由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养

本实验的总体目标是在体外培养出由空间上受限、功能完整且相互连接的神经元回路组成的模块化网络。首先，制备PDMS模板以在培养基底上形成蛋白质层图案，从而促进细胞在培养基底上的黏附；第二步是清洗培养基底。

具体包括培养皿、盖玻片和多电极阵列的表面。接下来，将PDMS模板放置在培养基底上，形成所需的黏附蛋白层图案。最后一步是接种神经元-胶质细胞。

最终，通过多电极阵列记录和钙成像来展示所构建的模块化神经元网络的动力学特性。该方法有助于回答神经科学领域中的一些关键开放性问题，例如研究神经元集群之间通讯的动力学过程，并可在不同的实验条件下进行对照分析。聚甲基硅氧烷（PDMS）的制备首先需要将一份固化剂与十份基础剂混合。

混合5分钟后，将混合物转移至真空室中处理15分钟。15分钟后，检查是否有气泡，并将溶液再次放回真空室中继续处理15分钟。接下来，在旋涂机上准备硅片。

打开氮气的气体阀门。将一片晶圆放在旋转器上，并用真空固定。然后在晶圆上浇注一层薄薄的PDMS。

将带有PDMS的晶圆在1000 RPM转速下旋转1分钟，使晶圆表面形成厚度为100微米的PDMS涂层。然后将晶圆转移至100摄氏度的加热板上，烘烤30分钟。

PDMS 固化后，使用移液器将更多 PDMS 涂在模板的边界上以勾勒轮廓。然后将添加的 PDMS 在晶圆上烘烤固化。与之前相同，当 PDMS 边界固化后，沿边界切割模板，并将硅胶模板从晶圆上取下，以开始 RINs 实验。

用蒸馏水清洗23毫米见方的玻璃盖玻片，随后依次用70%乙醇、丙酮、异丙醇和蒸馏水清洗。再次在氮气气流下吹干盖玻片。接着，将一块带有图案的PDMS掩膜轻轻压到每块盖玻片上。

将带有模板的盖玻片放入真空腔室中抽真空15分钟。抽真空后，在模板上滴加1毫升PDL，并将组装件放回真空腔室中继续抽真空20分钟。重复20分钟的抽真空步骤一次，随后于次日让PDL过夜干燥。

准备用于支持神经网络细胞的培养皿。首先，在3.5厘米的培养皿中加入1毫升PDL，室温下孵育2小时。随后，用抽吸法将培养皿中的PDL去除。

然后用蒸馏水清洗培养皿，并将其晾干。待培养皿干燥后，根据盖玻片的四个角，在培养皿中加入少量硅脂。将盖玻片放置在培养皿上，使PDMS面朝上，轻轻按压以确保其牢固粘附。

现在用镊子轻轻将 A-P-D-M-S 从盖玻片上剥离，留下 PDL 图案。最后将培养皿暴露于紫外线下七分钟进行灭菌。首先，用自来水冲洗多电极阵列进行清洁，然后将其置于浓酶性洗涤剂中进行超声处理。

重复这些步骤三次。然后在通风橱中用纯化蒸馏水对MEA进行三次超声处理。在超声处理前，用蒸馏水清洗MEA。

用紫外光照射30分钟进行灭菌。接下来，首先制备支撑网络。将PDMS倒入12孔或24孔板中。

待PDMS硬化后，用针将其取下。然后在圆片中心打孔，制成环状结构，用作模具支撑。接着将模具支撑置于MEA的中心，并覆盖MEA的外部暴露表面。

在室温下静置两小时。然后吸除PDL洗涤液，用蒸馏水清洗MEA的外部暴露表面，并移除模具支撑，使MEA自然干燥。现在，在倒置显微镜下将模板固定至已准备好的显微操作器上。

检查并调整图案化结构，使其与MEA的电极对齐。然后使用显微操作器将掩模缓慢下降至MEA表面。一旦附着，抬起显微操作器，如有需要，可用镊子施加轻微压力，以防止PDMS脱落。

现在将MEA转移至真空室中处理15分钟。然后在掩膜上加入1毫升多聚赖氨酸（PDL）液滴，并再次放入真空室中，进行两个循环、每个循环20分钟的处理。次日让PDL过夜干燥。

使用镊子从测量装置上取下P DM S模板。最后，对测量装置进行七分钟的紫外线灭菌。随后即可用于细胞，按照文中实验方案进行培养细胞的准备和悬浮液的制备。

在Resus中悬浮所需数量的细胞后，将其接种于MEA或盖玻片上图案化区域的中央。MEA应加入100微升体积，盖玻片则可容纳1000微升。

将培养板中的细胞孵育40分钟，然后每隔四天添加铺板培养基以维持细胞生长。补充新鲜的完全生长培养基。在第六或第七天后，各模块之间的神经元连接应开始形成。

将培养基与抗有丝分裂试剂混合稀释，以防止胶质细胞过度生长。体外培养四天后，可在14天时观察到神经元附着在直径为600微米的PD DL编码区域。在培养过程中，神经元在模块内以及模块间自发形成连接，构建出具有活性的功能性神经网络。

在保持相同铺板浓度的同时，利用PDMS的特征尺寸观察了300微米见方的神经元回路。使用Forex物镜进行钙成像，以广泛检测培养神经网络中的活动。绿色和粉色模块之间显示出较多的连接，而蓝色和红色模块与其他模块的连接较少。

显示了以30赫兹采集、图像分辨率为100万像素的视频中钙信号事件起始时间的序列图。绿色和粉色模块高度同步，而蓝色和红色模块同步性较低。因此，在体外培养21天时记录到一个由三个不同回路组成的皮层模块化网络。

利用MEA发现相距约600微米的神经元回路之间存在相互连接。对其电生理活动进行了重建。通过精确的时序脉冲检测算法，生成了该数据五分钟时长的轮次图，并以颜色编码的聚类数据进行标注。

这提供了全网络与单个簇活动的比较，并有助于深入了解簇内同步性。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备PDM模板，并利用其对神经胶质细胞的黏附进行图案化，从而建立功能性的模块化网络。