细胞分化和牵引力的相关分析高通量细胞芯片平台
March 1st, 2017
细胞分化是由微环境因素的影响，包括基质组合物和基材的材料性质的宿主调节。我们在这里描述利用细胞微阵列与牵引力显微镜一起同时评估细胞分化和生物力学细胞 - 基底相互作用的微环境上下文的功能的技术。
该细胞微阵列平台的总体目标是将细胞分化和牵引力的测量值与微环境环境相关联。该方法可以帮助回答组织工程领域的关键问题，从而实现干细胞生物学的基础研究和分化方案的优化。该技术的主要优点包括其通量、改变生化和生物物理线索的能力，以及通过免疫荧光显微镜和牵引力显微镜 （TFM） 得出终点读数的能力。
虽然已经使用了这些方法，但那些了解肝祖细胞分化的人可以很容易地应用于其他动脉细胞类型和组织环境。该方法的视觉演示至关重要，因为实验成功取决于阵列方案与高质量水凝胶基材和牵引力显微镜的集成。要在硅烷化的 35 mm 玻璃底培养皿上制备含有聚丙烯酰胺水凝胶的荧光珠，以使用 TFM 实时评估细胞基质相互作用，首先，按照文本方案中的说明在溶液中制备玻璃基质。
将硅烷化的 35 mm 玻璃底培养皿放入玻璃干燥盘中，并将 20 微升 9 比 1 预聚物珠与光引发剂溶液移液到每个培养皿的中心。用 12 毫米的圆形盖玻片轻轻覆盖每个培养皿，同时避免产生气泡。为了将荧光珠分布到水凝胶表面，将培养皿倒置并在室温下放置 20 分钟。
在仍然倒置的情况下，将培养皿暴露在 365 纳米 UVA 下 10 分钟。根据需要优化聚合时间。接下来，将水凝胶浸入 1 摩尔 HEPES 缓冲液中，并在室温下避光放置过夜。
用剃须刀小心地取下盖玻片，注意不要损坏聚合水凝胶。将水凝胶在 50 摄氏度的热板上脱水至干燥。水凝胶可以在室温下避光储存三个月。
如文本方案中所述，准备缓冲液以打印生物分子和源板。按照文本协议中的说明加载干净的引脚后，准备微阵列器并使用制造商软件对其进行编程。接下来，打开加湿器装置。
将设定点调整为 65% 相对湿度，并等待流变仪匹配设定点。将源板放入适当的适配器中。然后将脱水的水凝胶底物放入适当的适配器中。
调整程序的参数以准确反映源板的布局、阵列设计和所需的格式。开始阵列制造。每小时至少检查一次湿度是否低于 65% 相对湿度，并且针脚是否堵塞。
如果湿度意外下降，请暂停排列以填充加湿器并清除相关的冷凝管。如果引脚堵塞，请暂停阵列以清洁引脚或以其他方式更换为预先清洁的引脚。程序完成后，将制造的阵列放置在覆盖有铝箔的载玻片盒或微板中。
将阵列在室温下以 65% 相对湿度放置过夜。根据我们的经验，最常见的困难与阵列制造有关。我们建议使用荧光标记分子、一般蛋白质染色剂和免疫荧光剂来确认制备的阵列的技术质量和稳定性。
制造后第二天，将阵列 35 mm 培养皿浸入 3 mL 每体积 1% 体积的青霉素-链霉素中，溶于 PVS 中。将排列的基材在 UVC 中暴露 30 分钟。然后将青霉素 - 链霉素溶液交换为细胞培养基。
收集和计数细胞后，以每 35 mm 培养皿 3 mL 的浓度将细胞接种到阵列上。将阵列培养物在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 2 至 24 小时，或直到形成填充良好的细胞岛。接种密度和时间可以根据细胞和特定应用进行调整。
在允许形成细胞岛后，用 3 mL 预热的细胞培养基洗涤阵列培养物两次。此时，可以将感兴趣的适当对照和处理添加到生物系统中。每 1 到 2 天更换一次阵列的培养基，以保持任何处理的浓度。
在开始阵列培养后的 1 到 5 天内，使用 TFM 对细胞底物相互作用进行实时评估。将含有阵列培养物的 35 mm 培养皿移至带有机器人载物台的孵育倒置荧光显微镜中，以进行 TFM 测量。在一个培养皿中，使用相差显微镜标记单个细胞岛的位置和焦平面。
切换到远红荧光显微镜以观察珠子。然后返回到上一步中保存的每个位置，并校正焦平面的 z 坐标，以便只有单元岛下方的第一层珠子成为焦点。保存新坐标并继续对所有细胞岛进行自动成像，以捕获预解离相差和远红荧光图像。
接下来，小心地向培养皿中加入 150 μL BSA/SDS 溶液，等待 5 分钟，让细胞从底物上完全解离。使用相差显微镜监测细胞解离。细胞岛与底物分离后，返回到标记的位置并检查第一层磁珠是否仍处于聚焦状态。
如果这些珠子由于细胞产生的牵引引起的变形而超出平面，请校正聚焦平面的 z 坐标，以便它们再次聚焦。保存校正后的 z 坐标并重复所有岛的自动成像，以捕获解离后的远红荧光图像。对剩余的菜肴重复这些步骤。
蛋白 A/G 偶联的缺口配体呈锯齿状 1 和 delta 状配体在水凝胶中的保留性有所提高。Notch 配体呈递也推动肝祖细胞分化向胆管细胞命运，如绿色胆管细胞标志物的存在所示。对 5 种细胞外基质或 ECM 蛋白的 Notch 配体的反应进行了定量，并表明肝祖细胞对配体的反应取决于 ECM 环境。
利用小发夹 RNA 敲低来生成没有配体 delta 的祖细胞，如 1 和锯齿状 1。然后向细胞展示锯齿状的 1 和 delta 配体，delta 像 1 和 delta 一样 4。对阵列缺口配体的反应取决于任一配体的细胞内在表达。
这些图像显示肝祖细胞的分化取决于基质刚度和 ECM 组成。定量分析表明，胶原蛋白 4 支持在软质和硬质基材上的分化，而纤连蛋白仅支持在硬质基材上的分化。代表性热图表明，胶原蛋白 4 上低基质刚度的持续牵引应力会促进分化为胆管细胞。
通过量化牵引应力的平均均方根值证实了这一发现。本视频和随附的方案提供了制造水凝胶和阵列的主要步骤，用于在阵列基质上进行细胞培养，以及使用牵引力显微镜测量细胞基质相互作用。熟悉这些技术后，如果执行得当，每个实验都可以在短短一到两周内完成。
与这种方法结合使用时，应使用细胞培养物来验证使用定性 PCR、免疫印迹、标准规模机械生物学轴或其他互补分子生物学技术来验证高评分阵列条件。这种多功能平台可应用于多种细胞和组织环境中细胞功能的高通量研究，包括干细胞分化和癌细胞生物学。
概述
本研究介绍了一个细胞微阵列平台，旨在关联不同微环境背景下的细胞分化和牵引力。该方法提高了对干细胞生物学和组织工程应用的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 组织工程
- 生物力学
背景
- 细胞分化受微环境因素影响。
- 牵引力显微镜（TFM）用于评估细胞-基底相互作用。
- 高通量技术对推进干细胞研究至关重要。
- 生化和生物物理信号的整合对实验成功至关重要。
研究目的
- 评估细胞分化和生物力学相互作用。
- 优化各种细胞类型的分化协议。
- 提供微阵列技术的视觉演示。
使用的方法
- 用荧光珠制造聚丙烯酰胺水凝胶。
- 生物分子的微阵列印刷。
- 细胞培养和在制造的阵列上播种。
- 使用TFM对细胞-基底相互作用进行实时评估。
主要结果
- 该方法允许对细胞行为进行实时监测。
- 成功展示了肝脏祖细胞的分化。
- 可以制造高质量的阵列并获得一致的结果。
- TFM提供了细胞相互作用机械性质的洞察。
结论
- 细胞微阵列平台是干细胞研究的有价值工具。
- 它能够研究各种细胞类型及其分化。
- 未来的应用可能扩展到其他组织背景。
常见问题
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
