Name: 用球形发芽法评价 Hemangioblastoma 新生血管的体外性能的综合程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习使用球形发芽法评估血管母细胞瘤新生血管性能的综合实验流程。该方法揭示了经典肿瘤血管生成在HB中的互补机制，为肿瘤血管研究提供重要见解。

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本工作得到上海市科学技术委员会基金（15411951800，15410723200）的资助。作者谨此感谢复旦大学病原微生物学系的文玉梅教授和赵超教授提供的技术协助。

本方法严格遵循复旦大学华山医院伦理委员会批准的指南和规定进行。每一步骤均采取了相应的标准安全措施。示意图请参见图1。
1. 细胞培养与质粒构建
<ol>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）常规培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。</li>
	<li>用ApaI和EcoRI酶切PLKO.1质粒，用于合成shRNA片段。确保VHL shRNA载体的寡核苷酸序列为CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14。</li>
	<li>然后将20 µΜ体系混合：5 µL正向寡核苷酸、5 µL反向寡核苷酸、5 µL 10x NEB缓冲液和35 µL ddH2O（总体积为50 µL）。在98 °C加热4分钟，随后数小时内缓慢冷却至室温。</li>
	<li>将退火后的寡核苷酸与PLKO.1质粒在4 °C下用T4连接酶连接过夜。16小时后，将5 µL连接混合物加入25 µL感受态DH5α细胞中。随后筛选成功连接的质粒，并通过测序验证插入片段。</li>
</ol>
2. 慢病毒包装与感染
<ol>
	<li>总共将 10 µg 的 PLKO.1-shVHL 或 PLKO.1-shScramble 载体、7.5 µg 的包装质粒 psPAX2 和 2.5 µg 的包膜质粒 pMD2.G 混合于 500 µL 无胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，孵育 25 分钟。</li>
	<li>向上述溶液中加入 7 mL 无 FBS 的 DMEM 培养基。</li>
	<li>将 293FT 细胞培养于无 FBS 的 DMEM 培养基中，使用 10 cm 直径的组织培养皿。使用细胞计数仪确保 293FT 细胞数量为 1 × 107。</li>
	<li>将 1 mL 上述制备的溶液加入 293FT 细胞培养基中进行转染。 
	注意： 293FT 细胞系源自 293F 细胞系，并稳定表达 SV40 大 T 抗原，因此是慢病毒生产的合适宿主细胞。</li>
	<li>转染 6 小时后，更换为含 10% FBS 的 DMEM 培养基。</li>
	<li>转染后 48 小时，用移液器收集培养基。 
	注意： 病毒存在于含 10% FBS 的 DMEM 中，死亡细胞漂浮在培养基表面。使用 0.45 µm 无菌滤膜过滤去除死细胞和杂质。通常无需检测感染复数（MOI），因为本实验旨在建立稳定细胞系。在最后一步中，所有未成功感染的活细胞将被嘌呤霉素杀死。shScramble 组和 HUVEC 细胞作为对照组。需确保在 72 小时内，所用浓度的嘌呤霉素可使所有 HUVEC 对照细胞完全死亡。每个孔中的细胞数量应保持一致。</li>
	<li>将 HUVEC 细胞在慢病毒培养基中培养 72 小时，然后向 HUVEC 细胞培养基中加入浓度为 2 µg/mL 的嘌呤霉素，作用 24 小时。以未经任何处理的 HUVEC 细胞作为对照组。确保此时所有对照组细胞均已死亡。 
	注意： 存活的细胞即为 VHL 沉默的稳定细胞系和 shScramble 稳定细胞系。铺板密度为每 96 孔板每孔 5,000 个细胞。</li>
</ol>
3. 内皮细胞球体的生成
<ol>
	<li>用胰蛋白酶消化 HUVECs 细胞，并重悬于含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中。对于一个 10 cm 培养皿中的适量细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>将细胞以每孔 1 × 103 个细胞的密度接种至 3D 圆底 96 孔板中。使用可容纳 0.50 µL 类球体的孔来悬浮类球体。按照制造商说明，使用&#160;细胞计数系统对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下持续培养 72 小时。在此条件下，确保悬浮细胞自动形成细胞类球体。在培养 36 小时后更换一半培养基。</li>
</ol>
4. 体外 血管生成实验
<ol>
	<li>在 4 °C 下解冻凝胶溶液，并按 1:5 的稀释比例用低血清培养基稀释。</li>
	<li>用移液器从 DMEM 培养基中吸取类球体，用 5 mL 低血清培养基清洗类球体后，轻柔谨慎地将其悬浮于稀释后的凝胶中，确保无气泡产生。</li>
	<li>将 300 µL 混合液嵌入 15 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时后，向每孔加入 400 µL 低血清培养基。在孔周围加入无菌水以形成湿润环境，防止蒸发。</li>
	<li>随后，在 37 °C、5% CO2、100% 湿度条件下继续培养 1 小时。</li>
	<li>小心吸除旧培养基，每孔更换为 600 µL 含 1% 内皮细胞生长添加剂的低血清培养基。</li>
	<li>12 小时或 24 小时后，在倒置光学显微镜（40*）下拍摄图像。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>将图像上传至在线图像分析平台以获取芽管长度数据（材料表）。</li>
	<li>在网页上，通过电子邮件创建账户。</li>
	<li>然后点击上传按钮上传图像。</li>
	<li>点击下载按钮下载结果。 
	注意： 软件将生成处理后的图像和数据。数据包含五个部分：累计芽管长度、平均芽管长度、芽管长度的标准差、芽管面积和类球体面积。在处理后的图像中，每个参数以不同颜色标出，以便于识别：红色表示芽管骨架，黄色表示芽管数量，蓝色表示芽管结构，白色表示芽管末端，橙色表示类球体。</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
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<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近期，血管生物学研究的多个领域因对促血管生成内皮细胞的研究而得到推动15。在本文中，我们建立了一种内皮细胞球体出芽技术，作为实验模型，用于研究由经基因操作的内皮细胞中VHL基因功能缺失所引发的血管形成过程，以鉴定血管生成级联反应中的新型候选分子。据我们所知，这是首次报道对内源性修饰内皮细胞的促血管生成效应进行研究。
组织（包括肿瘤组织）的新生血管形成是一个复杂的生理过程，其发生涉及多种细胞和分子机制的协同作用。 通过 发育过程中以及生理和病理条件下的血管生成与血管形成机制12,15,16类球体出芽实验具有复杂的事件级联特征17,18，包括内皮细胞在三维细胞基质培养系统中的自聚集，进而形成出芽并重建毛细血管的三维网络结...

血管母细胞瘤（HBs）是仅发生于人类中枢神经系统（CNS）内的良性血管性肿瘤。此类肿瘤可出现在Von Hippel-Lindau（VHL）病患者中，也可表现为散发性病变。由于该遗传性疾病常导致肿瘤复发和多发病灶，VHL相关血管母细胞瘤（VHL-HBs）难以通过手术完全治愈1。尽管VHL肿瘤抑制基因的失活被认为是VHL-HBs发生发展的根本原因，但HBs的细胞起源（包括新生血管形成）及其演化过程仍存在较大争议2。因此，深入理解HB新生血管的生物学机制，可能为VHL-HBs提供最具前景的抗血管治疗策略提供重要线索。
近期研究表明，血管母细胞瘤（HB）的新生血管形成与胚胎期血管发生过程相似3,4,5。传统的由血管内皮生长因子（VEGF）介导、起源于血管内皮并由VHL基因功能缺失所驱动的血管生成机制，可导致细胞增殖和新生血管形成，但这一机制已受到质疑6。1965年，Cancilla和Zimmerman通过电子显微镜观察发现，血管母细胞瘤起源于内皮组织7。随后研究进一步发现，间质细胞来源于血管形成成分8。1982年，Jurco 等 研究证实，这些间质细胞具有内皮来源特征9。因此，我们提出假设：人血管内皮细胞是HB新生血管形成的原始细胞10。尽管使用来自VHL患者手术标本的原代HB细胞培养更为理想，但我们的前期研究显示，HB原代培养物稳定性较差，难以建立稳定的细胞系3。此外，在三维环境中进行的原代培养无法明确HB新生血管形成的细胞学起源，因其包含了HB血管成分的前体细胞10,11。因此，作为内皮细胞的一种原始且经典的模型，人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）可作为研究血管母细胞瘤的替代性细胞模型。
球形体出芽实验是组织工程学中的一种新模型12,13. 在本文中，一种基于三维胶原的共培养系统 体外 利用球状体出芽实验进行研究，旨在全面评估经典肿瘤血管生成是否存在于肝母细胞瘤（HBs）中，以及其在HBs中的作用。

<table><tbody><tr><td>人脐静脉内皮细胞</td><td>复旦大学IBS细胞中心</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;26400044</td><td></td></tr><tr><td>PLKO.1-puro 载体</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>包装质粒 psPAX2&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>包膜质粒 pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D 圆底 96 孔板</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>基质胶</td><td>BD 生物科学</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>低血清培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15孔板</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>凝胶中的气泡可通过平衡凝胶来减少 &amp;mu;&amp;ndash;将血管生成载玻片置于培养箱中过夜，使用前再进行滑动</td></tr><tr><td>内皮细胞生长添加剂</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>康宁</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数系统 &amp;nbsp;</td><td>生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件&amp;nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

全面评估的综合流程 体外 使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的失活在人中枢神经系统（CNS）血管母细胞瘤（HBs）的发生发展中起着关键作用。然而，HBs的细胞起源及其演化过程（包括新生血管形成）仍存在争议，且基于经典HB血管生成机制的抗血管生成疗法在VHL相关HBs的临床试验中效果不佳。抗血管治疗在临床转化中面临的主要障碍之一，是对这种富血管肿瘤中新生血管形成机制缺乏全面深入的理解。本文介绍了一套系统的实验方案，用于评估 体外 HBs中是否存在经典的肿瘤血管生成及其在HBs中的作用。通过该方法，研究人员可准确理解HB新生血管形成的复杂性，并明确这种常见血管生成形式在HBs中的功能。这些方案可用于评估最具前景的肿瘤抗血管治疗策略，对于肿瘤治疗具有较高的转化潜力，也可为未来优化HBs抗血管生成治疗提供参考。结果表明，HB新生血管形成具有复杂性，提示这种常见的血管生成形式仅是HB新生血管化的一种辅助机制。

原始图像由倒置光学显微镜拍摄。对照组和VHL组的典型图像分别如图2-A1和图2-A2所示。对照组的出芽长度短于VHL组。
上传图像后，在线平台将直接提供分析结果。输出结果包括两部分：处理后的图像和相应的分析结果。对照组和VHL基因沉默组的处理图像以不同颜色标注（图2-A3 和 图2-A4）。对照组和VHL沉默组的平均出芽长度分别为65 µm和125 µm，平均累计出芽长度分别为680 µm和1250 µm，表明与对照组相比，VHL沉默组的出芽长度增加了约两倍（<strong clas...

本文介绍了一种全面的评估流程 体外 经典肿瘤血管生成是否存在于血管母细胞瘤（HBs）中及其在HBs中的作用。结果强调了HB新生血管形成的复杂性，并表明这种常见的血管生成形式仅是HB新生血管化的一种辅助机制。

Von Hippel-Lindau (VHL) 肿瘤抑制基因的失活在人脑血管母细胞瘤（HBs）的发生发展中起着关键作用...

本实验的总体目标是利用体外球体出芽实验评估假定的血管母细胞瘤新生血管形成能力。该方法有助于回答血管生成领域中的关键问题，例如肿瘤血管生成。该技术的主要优势在于，它提供了一种全面的体外评估流程，可用于研究经典的肿瘤血管生成在血管母细胞瘤中是否存在及其在血管母细胞瘤中的生长情况。该技术的应用意义延伸至血管母细胞瘤和脉管系统的治疗，因为实验结果凸显了血管母细胞瘤新生血管形成的复杂性，表明这种常见的血管生成形式仅是一种辅助机制。因此，该方法可为血管母细胞瘤新生血管形成的研究提供深入见解。此外，该方法还可应用于某些实体瘤中与肿瘤、血管生成及血管发生相关的研究，例如玻璃体肿瘤中的肿瘤血管拟态。该方法的真实演示至关重要，因为这些经操作的内皮细胞球体的制备步骤难以掌握。合适的条件尤为关键。首先，在添加了10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养HUVEC内皮细胞。然后，将培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中继续培养。接下来，为合成shRNA片段，使用ApaI和EcoRI限制性内切酶对质粒进行酶切。随后，在酶切后的质粒中加入正向和反向寡核苷酸引物、10x NEB缓冲液以及重蒸水，总体积为50微升。加入所有试剂后，将混合物在98摄氏度加热四分钟。随后，在数小时内逐渐冷却至室温。使用T4连接酶连接退火后的寡核苷酸与质粒。将试管在4°C下孵育过夜。次日，向25微升DH5alpha感受态细胞中加入5微升连接反应混合物。在500微升DMEM培养基中，加入慢病毒载体或乱序对照载体，以及其他包装质粒。然后，将慢病毒混合液在37摄氏度孵育25分钟。孵育结束后，向对照或慢病毒混合溶液中加入7毫升DMEM培养基。将293FT细胞在不含胎牛血清的DMEM培养基中，于10厘米培养皿中进行培养。向培养皿中的293FT细胞加入一毫升慢病毒或乱序对照溶液。六小时后，吸除培养皿中的旧培养基，然后更换为含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基。48小时后，收集培养基。将HUVEC内皮细胞转入含慢病毒的培养基中，继续培养72小时。随后，在HUVEC细胞培养基中加入浓度为2微克/毫升的嘌呤霉素。最后，将培养物再孵育24小时。次日，加入1毫升胰蛋白酶EDTA溶液以消化HUVEC细胞。然后将消化后的细胞悬液重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。使用细胞计数器对细胞数量进行计数。计数后，将细胞接种至3D圆底96孔板中。接种后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下持续培养72小时。36 小时后，用新鲜培养基更换一半的培养液。首先，在 4 摄氏度下解冻凝胶溶液，然后用低血清培养基按 1 比 5 的比例稀释。使用微量移液器从 DMEM 培养基中吸取球状体。接下来，用五毫升低血清培养基洗涤类球体。小心地转移悬浮的类球体和稀释后的凝胶。在15孔板中，加入300微升类球体与稀释凝胶的混合液进行包埋。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。随后，向单个孔中加入400 µL低血清培养基。为防止蒸发，用无菌水填充该孔周围的区域。随后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳、100%湿度条件下培养1小时。孵育结束后，吸除旧培养基，向孔中加入600 µL含1%内皮细胞生长补充剂的低血清培养基，继续孵育1天。使用倒置光学显微镜采集图像。此处利用倒置光学显微镜观察细胞的球状体出芽现象，以研究VHL基因沉默对内皮细胞血管生成潜能的影响。在慢病毒处理后12小时，对照组和VHL基因沉默的内皮细胞球状体均可见出芽。接下来，通过统计学分析定量评估VHL基因沉默球状体所产生的出芽长度。VHL 沉默组的平均出芽长度约为 125 微米，而对照组仅为约 65 微米。VHL 沉默组的平均累计出芽长度约为 1250 微米，而对照组为 680 微米。这些结果表明，VHL 沉默组的出芽长度增加了约两倍。一旦掌握，该技术若操作得当，可在48小时内完成。通过遵循本实验步骤和方法，还可开展诸如毛细血管形成实验等进一步研究，例如探究血管内皮细胞的血管生成能力。随着这一进展，该技术为血管生成领域的研究人员探索肿瘤内部血管化提供了途径。观看本视频后，您应能充分了解在用于爆裂实验的经操纵内皮细胞中哪些基因丧失了功能。

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癌症研究

用球形发芽法评价 Hemangioblastoma 新生血管的体外性能的综合程序

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

本方案介绍了一种新型 体外 更适当地模拟该过程的珠式分析法 体内...

将周细胞整合到内皮细胞微球出芽实验中

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体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

三维共培养类球体血管生成检测系统旨在模拟生理性的血管生成过程。该共培养类球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）——组成，并包埋于胶原凝胶中。该新系统可用于有效评估血管生成调节剂，并能为体内研究提供更相关的生物学信息。...

利用内皮集落形成细胞与间充质干细胞共培养球体的三维血管生成检测系统

一种眼微血管新生的离体脉络膜出芽实验方法

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in...

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外...

乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

学习使用球形发芽法评估血管母细胞瘤新生血管性能的综合实验流程。该方法揭示了经典肿瘤血管生成在HB中的互补机制，为肿瘤血管研究提供重要见解。

全面评估的综合流程体外使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

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全面评估的综合流程 体外 使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

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