用球形发芽法评价 Hemangioblastoma 新生血管的体外性能的综合程序

本实验的总体目标是在体外使用球状体发芽测定评估推定的血管母细胞瘤新生血管形成的性能。该方法可以帮助回答血管生成领域的关键问题，例如肿瘤血管生成。该技术的主要优点是，在体外评估经典肿瘤血管生成存在于血管母细胞瘤中并且它在血管母细胞瘤中生长的综合程序的产物。

该技术的含义延伸到血管母细胞和脉管重建的治疗，因为结果突出了血管母细胞新生血管形成的复杂性，这表明这种常见的血管生成形式只是一种互补机制。因此，这种方法可以为血管母细胞或新生血管形成的研究提供见解。它也可以应用于某些实体瘤中的肿瘤、血管生成和血管生成相关应用，例如玻璃瘤中的肿瘤血管生成模拟。

这种方法的真正演示至关重要，因为这些纵的内皮细胞球状体步骤的产生很难学习。因为合适的条件很重要。首先，在补充有 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中培养 HUVEC 内皮细胞。

然后，将培养物保持在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳中。接下来，为了合成 shRNA 片段，用 ApaI 和 EcoRI 限制性内切酶消化质粒。然后向消化的质粒中加入正向和反向寡核苷酸、10x NEB 缓冲液和双蒸水，最终体积为 50 μL。

加入所有试剂后，将混合物在 98 摄氏度下加热 4 分钟。然后，在几个小时内逐渐冷却至室温。使用 T4 连接酶连接退火的寡核苷酸和质粒。

将试管在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将 5 μL 连接混合物添加到 25 μL DH5alpha 感受态细胞中。在 500 μL DMEM 培养基中，加入慢病毒载体或加扰载体，以及其他包装质粒。

然后，将慢病毒混合物在 37 摄氏度下孵育 25 分钟。孵育后，将 7 mL DMEM 培养基添加到加扰或慢病毒混合溶液中。在 10 cm 培养皿中，在不含胎牛血清的 DMEM 培养基中培养 293FT 细胞。

向培养皿中的 293FT 细胞中加入 1 毫升慢病毒或加扰溶液。六小时后，从培养皿中吸出旧培养基。然后，用含有 10% 胎牛血清的新鲜 DMEM 培养基替换旧培养基。

48 小时后，收集培养基。在慢病毒培养基中转移 HUVEC 内皮细胞并维持 72 小时。接下来，向 HUVEC 细胞培养基中加入每毫升 2 微克嘌呤霉素。

最后，将培养物再孵育 24 小时。第二天，添加 1 毫升胰蛋白酶 EDTA 以胰蛋白酶消化 HUVEC 细胞。然后将胰蛋白酶消化的细胞悬液重悬于含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。

使用单元格计数器计算单元格数。计数后，将细胞接种在 3D 圆底 96 孔板中。接种后，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下连续孵育 72 小时。

36 小时后，用新鲜培养基替换一半的培养基。首先，在 4 摄氏度下解冻凝胶溶液，然后用还原的血清培养基以 1 比 5 的比例稀释。使用微量移液器从 DMEM 培养基中吸取球体。

接下来，用 5 毫升还原血清培养基洗涤球状体。小心地转移悬浮的球状体和稀释的凝胶。在 15 孔板中，嵌入 300 微升球体和稀释凝胶的混合液体。

将板在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下孵育 1 小时。接下来，向单个孔中加入 400 μL 还原血清培养基。为防止蒸发，请用无菌水填充井的周围。

然后，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 100% 湿度下培养细胞一小时。孵育后，吸出旧培养基，向孔中加入 600 μL 还原血清培养基和 1% 的内皮细胞生长补充剂，孵育一天。使用倒置光学显微镜捕获图像。

在这里，使用倒置光学显微镜捕获细胞的球状体发芽，以研究 VHL 基因沉默对内皮细胞血管生成潜力的影响。在慢病毒处理后 12 小时，在对照和 VHL 沉默的内皮细胞中可以看到球状体发芽。接下来，进行统计分析以量化 VHL 基因沉默球体产生的芽的长度。

VHL 沉默组的平均芽长似乎约为 125 微米，而对照组仅为约 65 微米。VHL 静音组的平均累积芽长约为 1250 微米，而对照组为 680 微米。这些结果表明，VHL 沉默组的芽长增加了两倍。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 48 小时内完成。遵循此程序和方法，如毛细血管形成测定，可以回答其他问题。就像探索血管内皮细胞的血管生成能力一样。

在此发展之后，该技术为血管生成领域的研究人员探索肿瘤内部血管形成铺平了道路。观看此视频后，您应该对哪些基因在用于爆炸测定的纵内皮细胞中失去了功能有一个很好的了解。