设计，表面处理，电镀细胞和神经元的模块化网络功能组成跨接电路的培养

这手稿描述了一个协议， 在体外模块化网络包括空间上的限制，在功能上相互连接的神经回路的增长。的聚合物掩模被用来图案的蛋白质层，以促进通过培养基底细胞粘附。镀神经元生长在涂层区域自发建立连接并显示出电活性。

该程序的总体目标是培养由空间受限、功能性、互连的神经元回路组成的体外模块化网络。这是通过首先准备 PDMS 模板来形成蛋白质层图案，以促进细胞粘附在培养底物上来实现的。第二步是清洁培养基质。

特别是培养皿、盖玻片和多电极阵列的表面。接下来，将 PDMS 模板沉积在培养基质上，并创建所需的粘附蛋白层图案。最后一步是神经元神经胶质细胞的接种。

最终，多电极阵列记录和钙成像用于显示所实现的模块化神经元网络的动力学。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键开放性问题，例如研究神经元组装体之间的通信动力学，并且将对抗实验条件。聚甲基索烷或 PDMS 是通过首先将 1 份固化剂与 10 份基剂混合制成的。

混合 5 分钟后，将混合物移至真空室中 15 分钟。15 分钟后，检查是否有气泡，然后将溶液放回腔室中再放置 15 分钟。接下来，在旋转编码器上准备晶圆。

打开氮气的气体旋钮。将晶片放在旋转器上并用真空将其固定到位。然后在晶圆上浇注一层薄薄的 PDMS。

用 PDMS 以 1000 RPM 的速度旋转晶圆一分钟，以在晶圆上形成 100 微米厚的 PDMS 涂层。然后将晶片转移到 100 摄氏度的热板上。让它在那里烘烤 30 分钟。

PDMS 硬化后，使用移液器用更多的 PDMS 勾勒出模板的边界。然后将添加的 PDMS 烘烤到晶圆上。和以前一样，当 PDMS 边界变硬时，沿边界切割模板，将硅胶模板从晶圆上切下来，以开始 RIN。

蒸馏水加入 23 毫米见方的玻璃盖玻片，然后加入 70% 乙醇，然后加入丙酮，然后加入异丙醇，最后加入蒸馏水。同样，在氮气流下干燥方块。接下来，将一个图案 PDMS 模板轻轻压在每个盖玻片上。

将带有模板的盖玻片放入真空室中 15 分钟。吸尘后，将一毫升 PDL 滴在模板上，然后将组件放回真空室 20 分钟。重复 20 分钟的真空循环一次，然后在第二天让 PDL 干燥过夜。

准备支持网络单元的培养皿。第一。用 1 毫升 PDL 覆盖 3.5 厘米的培养皿 2 小时。稍后在室温下，通过抽吸从培养皿中取出 PDL。

然后用蒸馏水洗碗并晾干。盘子干燥后，根据盖玻片的四个角在盘子中加入少量硅脂。将盖玻片放在培养皿上，PDMS 朝上，然后轻轻向下按压以确保它们已连接。

现在轻轻地将 A-P-D-M-S 从盖玻片上镊下来，留下 PDL 图案。最后，将餐具暴露在紫外线下 7 分钟，对餐具进行消毒。首先，用自来水清洗多电极阵列，然后用浓的酶清洁剂对其进行超声处理。

重复这些步骤三次。然后在纯蒸馏水中对 MEA 进行超声处理 3 次，然后在罩下。之前用蒸馏水清洗 MEA。

用紫外线消毒 30 分钟。接下来，首先准备支持网络。将 PDMS 倒入 12 或 24 孔板中。

PDMS 硬化后，用针将其取出。现在在圆盘的中心切孔以制作环，用作模具支撑。现在，在 MEA 的中心放置一个模具支撑，并覆盖 MEA 的外部裸露表面。

让它在房间里静置两个小时。然后用蒸馏水吸出 PDL 清洗液、MEA 的外露表面，并去除模具支撑，以便让 MEA 干燥。现在在倒置显微镜下将模板连接到准备好的微型纵器上。

检查并对齐图案化结构以匹配 MEA 的电极。然后使用微型机械手将模板降低到 MEA 表面。连接后，抬起 microm 机械手，如果需要，使用镊子施加少量压力以防止 PDMS 脱落。

现在将 MEA 转移到真空室中 15 分钟。然后将一毫升 PDL 滴在模板上，并返回真空室两个循环，每次 20 分钟。让 PDL 第二天干燥过夜。

使用镊子从测量中取出 P DM S 模板。最后，对测量材料进行紫外线消毒 7 分钟。然后，他们就可以为细胞做好准备，用于制备、培养细胞并按照文本方案制备悬浮液。

在 Resus 悬浮所需数量的细胞后，将它们接种在 MEA 或盖玻片上图案区域的中心。MEA 应加载 100 μL 体积和盖玻片。可容纳 1000 微升。

将铺板细胞孵育 40 分钟，然后每 4 天添加铺板培养基以维持细胞。重新添加新鲜的生长培养基。第 6 天或第 7 天后，模块之间的神经元连接应该在那个时候开始形成。

用抗有丝分裂剂稀释培养基以防止神经胶质细胞过度生长。体外 4 天后，可以观察到附着在 PD DL 内的神经元在 14 天后编码了 600 平方微米的点。在培养中，神经元自发地在模块内部和模块之间建立连接，形成活跃的功能网络。

通过在保持相同电镀浓度的情况下具有 PDMS 特征大小来观察 300 微米见方的神经元回路。使用外汇物镜进行钙成像，以广泛了解培养网络中的活动。在绿色和粉红色模块之间，可以看到更多的连接，而蓝色和红色模块与其他模块的连接较少。

显示了在 30 赫兹下采集的电影和 100 万像素图像的钙事件发作的名册图。绿色和粉色模块高度同步，而蓝色和红色模块则较少。So.在体外 21 天记录到由三个不同回路组成的皮层模块化网络。

使用 MEA，发现相距约 600 微米的神经元回路是相互互连的。它们的电生理活性被重建。使用精确的时序尖峰检测算法，使用颜色编码的集群数据制作了 5 分钟数据的名册图。

这提供了整个网络和单个集群活动的比较，并提供了对集群内同步性的洞察。看完这个视频，你应该对如何准备 PDM 模板并使用它们来塑造神经胶质细胞的粘附模式，从而建立功能性模态网络有了很好的了解。