Name: 细胞分化和牵引力的相关分析高通量细胞芯片平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 了解细胞微阵列平台如何关联细胞分化与牵引力，用于干细胞生物学和组织工程研究。该方法结合聚丙烯酰胺水凝胶与牵引力显微镜，实现高通量实时监测细胞行为。

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我们感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所的Austin Cyphersmith和Mayandi Sivaguru在显微成像方面的协助，以及 microscopy core 在屏幕显示和视频采集方面的慷慨支持。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在我们的实验中，最常见的失败原因与所制备微阵列的质量以及目标生物系统中反应表征不佳有关。关于细胞微阵列实验中的常见故障模式及相应的排查步骤，请参见表1。特别针对阵列质量，我们建议采取以下措施：使用荧光标记分子（如罗丹明偶联葡聚糖）验证点样程序、参数和缓冲液的技术质量与稳定性；根据制造商的说明，在点样前或点样后彻底清洗点样针，并使用光学显微镜目视检查针孔通道是否无残留物；通过通用蛋白质染色或免疫标记法确认点样生物分子的保留情况。需要注意的是，分子量低于70 kDa的生物分子通常无法在水凝胶中有效保留23,31。应使用多种细胞类型验证点样生物分子的细胞功能性。需注意，仅贴壁细胞适用于微阵列；此外，细胞在阵列上的黏附能力取决于细胞自身的特性（例如，整合素表达谱）以及所选用的细胞外基质（ECM）蛋白。
由于空间有限，本文未对芯片设计、布局和制备进行详尽阐述，建议读者参考先前的研究工作23,25。我们通常使用包含100个点的子阵列（点直径为150 µm，点中心间距为450 µm），每个子阵列包含10–20种不同的生物分子条件（即每种条件5–10个点）。单个芯片上的子阵列数量取决于感兴趣的生物分子条件数，最多可在一张25 × 75 mm的显微镜载玻片上容纳1,280个子阵列（共约6,400个点，分布在64个子阵列中）25,31。上述参数会根据所需图案尺寸进一步调整；目前可方便获得能够生成75–450 µm图案的针头。
阵列实验最好通过使用其他培养形式、检测读数和生物模型系统，对感兴趣的高评分阵列化条件进行验证，以作补充。具体而言，我们建议结合标准分子生物学技术，利用大规模培养进一步验证所选阵列化条件的作用效果例如，qRT-PCR、免疫印迹）或标准TFM。遗传操作（例如在适当的生物模型系统中对目标因子进行敲低或过表达，也可用于验证芯片实验中观察到的结果。 在体 动物模型是另一种验证手段，最近被用于确认半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-8在肺癌转移微环境中的核心作用，该作用最初通过细胞微阵列技术发现31,49.
已有多种其他方法被用于研究微环境对细胞功能的调控作用，包括多种二维微加工系统18,50,51,52,53,54,55以及三维工程化生物材料系统56,57,58,59,60,61。与其他方法相比，本文所述细胞微阵列平台的特定优势包括：（1）通量可达数百至数千种不同的因子组合，能够分析因子间的相互作用效应；（2）可实现便捷的自动化成像与分析；（3）在可控呈现阵列化因子的同时，整合生化和生物物理的检测读出；（4）能够调节基底材料的理化特性；以及（5）对细胞命运和功能进行高内涵的单细胞分析。
综上所述，将细胞微阵列与可调节基底刚度的基底上的牵引力显微镜技术（TFM）相结合，能够对生化和生物物理信号进行系统表征。如本文所述，该平台具有普适性，可广泛应用于多种贴壁细胞类型和组织环境，有助于深入理解细胞微环境的协同调控作用及其对细胞分化和机械信号转导的影响。

细胞与周围微环境因素之间的相互作用，在发育、稳态以及疾病发生过程中介导了多种多样的生物学过程1,2,3,4这些微环境相互作用包括向细胞递送可溶性因子、细胞与基质的结合，以及通过配体-受体结合介导的细胞间相互作用。除了上述生化因素外，还包括基底力学性能等生物物理参数（例如，杨氏模量、孔隙率）和细胞形态及其相关的下游机械转导在细胞分化中的关键介导作用正日益受到重视5,6,7,8,9,10由这些微环境相互作用产生的信号可作为基因网络和信号通路的输入信号。此外，这些细胞内在组分还通过分泌因子和基质降解酶向微环境提供反馈，从而形成细胞内在遗传程序与细胞外在微环境因素之间复杂的共调控回路。5,11,12.
利用工程化系统对微环境因子进行可控呈现，在多种不同情境下已被证明具有重要价值13,14,15。特别是微加工系统，通过微型化实现了蛋白质和细胞的精确空间排布，以及高通量平行化分析13,16,17,18,19,20,21,22。细胞微阵列即为其中一种微加工系统，其通过接触式打印将多种生物分子组合点样至弹性聚丙烯酰胺水凝胶基底上23,24,25。通过引入细胞黏附组分（即基质蛋白），可在微阵列上实现细胞的长期黏附与培养，随后常通过免疫细胞化学染色和荧光报告系统进行下游分析。细胞微阵列已被成功应用于深入理解肝细胞表型23,26、神经前体细胞分化27、乳腺前体细胞命运决定28、胚胎干细胞维持与分化23,29,30、肺癌转移31以及黑色素瘤治疗反应32。我们近期已证实，细胞微阵列可用于阐明细胞外基质（ECM）蛋白组成在内胚层特化33、肝前体细胞分化34,35以及肺肿瘤细胞药物反应36中的作用。在这些研究中，我们重点拓展了阵列平台的组合能力，并探索了细胞内在信号通路与细胞外基质组成及生物力学特性之间的相互作用。此外，我们在该阵列平台上引入了生物物理读出方法，以定量表征细胞收缩力在分化过程中的作用35。为此，我们将牵引力显微镜技术（TFM）与细胞微阵列相结合，实现对细胞产生牵引力的高通量评估。TFM 是一种广泛应用的技术，用于测量细胞产生的牵引力，已在揭示单细胞及组织水平功能与局部微环境组成和生物力学特性协调机制方面提供了重要见解37,38,39,40。因此，将 TFM 与细胞微阵列结合，构建了一个高通量系统，可用于测量关键且具有生理相关性的生物物理参数。
此处描述的细胞微阵列平台包含四个部分：聚丙烯酰胺基底的制备、阵列的制备、细胞培养与检测信号读取，以及数据分析。参见 图1 有关前三个实验部分的示意图总结，请参见 图2 有关最终部分的示意图总结，重点为免疫荧光数据分析。为将细胞微阵列平台应用于细胞-基质生物力学相互作用的研究，我们采用了可调节杨氏模量但孔隙率相似的聚丙烯酰胺基质，依据Wen等人的方法 等41为了实现对细胞施加于基底上的力进行牵引力显微镜（TFM）测量，除了其他研究团队常使用的厚玻璃显微镜载玻片外，我们还采用了玻璃底培养皿的结构。因此，该细胞微阵列平台能够并行测量细胞分化情况 通过 在显微镜载玻片上进行免疫荧光染色，并在独立的玻璃底培养皿上通过牵引力显微镜（TFM）检测细胞产生的力学力。我们还对细胞微阵列常用的分析方法进行了多项改进：具体而言，不再采用对整个细胞岛整体强度进行参数化Z评分的方法，而是测量单个细胞的荧光强度，并应用分位数归一化，以校正非正态分布，更准确地描述细胞行为。我们认为，这些改进在研究生化信号与生物物理信号均发挥重要且相互交叉作用的生物学过程时具有特别的价值。此外，我们的分析方法改进使得细胞微阵列可被应用于更广泛细胞功能的研究，特别是在单细胞水平与群体水平行为存在差异的情况下。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>与合适尺寸的鲁尔锁塑料注射器匹配。</td></tr><tr><td>100 &amp;times; 青霉素&amp;ndash;链霉素溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &amp;times; 60 mm 盖玻片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（3-TPM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>按照制造商说明，在惰性气体环境下储存。3-TPM 暴露于空气可能导致玻璃基底的硅烷化效果受损。注意：3-TPM 为可燃液体，应远离热源、火花、明火和高温表面，仅可在化学通风橱中使用。</td></tr><tr><td>3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐水合物（CHAPS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>细胞 E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm 孔，含 1.5 号盖玻片，适用于牵引力显微镜（TFM）和活细胞成像。</td></tr><tr><td>384孔聚丙烯V型底微孔板，非无菌</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6孔聚苯乙烯微孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm 玻璃底培养皿可放入微孔板的孔中，便于阵列的制备。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>警告：接触丙烯酰胺可能导致急性毒性及刺激作用。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>I型胶原，大鼠尾部</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>人III型胶原蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白，人源</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>交联剂，365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa 董氏兰B偶联葡聚糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1841</td><td>用作阵列位置的标记。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific（HyClone）</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>小鼠Fc重组DLL1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Fc-重组 DLL4</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-重组JAG1，大鼠</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白，人</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜，倒置</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>确保显微镜配备有机器人载物台，用于自动荧光成像和牵引力显微镜（TFM）。环境控制（&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;., 37 &amp;deg;C 和 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;对于TFM，强烈建议使用。</td></tr><tr><td>含DAPI的Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>警告：乙酸易燃且具有腐蚀性。请佩戴防护手套、防护服和护目用品。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>巴斯夫公司</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>微阵列扫描仪</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>荧光染料必须与 Cy3 或 Cy5 兼容。</td></tr><tr><td>微阵列点样仪</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid 微阵列点样仪</td><td>其他具有相似或更高性能的微阵列仪可轻松替换使用。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，25 &amp;times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &amp;ndash; 1.1 mm 厚度。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;- 甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>警告：接触丙烯酰胺可能导致急性毒性及刺激作用。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA），16% v/v</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT15710</td><td>现配现用PFA以获得最佳固定效果（切勿储存）。注意：接触PFA可能导致急性毒性，且接触皮肤可引起刺激或腐蚀。操作时须佩戴防护手套、防护服和护目用具，并仅在化学通风橱中使用。</td></tr><tr><td>重组蛋白A/G</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 干燥盘，2,000&amp;nbsp;mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>矩形四腔培养皿</td><td>Fisher Scientific（Nunc）</td><td>12-565-495</td><td>用于阵列显微镜载玻片上的细胞培养。</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>警告：氢氧化钠具有强腐蚀性，可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>用于阵列的隐形针</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>每次阵列运行后，按照制造商的说明清洁针头。可产生150微米的点阵区域；如需更小区域，可购买其他规格的针头（75&amp;ndash;450 微米），以适应您的特定应用需求。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

微加工的细胞微阵列由在弹性水凝胶表面接触打印的生物分子组合构成，为测量阵列化生化信号对细胞分化的影响提供了一个高度可控、高通量的工程化系统。近期利用细胞微阵列的研究已证明其在并行呈现多种微环境因素的组合研究中的实用性。然而，这些研究主要集中在探究生化信号对细胞反应的影响。本文介绍了一种具有可调材料特性的细胞微阵列平台，可用于通过免疫荧光检测细胞分化，并通过牵引力显微镜评估细胞与基底之间的生物力学相互作用。为此，我们开发了两种不同格式，分别在显微镜载玻片或玻璃底培养皿上制备具有不同杨氏模量的聚丙烯酰胺水凝胶。我们提供了在这些水凝胶基底上制备微阵列、后续细胞培养及数据采集的最佳实践与故障排除方法。该平台非常适合用于研究那些生化因素（例如，细胞外基质组成）和生物物理因素（例如，基底刚度）均可能发挥重要且相互关联作用的生物学过程。

利用该平台，我们研究了生化和生物物理信号在肝前体细胞命运决定中的作用34,35。蛋白A/G偶联的Notch配体在聚丙烯酰胺水凝胶中表现出更优的保留性和聚集性（图3A），并能够有效驱动肝前体细胞向胆管细胞命运分化（图3B）。通过单细胞分析，我们量化了肝前体细胞在细胞外基质蛋白I型胶原、III型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白存在下对Notch配体的响应（图3C），发现肝前体细胞对配体的响应还依赖于细胞外基质的微环境。最后，我们利用shRNA敲低技术构建了缺失Dll1和Jag1配体的肝前体细胞。对点阵化Notch配体的响应因上述任一配体的存在与否而异，证实了细胞对外源性配体的响应能力也取决于细胞内源性配体的表达水平（图3D）。此外，在Dll1敲低条件下，我们观察到一个独特的双阳性（ALB+/OPN+）细胞亚群（图3D）。综上所述，这些代表性结果表明：（1）该点阵平台具有组合分析能力，例如可同时结合多种点阵化的细胞外基质蛋白与Notch配体，并与单个配体的敲低实验联用；（2）不仅点阵化的细胞外基质蛋白具有功能活性，通过蛋白A/G介导偶联的细胞间配体也具备功能活性；（3）我们所采用的单细胞分析方法能够有效识别出独特的细胞亚群。
我们还观察到，肝前体细胞的分化依赖于基底刚度和细胞外基质（ECM）的组成（图4A），具体发现IV型胶原在软性和硬性基底上均支持细胞分化，而纤连蛋白仅在硬性基底上支持分化（图4B）。典型的牵引力显微镜（TFM）测量热图表明，在IV型胶原上，低基底刚度下持续的牵引应力促进了向胆管细胞的分化（图4C），该结果通过平均均方根值得到验证（图4D）。综上所述，这些代表性结果表明：（1）成功将牵引力显微镜技术与可在刚度可调基底上使用的细胞微阵列整合，用于同时评估细胞表型和牵引应力；（2）肝前体细胞命运受到基质组成和基底刚度的共同调控；（3）实现了在细胞微阵列中应用我们的TFM分析方法及典型的牵引应力分布图谱。
<img alt="聚丙烯酰胺基底制备、点阵排列及细胞培养流程示意图与检测结果。" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：前三个实验部分的总体示意图。 在第1部分中，对玻璃基底进行清洗和硅烷化处理，以促进聚丙烯酰胺水凝胶的制备。在第2部分中，将感兴趣的生物分子组合制备于384孔源微孔板中。随后将洁净的点样针、源微孔板和聚丙烯酰胺水凝胶装载至机器人点样仪中并启动运行，从而在水凝胶表面形成点阵。在第3部分中，将细胞接种到已有点阵的区域并使其贴附，随后执行感兴趣的培养方案。在实验终点时，细胞可固定用于免疫细胞化学/免疫荧光染色，或通过牵引力显微镜（TFM）进行分析。比例尺为75 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RGB通道拆分、成像细胞术流程；示意图显示单细胞分析、分位数归一化。" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：来自阵列的免疫荧光数据的处理与分析。（A） 首先将拼接的复合32位RGB图像进行合并（binning），然后拆分为独立的8位通道。通过组合使用阵列化的荧光标记和细胞岛，识别阵列的三个角，以实现阵列的自动定向与网格划分。（B） 针对输入阵列的每个通道生成单细胞数据。为校正实验漂移，按生物学重复进行分位数归一化，使所有重复样本间形成一个共享的分布。随后通过计算集合测量值（例如，每岛细胞数、平均强度、标记阳性细胞百分比）或直接分析单细胞分布，对分位数归一化后的数据进行绘图与解释。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分化过程中OPN/ALB的免疫荧光及强度分析；实验结果" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：Notch配体呈递介导肝前体细胞分化。 （A） Fc-重组Notch配体Jagged-1（JAG1）和Delta-like 1（DLL1）与Protein A/G共固定时表现出增强的保留性和聚集性。比例尺为 50 µm. （B） 肝祖细胞在接触Notch配体后分化为胆管细胞。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）为细胞核标记物，白蛋白（ALB）为肝细胞标志物，骨桥蛋白（OPN）为胆管细胞标志物。比例尺为 150 µm. (C) 在细胞外基质蛋白I型胶原、III型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白上，对Notch配体JAG1、DLL1和Delta样4（DLL4）阳性细胞中骨桥蛋白（OPN）阳性细胞百分比的定量分析。Student's t-针对每种阵列化的 Notch 配体，在每种 ECM 蛋白中均以对照 IgG 为参照进行检测，P 值已标明&lt;0.05 (*). (D) 胶原III上呈递Notch配体JAG1、DLL1和DLL4条件下，对ALB和OPN进行成像流式细胞术检测的肝前体细胞；无Notch配体条件下的肝前体细胞 Dll1 和 Jag1 (即，shDll1 和 shJag1）通过 shRNA 沉默技术构建。数据来自 (C) 以均值 ± 标准误表示。该图已根据 Kaylan 的原图修改 等34. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞牵引力应力与基质刚度分析；免疫荧光成像；图表数据比较。" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：基质成分与基质刚度协同调控肝前体细胞分化。（A） 肝前体细胞向胆管细胞的分化依赖于细胞外基质（ECM）成分和基质刚度。DAPI 为细胞核标记物，ALB 为肝细胞标志物，OPN 为胆管细胞标志物。（B） 在杨氏模量分别为 30 kPa、13 kPa 和 4 kPa 的基质上，胶原 I（C1）、胶原 IV（C4）、纤连蛋白（FN）以及上述 ECM 蛋白所有两两组合条件下，OPN 阳性细胞百分比的定量分析。（C） 细胞牵引力应力依赖于基质刚度和 ECM 成分。（D） 在杨氏模量为 30 kPa 和 4 kPa 的基质上，胶原 I（C1）、胶原 IV（C4）、纤连蛋白（FN）以及上述 ECM 蛋白所有两两组合条件下，牵引力应力均方根值的定量分析。在（B）和（D）中，数据以均值 ± 标准误（s.e.m）表示，针对每种 ECM 组合，使用 Student's t-检验与 30 kPa 组进行比较，P 值标注如下：P &lt; 0.05（*），P &lt; 0.01（**），P &lt; 0.001（***）。比例尺为 50 µm。本图改编自 Kourouklis et al.35。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1.2in">部分</td>
			<td fo:width="1.5in">问题</td>
			<td fo:width="1.5in">潜在原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1. 聚丙烯酰胺基底的制备。</td>
			<td>盖玻片无法从水凝胶上移除。</td>
			<td>过度聚合。</td>
			<td>将聚合时间缩短至<10分钟（4 W/m2）。确认紫外交联仪输出在预期范围内。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚丙烯酰胺水凝胶聚合效果差。</td>
			<td>聚合不足。</td>
			<td>将聚合时间延长至>10分钟（4 W/m2）。确认紫外交联仪输出在预期范围内。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>移除盖玻片后聚丙烯酰胺水凝胶受损。</td>
			<td>较软的聚丙烯酰胺水凝胶容易损坏。</td>
			<td>我们观察到最软（i.e.，4 kPa）的水凝胶制备产率尤其下降（约50%）。操作时应轻柔处理水凝胶，并增加起始数量以达到所需产率。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2. 阵列的制备。</td>
			<td rowspan="2">点样形态差或不一致。</td>
			<td>加湿器功能不稳定。</td>
			<td>确保在每次打印过程中加湿器和流变仪正常工作，并维持65%相对湿度（RH）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>打印头针头卡住或堵塞。</td>
			<td>清洁打印头以确保针头自由移动。每次打印前后彻底清洁针头，清除针道中的聚集体。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">3. 细胞培养与实验操作。</td>
			<td rowspan="2">细胞在阵列上初始贴附后发生脱落或死亡。</td>
			<td>接种密度过高及过度增殖。</td>
			<td>降低初始接种密度和时间。在阵列培养期间使用“维持”或“分化”培养基以减少细胞增殖。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水凝胶释放有毒的丙烯酰胺单体。</td>
			<td>将水凝胶浸泡于dH2O中至少3天，以促进丙烯酰胺单体的扩散和释放，降低细胞毒性。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">细胞无法贴附于阵列上。</td>
			<td>接种密度不足。</td>
			<td>提高初始接种密度和时间。使用贴附能力更强的细胞类型。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基质或生物分子点样条件不佳。</td>
			<td>清除针头上的颗粒和聚集体，确认打印参数，并通过荧光标记物（e.g.，罗丹明标记的葡聚糖）评估点样效果。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞-基质相互作用的特异性。</td>
			<td>不同细胞类型仅特异性地贴附于某些细胞外基质（ECM）蛋白，而对其他蛋白不贴附。请用您的细胞测试多种不同的ECM蛋白。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阵列制备后储存条件不理想。</td>
			<td>建议将制备好的阵列在65%相对湿度和室温下避光保存过夜，部分原因是为了避免冷冻过程中的相变。细胞贴附对湿度、温度和储存时间均敏感；请确保这些参数在实验中保持一致并已优化。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">细胞培养过程中水凝胶从玻璃基底上脱落。</td>
			<td>载玻片清洁和硅烷化处理不佳。</td>
			<td>更换用于载玻片清洁和硅烷化处理的工作液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水凝胶过度脱水。</td>
			<td>避免将水凝胶在加热板上脱水超过15–30分钟。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. 数据分析。</td>
			<td>重复点样之间及载玻片之间的变异性高。</td>
			<td>阵列制备过程中的变异性。</td>
			<td>检查针头和打印头是否清洁。确认加湿器功能正常。使用荧光标记物可视化并量化点样和阵列质量。按照上述建议储存阵列。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：故障排除。

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。

微加工细胞微阵列由生物分子组合通过接触式打印固定于弹性水凝胶表面构成，可提供高度可控的……

该细胞微阵列平台的总体目标是，在不同微环境背景下，将细胞分化和牵引力的测量结果进行关联分析。该方法有助于回答组织工程领域中的关键问题，既可推动干细胞生物学的基础研究，也可用于优化细胞分化方案。该技术的主要优势包括高通量性、可调控生化与生物物理信号刺激，以及通过免疫荧光和牵引力显微镜（TFM）进行终点检测。尽管已使用这些方法，但了解肝前体细胞分化后，该方法可轻松应用于其他动脉细胞类型和组织环境。此方法的可视化演示至关重要，因为实验成功取决于阵列化方案与高质量水凝胶基底以及牵引力显微镜技术的整合。为了在硅化处理的35 mm玻璃底培养皿上制备含荧光微球的聚丙烯酰胺水凝胶，用于通过牵引力显微镜（TFM）实时评估细胞-基底相互作用，首先需按照文本方案中所述，在溶液中制备玻璃基底。将硅烷化处理的35 mm玻璃底培养皿放入玻璃干燥盘中，用移液器向每个培养皿中心加入20微升9:1的预聚物微珠与光引发剂溶液。轻轻盖上12 mm圆形盖玻片，避免产生气泡。为使荧光微珠分布至水凝胶表面，将培养皿倒置，在室温下静置20分钟。保持倒置状态，将培养皿暴露于365纳米的UVA光下照射10分钟。根据需要优化聚合时间。随后，将水凝胶浸入1摩尔的HEPES缓冲液中，于室温避光条件下静置过夜。用剃刀小心取下盖玻片，注意不要损坏已聚合的水凝胶。将水凝胶置于加热板上，在50摄氏度下脱水至干燥。水凝胶可在避光条件下室温保存三个月。按照文本方案中的说明准备用于打印生物分子和源板的缓冲液。按照文本方案中的说明装载洁净的点样针后，准备微阵列仪，并使用厂商软件对其进行编程。然后，打开加湿器单元。将设定点调整至65%相对湿度，并等待流变仪达到设定点。将源板放入相应的适配器中，然后将脱水的水凝胶基底放入相应的适配器中。调整程序参数，以准确反映源板布局、阵列设计和所需格式。启动阵列制备。每小时至少检查一次湿度是否低于65%相对湿度，并检查针头是否堵塞。如果湿度意外下降，暂停点样以填充加湿器，并清除相关管路中的冷凝水。如果针头堵塞，暂停点样以清洗针头，或更换为预先清洁的针头。程序完成后，将制备好的微阵列置于覆盖铝箔的载片盒或微孔板中。将芯片在室温、65%相对湿度条件下放置过夜。根据我们的经验，最常见的问题与芯片制备有关。我们建议使用荧光标记分子、通用蛋白质染色以及免疫荧光方法来确认所制备芯片的技术质量和稳定性。制备后的第二天，将阵列置于含有3 mL青霉素-链霉素溶液（1% 体积比）的35 mm培养皿中。将排列好的基底暴露于UVC下30分钟。然后将青霉素-链霉素溶液更换为细胞培养基。收集并计数细胞后，将细胞以每35 mm培养皿3 mL的体积接种到阵列上。将阵列培养物置于37摄氏度和5%CO2条件下孵育2至24小时，或直至形成细胞密集的细胞岛。接种密度和孵育时间可根据细胞类型和具体应用进行调整。在允许细胞岛建立后，用 3 mL 预热的细胞培养基将芯片培养物清洗两遍。此时可向生物体系中加入相应的对照和感兴趣的处理因素。每隔一至两天更换芯片的培养基，以维持任何处理因素的浓度。在启动阵列培养后的一至五天内，使用牵引力显微镜技术（TFM）对细胞与基质的相互作用进行活细胞评估。将含有阵列培养物的35 mm培养皿转移至配备机器人载物台的孵育式倒置荧光显微镜，用于TFM测量。在其中一个培养皿中，利用相差显微镜标记各个细胞岛的位置及其焦平面。切换至远红荧光显微镜以观察微珠。然后返回上一步中保存的各个位置，并调整焦平面的 z 坐标，使细胞岛下方仅第一层微珠处于焦点范围内。保存新的坐标，随后对所有细胞岛进行自动成像，以获取解离前的相差图像和远红荧光图像。接下来，小心地向培养皿中加入 150 微升 BSA/SDS 溶液，静置五分钟，以使细胞完全从基质上解离。使用相差显微镜监测细胞解离情况。待细胞岛从基质上解离后，返回先前标记的位置，检查第一层微珠是否仍处于焦点位置。如果由于细胞产生的牵引力导致变形，使得这些微珠不在焦平面上，则校正焦平面的 z 坐标，使其重新处于焦点中。保存校正后的 z 坐标，并重复对所有微岛进行自动成像，以获取解离后的远红荧光图像。对剩余的培养皿重复上述步骤。与蛋白A/G偶联的Notch配体Jagged1和Delta-like 1在水凝胶中表现出更优的滞留能力。Notch配体的呈递还驱动肝前体细胞向胆管细胞命运分化，这由绿色胆管细胞标记物的存在所证实。针对五种细胞外基质（ECM）蛋白对Notch配体的响应进行了定量分析，结果表明肝前体细胞对配体的响应依赖于ECM环境。利用小发夹RNA敲低技术生成了不表达类delta样配体1和jagged 1的前体细胞。随后将这些细胞分别暴露于notch配体jagged 1、类delta样配体1和类delta样配体4。细胞对排列不同的notch配体的反应，取决于其内源性表达的配体类型。这些图像显示了肝前体细胞的分化依赖于基质刚度和细胞外基质（ECM）成分。定量分析表明，IV型胶原在软性和硬性基质上均支持细胞分化，而纤连蛋白仅在硬性基质上支持分化。代表性热图提示，在IV型胶原上，低基质刚度下持续的牵引应力可促进向胆管细胞的分化。通过量化牵引应力的平均均方根值，证实了该发现。本视频及配套方案提供了制备水凝胶和阵列的主要步骤，用于在阵列化基底上进行细胞培养，并利用牵引力显微镜测量细胞与基底之间的相互作用。熟练掌握相关技术后，若操作得当，每项实验可在一至两周内完成。与本方法相对，应使用定性PCR、免疫印迹、标准规模的机械生物学轴线或其他互补的分子生物学技术，通过细胞培养来验证评分较高的微阵列条件。该多功能平台可广泛应用于多种细胞和组织环境中细胞功能的高通量研究，包括干细胞分化和癌细胞生物学。

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