Name: 设计，表面处理，电镀细胞和神经元的模块化网络功能组成跨接电路的培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习使用PDMS模板制备技术培养体外模块化神经元网络，通过蛋白质层图案化促进细胞粘附，实现空间受限的功能性神经回路连接，并利用多电极阵列记录和钙成像分析网络动态特性。

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本工作由欧洲项目BRIANBOW（FP7-青年探索者）资助。作者感谢Jacopo Tessadori博士对稿件提出的有益意见，以及Silvia Chiappalone在制作视频中所用图形方面提供的帮助。

该实验程序遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的标准，并已获得特拉维夫大学实验动物护理与使用委员会的批准（许可编号 – L-14-019）。
1. 仪器与聚二甲基硅氧烷的准备
<ol>
	<li>准备晶圆（材料表，或从微加工实验室订购晶圆）、手术刀和镊子——无需灭菌。</li>
	<li>按以下条件配制多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液：在0.1 M硼酸缓冲液中配制成4 mg/ml，pH 8，并在-20 °C下保存。</li>
	<li>按以下步骤制备PDMS模板：
	<ol>
		<li>通过将基础剂与固化剂按10:1的比例混合制备聚二甲基硅氧烷（PDMS，硅弹性体），然后将两种物质搅拌约5分钟。</li>
		<li>放入真空腔中抽气两次，每次15分钟，并确认气泡已完全去除。</li>
		<li>PDMS准备就绪后，准备旋涂仪：打开氮气阀门以供气，将硅晶圆（图1A）放置在旋涂仪上，并使用真空固定以防止其移动。</li>
		<li>将PDMS倒在晶圆上，启动旋涂仪以1,000 rpm转速旋转1分钟（形成约100 µm厚度）。</li>
		<li>将晶圆置于100 °C的加热板上加热30分钟。</li>
		<li>当PDMS固化后，使用巴斯德移液管沿模板边界涂布PDMS以形成边框，再将晶圆置于100 °C加热板上加热30分钟。</li>
		<li>当PDMS边框固化后，使用手术刀沿边框切割模板，并从晶圆上剥离出硅模板（得到一个包含单一图案的方形PDMS模板）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养皿和盖玻片的准备
<ol>
	<li>准备23 mm见方的玻璃盖玻片，并按以下顺序进行清洗：
	<ol>
		<li>用蒸馏水、70%乙醇和丙酮清洗。</li>
		<li>用异丙醇洗涤，并用氮气快速吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将图案化的PDMS模板放置在盖玻片上，轻轻按压以确认其已牢固附着于玻璃表面。放入真空腔室中处理15分钟。</li>
	<li>在模板上滴加1 ml PDL。将盖玻片插入真空室中，每次20分钟，共两次，并将PDL过夜干燥。</li>
	<li>准备培养皿以构建支持细胞网络：
	<ol>
		<li>在室温下，用1 ml多聚赖氨酸（PDL）覆盖培养皿（3.5 cm）表面，孵育2小时。使用移液器移除PDL液滴。</li>
		<li>用蒸馏水清洗并晾干。在盖玻片的每个角落各放置一极小滴硅脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片置于培养皿的中央（即， PDMS 应朝上放置，并轻轻按压以确认其已固定。</li>
	<li>用镊子小心地将PDMS从盖玻片上取下。为进行灭菌，用紫外光照射7分钟。</li>
</ol>
3. 多电极阵列（MEA）制备
<ol>
	<li>按以下顺序清洗MEA（材料表）：
	<ol>
		<li>在自来水下冲洗，并在浓缩酶性洗涤剂中进行3次超声处理。</li>
		<li>在蒸馏水中进行3次超声处理。</li>
		<li>用蒸馏水（在通风橱中，使用1,000 µl枪头）冲洗3次，并置于紫外线下照射30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支撑网络制备：
	<ol>
		<li>制备设计好的支撑网络模具。
		<ol>
			<li>将PDMS倒入12孔板（直径22 mm）中。</li>
			<li>当PDMS固化后，取出模具，使用手术刀在中间切割出一个孔，形成环形结构。</li>
			<li>将设计好的支撑网络模具置于MEA中央（图2A），其余表面覆盖PDL，室温孵育2小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用移液器去除PDL，并用蒸馏水冲洗。</li>
		<li>移除模具并使其自然干燥（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以如下方式将模板与MEA对齐：
	<ol>
		<li>将模板放置在指定的显微操作器上。使用倒置显微镜精确对齐图案结构与电极，并将模板缓慢下放至MEA表面（图2B）。 
		注意：与充分清洁的MEA接触时，PDMS与MEA本身之间会产生较强的粘附力。</li>
		<li>抬起显微操作器，如有需要，使用镊子在PDMS上方施加轻微压力，防止其从MEA上脱落。</li>
		<li>轻轻按压模板使其紧贴MEA表面，并使用显微镜确认其牢固附着且对位准确（图2C-D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将MEA放入真空室中15分钟；在模板上滴加1 ml PDL溶液。</li>
	<li>再将MEA放入真空室中处理2次，每次20分钟。随后将PDL置于培养箱中过夜干燥。</li>
	<li>铺板前，从MEA上移除PDMS模板，并用无菌水清洗。置于紫外灯下照射7分钟。</li>
</ol>
4. 解剖与培养
<ol>
	<li>按照 Herzog et al. 2011 21 中描述的方法制备培养物。</li>
</ol>
5. 涂布
<ol>
	<li>使用血细胞计数板计算铺板所需的细胞数量（根据结果部分讨论的微电路尺寸确定最佳密度）。
	<ol>
		<li>确保计数室（血细胞计数板）清洁，并在其上放置盖玻片（可用酒精清洁）。</li>
		<li>将10 µl细胞悬液加入190 µl铺板培养基中稀释（稀释比例为1:20）。</li>
		<li>取10 µl稀释后的细胞悬液，加至计数室边缘，缓慢吹打使液体自行充满计数室。</li>
		<li>使用倒置显微镜观察血细胞计数板的网格区域，通过直接计数确定细胞数量（健康细胞应呈圆形）。仅计数大格内完全位于其中的细胞，压线的细胞不计入。</li>
		<li>计算细胞浓度： 
		每1000 µl细胞总数 = 实际计数细胞数 × 稀释倍数 × 104（血细胞计数板的计数区域面积）。 
		注：例如，若稀释倍数为20，计数得到的细胞总数为100： 
		100 × 20 × 104 = 0.1 × 107 个细胞/1000 µl，或 1 × 106 个细胞/100 µl。若需铺板 0.75 × 106 个细胞，则取75 µl细胞悬液即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据每个MEA或培养皿所需的细胞数量取细胞，重悬细胞以防止聚集，并将细胞滴加于图案化区域中央（如有需要，可用培养基稀释细胞）。对于MEA，取100 µl滴加于中央；对于盖玻片，取1000 µl滴加于中央。</li>
	<li>将铺好的细胞在37 °C孵育40分钟，随后向每个MEA中加入铺板培养基至总体积1 ml，每个盖玻片中加至2 ml。</li>
	<li>维持在37 °C培养环境，每隔4天更换一次新鲜生长培养基，培养基中添加0.5 Pen-Strep、2% B-27和0.75% GlutaMAX。</li>
	<li>自第6至7天体外培养日（DIV）起，在观察到各微岛之间出现连接后，使用含10 µl/ml FUDR的培养基（将25 mg脱氧尿苷和62.5 mg尿苷溶于12.5 ml MEM（Eagle最小必需培养基））或其他抗有丝分裂试剂，以抑制胶质细胞过度生长。</li>
</ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+syntax%3A+cell+assemblies%2C+synapsembles%2C+and+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li>
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<li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li>
<li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li>
<li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li>
<li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一种培养二维模块化神经元网络的方案 体外 由功能上相互连接的神经回路构成的模块化神经网络构建方法被描述。该方法基于对细胞黏附层进行图案化，图案化过程使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩膜实现，该掩膜复制了目标网络结构的负像特征。PDMS掩膜界定了细胞黏附层的沉积区域。当细胞接种后，会自发地附着于涂层区域的岛状结构，并自组织形成具有活性且相互连接的神经回路。文中展示了利用多电极阵列（MEA）和钙成像技术记录的功能性模块化神经网络的活动数据。
与最初采用的方案相比，本方案已进行了适当的修改。首先，需要解决PDMS掩膜对准的问题。由于对准必须在第一次尝试时完成（一旦掩膜接触表面，不建议再次移动），因此通过放弃手动操作，改用一种新的方法来克服这一问题，即使用显微操作器将掩膜精确地沉积在MEA记录区域上。另一个需要解决的问题是防止PDL液滴渗入对准后的掩膜下方（否则无法获得所需的图案化结构）。为此，在掩膜对准后、滴加PDL液滴之前，需将所用装置（MEA或盖玻片）置于真空腔室中一段时间，以确保其与表面充分贴合。同样，在将PDL液滴置于掩膜上后，也需进行真空处理，以消除装置与液滴之...

实验和理论证据均支持大脑通过神经元细胞群的协调激活来运作这一可能性1-5，这些细胞群可被视为动态的功能单元，能够短暂地相互作用，从而形成并支撑不同的脑状态。功能模块化也依赖于并与脑回路的结构模块化组织相关联6,7。脑回路的结构与功能如何相互塑造，仍是神经科学领域尚未解决的主要问题之一。为了更深入地理解这一问题，识别出能够至少部分地探讨这些问题的理想实验框架至关重要。由于在in vivo实验中对神经网络时空动力学进行可控操纵具有挑战性，因此in vitro神经网络模型因其易于接近、监测、操控和建模而具有重要意义8,9。近年来，在先进基底图案化方法支持下的in vitro技术已能够诱导神经网络形成一系列预定义的模块化结构3，并研究具有特定拓扑结构的网络的功能特性10。特别是，最近已有方法通过施加物理约束来组织神经网络4,11。事实上，为了研究神经网络中结构与功能之间的联系，并提供对相互作用神经元群组的简化但合理的表征，in vitro系统应具备相互连接的神经元亚群。广泛研究的二维均质神经元培养体系不对回路自组织形成的连接施加任何空间限制。因此，一种可能的人工构建相互连接细胞群组的方法是将不同的神经元群体置于空间上分离的区域。这些区域之间的距离并不会阻碍群组间的连接。这种方法在确保对网络复杂性进行有效控制的同时，已被证明能够产生更丰富的同步模式谱系6,7,12。
为了实现模块化神经元组装的可重复培养，本文介绍并描述了一种将神经网络自组织构建成由轴突和树突连接的神经元簇的实验方案。用于物理限制神经元培养的聚合物结构由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。PDMS是一种弹性体，因其良好的生物相容性、透明性以及对气体的通透性，被广泛应用于生物医学领域13。通过在微加工的SU8 207514,15结构上旋涂液态PDMS，按照Jackman et al.16先前所述的方法，制备并去除了“&#34;母模&#34;”上的PDMS。所获得的图案化神经网络由不同尺寸的相互连接模块组成，并已成功在盖玻片和微电极阵列（MEAs）上实现17-20。模块间连接密度的变化可改变网络同步特性，从均匀培养物典型的完全同步状态，转变为模块间的瞬态同步状态。

<table><tbody><tr><td>PDMS，Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 真空室</td><td>Thermo</td><td>5305-0609</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸 PDL</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>硅脂 - SILICAID 1010</td><td>aidchim Ltd</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurell - Technologies Corporation</td><td>WS-650-23</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Sigma</td><td>CLS3336</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>Multi Channel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC02</td><td>Multi Channel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>03-033-1c</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>glutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM 最低必需培养基（Eagle）</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>01-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>微电极阵列 4Q</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td><td>清洁手册：&lt;a href=&quot;http://www.multichannelsystems.com&quot; target=&quot;_blank">http://www.multichannelsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>microchem</td><td>SU8-2075</td><td>制备方案：&lt;a href=&quot;http://www.microchem.com&quot; target=&quot;_blank">http://www.microchem.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

大脑通过神经元集合的协调激活和动态通信来运作。一个尚未解决的重大问题是，大脑回路的固定拓扑结构和模块化组织如何能够产生出支撑多种脑功能的丰富动力学模式。与 体内 神经元环路研究，其本身具有内在的实验难度， 体外 制备方法为操控和探究实验性神经元系统的结构、动力学及化学特性提供了更广阔的可能性。本文描述了一种 体外 一种实验方法，可培养由空间上分离但功能上相互连接的神经元组件构成的模块化神经网络。该方案能够在不同拓扑复杂度水平上调控神经元网络的二维（2D）结构架构。
在普通盖玻片和嵌入微电极阵列的基底上均可实现理想的神经网络图案化。通过在硅片上加工出微机械结构，制备出具有目标网络结构负形特征的生物相容性聚合物模板。在利用分子层对培养基底进行表面包被以促进细胞黏附的过程中，将该模板置于基底表面。移除模板后，接种神经元细胞，细胞会自发迁移至已包被的区域。通过调节隔室间的距离，可获得相互隔离或相互连接的神经环路。为促进细胞存活，将细胞与位于培养皿边缘的辅助性神经网络进行共培养。本文展示了利用嵌入式微电极阵列和钙成像技术分别对模块化神经网络进行电生理和光学记录的结果。每个模块均表现出自发的全局同步活动，而模块间的同步则由环路之间的连接密度所调控。

使用特征厚度约为 100 µm 的硅片上 SU8-2075 模具对 PDMS 进行塑形。图案由多个不同尺寸的正方形组成，边长和间距在 200 至 700 µm 之间变化（图 1B）。正方形的尺寸选择需适配 10X 物镜（适用于边长 &lt;800 µm 的岛状结构）和 20X 物镜（适用于边长 &lt;400 µm 的岛状结构）的视场范围。细胞接种密度、电路间距以及电路尺寸这三个参数对于形成单层或簇状电路，以及控制和塑造其连接性具有决定性作用。然而，这些参数并非相互独立：在两个电路间距固定的情况下，电路尺寸越大，它们自发建立连接的概率越高。在本研究讨论的示例中，对于约 300 × 300 µm 的小型神经元模块，当间距不超过约 300–400 µm 时可建立连接；而对于约 700 × 700 µm 的大型神经元模块，当间距小于约 700 µm 时即可建立连接。总体而言，通过增加正方形之间的距离，可以调节模块间自发形成互连的概率，从而实现从高度连接的模块网络向孤立模块的转变。
约600 x的神经元模块 600 µm 在第4天显示 体外</em...

本文描述了一种培养 体外 由空间上受限、功能上相互连接的神经元回路组成的模块化网络。使用聚合物掩模在培养基底上构图蛋白层，以促进细胞在特定区域的黏附。接种的神经元在包被区域生长，形成自发连接并表现出电生理活性.

大脑通过神经元集合的协调激活和动态通信来运作。一个尚未解决的重大问题是，如何从大量……

本实验的总体目标是体外培养由空间受限、功能完整且相互连接的神经元回路组成的模块化网络。首先，制备PDMS模板以在培养基底上形成促进细胞黏附的蛋白层图案；第二步，清洗培养基底。具体包括培养皿、盖玻片和多电极阵列的表面。接下来，将PDMS掩膜放置在培养基底上，形成所需的黏附蛋白层图案。最后一步是接种神经元-胶质细胞。最终，通过多电极阵列记录和钙成像来展示所构建的模块化神经元网络的动力学特性。该方法有助于回答神经科学领域中的一些关键开放性问题，例如研究神经元集群之间通讯的动力学机制，并可在不同实验条件下进行对照实验。聚二甲基硅氧烷（PDMS）的制备首先将一份固化剂与十份基础剂混合。混合5分钟后，将混合物转移至真空室中处理15分钟。15分钟后，检查是否有气泡，如有必要，将溶液重新放回真空室再处理15分钟。接下来，在旋涂仪上准备硅片。打开氮气的气体阀门。将一片晶圆放在旋转器上，并用真空固定。然后在晶圆上浇注一层薄薄的PDMS。以1000 RPM的转速旋转带有PDMS的晶圆1分钟，使晶圆表面形成厚度为100微米的PDMS涂层。随后将晶圆转移至100摄氏度的加热板上，烘烤30分钟。待PDMS固化后，使用移液器将更多PDMS沿模板的边界描出。然后将添加的PDMS在晶圆上烘烤固化。与之前相同，当PDMS边界完全硬化后，沿边界切割模板，并将硅胶模板从晶圆上取下，以开始RINs实验。用蒸馏水、70%乙醇、丙酮、异丙醇，最后再用蒸馏水依次清洗23毫米见方的玻璃盖玻片。再次在氮气气流下吹干。接着，将一片带有图案的PDMS掩膜轻轻压到每片盖玻片上。将带有模板的盖玻片放入真空腔中抽真空15分钟。抽真空后，在模板上滴加1毫升PDL，并将组装件放回真空腔中继续抽真空20分钟。重复20分钟的抽真空步骤一次，然后于次日让PDL过夜干燥。准备用于支持神经网络细胞的培养皿。首先，在3.5厘米的培养皿中加入1毫升PDL，室温下孵育2小时。随后，用抽吸法将培养皿中的PDL去除。然后用蒸馏水清洗培养皿，并将其放置晾干。待培养皿干燥后，根据盖玻片的四个角，在培养皿内加入少量硅脂。将盖玻片放置在培养皿上，使 PDMS 面朝上，并轻轻按压以确保其牢固粘附。现在用镊子轻轻将 A-P-D-M-S 从盖玻片上剥离，留下 PDL 图案。最后将培养皿暴露于紫外线下七分钟进行灭菌。首先，用自来水冲洗多电极阵列进行清洁，然后将其置于浓酶性洗涤剂中进行超声处理。重复这些步骤三次。然后在通风橱中用纯化蒸馏水对MEA进行三次超声处理。在超声处理前，用蒸馏水清洗MEA。用紫外光照射30分钟进行灭菌。接下来，首先制备支撑网络。将PDMS倒入12孔或24孔板中。待 PDMS 硬化后，用针将其移除。现在在圆片中心打孔，制成可作为模具支撑的环状结构。然后将模具支撑置于 MEA 的中心，并覆盖 MEA 的外部暴露表面。在室温下静置两小时。然后吸除PDL洗涤液，用蒸馏水清洗MEA的外部暴露表面，并移除模具支撑，使MEA自然干燥。现在，在倒置显微镜下将模板固定至已准备好的显微操作器上。检查并调整图案化结构的位置，使其与MEA的电极对齐。然后使用显微操作器将掩模缓慢下降至MEA表面。一旦附着，抬起显微操作器，必要时使用镊子施加轻微压力，以防止PDMS脱落。将MEA转移至真空室中处理15分钟。随后，在掩膜上加入1毫升PDL液滴，再次放入真空室中，进行两次每次20分钟的处理。次日让PDL过夜干燥。使用镊子从测量装置上移除PDMS模板。最后，对测量装置进行七分钟的紫外灭菌。随后即可用于细胞，按照文本方案中的步骤进行培养细胞和制备悬浮液。在复苏并悬浮所需数量的细胞后，将细胞接种于MEA或盖玻片上图案化区域的中央。MEA应加载100微升体积，而盖玻片可容纳1000微升。将培养板中的细胞孵育40分钟，随后每隔四天添加铺板培养基以维持细胞生长，并补充新鲜的含添加剂的生长培养基。第六或第七天后，各模块之间的神经元连接应开始形成。将培养基与抗有丝分裂剂混合稀释，以防止胶质细胞过度生长。体外培养四天后，可在14天时观察到神经元附着于直径为600微米的PD DL编码区域。在培养过程中，神经元在模块内以及模块间自发形成连接，构建出具有活性的功能性神经网络。在保持相同铺板浓度的同时，利用PDMS的特征尺寸观察了300微米见方的神经元回路。使用Forex物镜进行钙成像，以广泛检测培养神经网络中的活动。绿色和粉色模块之间显示出较多的连接，而蓝色和红色模块与其他模块的连接较少。图中显示了以每秒30帧、百万像素图像采集的一段视频中钙事件起始时间的序列图。绿色和粉色模块高度同步，而蓝色和红色模块同步性较低。因此，在体外培养21天时，记录到一个由三个不同回路组成的皮层模块化网络。利用MEA发现相距约600微米的神经元回路相互连接。重建了它们的电生理活动。通过精确的时序脉冲检测算法，对五分钟的数据生成了带有颜色编码聚类信息的阵容图。这提供了全网络与单个簇活动的比较，并有助于深入了解簇内同步性。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备PDM模板，并利用其对神经胶质细胞的黏附进行图案化，从而建立功能性的模块化网络。

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科研

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Neuroscience

神经科学

设计，表面处理，电镀细胞和神经元的模块化网络功能组成跨接电路的培养

本方案提供了在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的全部信息。In vitro...

如何在微电极阵列（MEAs）上培养、记录和刺激神经元网络

已开发出一种通用的等离子体光刻技术，可用于生成稳定的表面图案，以引导细胞附着。该技术可用于构建细胞网络，包括模拟天然组织的细胞网络，并已应用于研究多种不同类型的细胞。...

等离子体光刻表面图案化用于构建细胞网络

本视频展示了利用海马神经元构建三维神经元培养物并与平面微电极阵列耦合的方法。分离的神经元在微电极阵列的活性区域上形成二维网络，并附着于带有膜插件的多孔板中的玻璃微珠上。当将这些带有神经元的微珠转移至电极上时，它们会自组织成相互连接的三维神经网络。...

构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

本视频展示了在图案化多电极阵列（MEA）上培养神经元细胞以构建模块化神经元网络的过程。该方法可用于研究神经信号传递和细胞间相互作用。...

在多电极阵列上构建图案化神经元环路

本文描述了用于单神经元微流控阵列化以及芯片内生物材料涂层等离子体图案化水掩模技术的实验方案。利用极少的细胞输入即可制备高度互连的共培养体系。...

单细胞精度神经元共培养体系的制备

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本方案描述了使用塑料芯片培养和分隔原代小鼠神经元的方法。这些芯片为预组装设计，操作简便，且适用于高分辨率、活细胞及荧光成像。本方案详细说明了如何在这些芯片中接种大鼠海马神经元，并进行流体隔离、轴突切断和免疫染色操作。...

使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

本方案展示了使用环状烯烃共聚物注塑成型的分区化微流控芯片培养由人类干细胞分化而来的神经元。这些芯片为预组装设计，相较于传统的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）分区装置更易于使用。文中描述了多种常见的实验范式，包括病毒标记、流体隔离、轴突切断以及免疫染色。...

人干细胞来源神经元在预组装塑料微流控芯片内的区室化培养

在微米尺度上进行3D打印，能够快速制备用于神经元细胞培养的聚合物装置。作为原理验证，通过构建影响神经突生长的屏障和通道来限制神经元之间的结构连接，同时通过细胞外电生理记录观察此类操作的功能性后果。...

双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

学习使用PDMS模板制备技术培养体外模块化神经元网络，通过蛋白质层图案化促进细胞粘附，实现空间受限的功能性神经回路连接，并利用多电极阵列记录和钙成像分析网络动态特性。

由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养

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