皮层组织的密度，接种于经多聚-L-赖氨酸（PD-L）包被的10厘米组织培养皿中，并在37°C、5% CO₂条件下培养。细胞培养10天后，向培养板中加入400微升含60毫摩尔利多卡因的HBSS溶液，将培养板在室温下孵育10至15分钟，使小胶质细胞脱落。随后收集重悬的细胞。用HBSS洗涤培养板一次，并收集洗液以回收残留的小胶质细胞。接着，向细胞悬液中加入0.5摩尔的EDTA，使其终浓度为5毫摩尔，然后离心收集细胞。将细胞重悬于1毫升含1% FBS的DMEM培养基中，通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。随后将细胞以所需的实验密度进行培养。例如，若需通过免疫荧光显微镜进行分析，应将细胞以每18毫米盖玻片2.5 × 10⁴个细胞的密度进行接种，用于成年小胶质细胞组织的收集。首先，使用70%乙醇清洁已处死成年小鼠的脊柱。然后使用剪刀剪开脊髓上方的皮肤，并从T1至T12区域将脊髓剪出。将脊髓两侧残留的肌肉组织剪除，然后用一只手的指尖轻轻夹住脊髓。使用显微剪缓慢剪开椎骨，注意不要刺破脊髓。接着用显微镊子缓慢取出脊髓，将其浸入含有冰冻HBSS的培养皿中，随后在显微镜下去除所有可见的脑膜组织。现在将脊髓切成横行节段，厚度不超过两毫米，以利于高效消化，然后将组织碎片转移至含有1毫升冰上预冷的HBSS的15毫升锥形管中，并保持在冰上。为消化脊髓组织碎片，首先吸除脊髓组织中的HBS，注意不要扰动组织。随后将组织在37摄氏度下用1毫升胰蛋白酶孵育。30分钟后，移除胰蛋白酶，并加入3毫升含血清的原代小胶质细胞培养基以终止酶消化。用移液器轻轻吹打数次使组织脱落，然后将细胞悬液通过40微米细胞滤网过滤。随后，取部分细胞悬液与等体积的DPI混合，在荧光显微镜下计数，以确定总活细胞数量。最后，将解离的脊髓组织细胞以适当的实验密度接种至多聚赖氨酸（PD L）包被的培养板中。接种后4小时进行完全换液，以去除多余的细胞碎片。在第一组图像中，展示了接种后24小时的静息态和激活态小胶质细胞：小胶质细胞表现出分枝状或“锈蚀”样形态；经细菌脂多糖（priming试剂）刺激后，小胶质细胞形态发生改变，呈现更明显的阿米巴样形态，表明细胞已被激活。眼球经一种特异性标记巨噬细胞和小胶质细胞表面蛋白的染色剂处理后呈现绿色，有助于细胞的可视化观察。明场图像显示了整体的细胞群体，而蓝色的DPI则突出显示细胞核，并指示培养物的纯度。在此幅从小鼠成年脊髓分离细胞的代表性图像中，共获得约7 × 10⁵个可存活细胞。将明场与荧光显微镜设置结合，以同时观察DAPI阳性细胞及血细胞计数板网格，实现准确的细胞计数。小胶质细胞在约两天后完全贴附于PD-L包被的培养板上。本培养图示显示了来自Mac green小鼠脊髓的小胶质细胞，这些小鼠在小胶质细胞和巨噬细胞特异性启动子CSF1R的调控下表达GFP，图中为明场图像。掌握后，可观察到由蓝色箭头指示的微胶质细胞和由红色箭头指示的星形胶质细胞。按照本方案，该技术可在约一小时内完成。也可采用其他方法，例如将微胶质细胞与其它细胞类型共培养，以研究微胶质细胞对其他细胞的影响。通过本实验步骤，您应能充分掌握培养新皮质及成年脊髓细胞所需精细解剖操作的方法，并能够将这些细胞应用于后续实验。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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培养来自新生期和成年中枢神经系统的小胶质细胞

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