Name: rna 干扰的实际应用: 口服双链 rna 在脂质体载体为蟑螂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解利用脂质体包裹双链RNA通过口服方式对德国小蠊进行RNA干扰的实验方法。该技术可有效沉默中肠基因表达，为开发新型害虫防治策略提供重要依据。

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本研究获得了中国台湾科技部（MOST 100-2923-B-002-002-MY3 和 106-2313-B-002-011-MY3，授予 H.J.L.）、捷克共和国南波希米亚大学资助机构（GAJU 资助项目 065/2017/P，授予 Y.H.L.）以及西班牙经济与竞争力部（CGL2012-36251 和 CGL2015-64727-P，授予 X.B.）和加泰罗尼亚政府（2014 SGR 619，授予 X.B.）的资助；同时也得到了欧洲区域发展基金（FEDER 资金，授予 X.B.）的财政支持。

1. 双链RNA的合成与制备
<ol>
	<li>在目标基因的3'非翻译区中确定dsRNA靶向位点。dsTub用于靶向α-微管蛋白（tub）基因（GenBank登录号：KX228233），dsEGFP作为阴性dsRNA对照，设计自增强型绿色荧光蛋白（EGFP；GenBank登录号：LC311024）的序列。</li>
	<li>使用含有T7启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）的基因特异性引物进行标准PCR扩增，以合成dsRNA模板。PCR扩增条件和引物信息参见Lin et al. (2017)12（见材料表）。</li>
	<li>使用T7转录试剂盒（见材料表）并按照制造商说明书进行dsRNA制备。 
	注意：为获得高产量dsRNA，将两个反应混合于同一管中（总体积40 µL），37 °C孵育过夜。</li>
	<li>向dsRNA样品中加入2 µL DNase（见材料表），37 °C孵育15分钟，以消化DNA模板。</li>
	<li>加入200 µL提取试剂（见材料表）和40 µL氯仿，涡旋混匀。</li>
	<li>4 °C下以13,000 x g离心10分钟，收集上清液（150 µL）至新的微量离心管中。</li>
	<li>加入150 µL异丙醇，冰上孵育15分钟，沉淀dsRNA。</li>
	<li>4 °C下以13,000 x g离心15分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入200 µL 70%乙醇洗涤dsRNA沉淀。4 °C下以13,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>弃去乙醇，并重复乙醇洗涤步骤。</li>
	<li>弃去乙醇后，使用离心真空浓缩仪干燥dsRNA沉淀3分钟，然后用无RNase水重悬dsRNA。</li>
	<li>使用微量紫外-可见分光光度计（见材料表）按照制造商说明书测定纯化后dsRNA的浓度，并调整至所需浓度（例如，制备dsRNA脂复合物时为0.25 µg/µL）。</li>
	<li>将dsRNA样品于-20 °C保存，最长可保存3个月。</li>
</ol>
2. 双链RNA脂质复合物的制备
<ol>
	<li>将4 µL转染试剂（参见材料表）加入4 µL 5%葡萄糖溶液中进行稀释。将4 µL双链RNA（1 µg）加入4 µL 5%葡萄糖溶液中进行稀释。</li>
	<li>立即将稀释后的脂质体试剂溶液一次性全部加入稀释后的dsRNA溶液中。短暂涡旋混匀，然后在25 °C下孵育15分钟。 
	注意：切勿以相反顺序混合溶液。</li>
	<li>dsRNA脂复合物现已可使用。配制后1小时内使用，超过1小时后弃用。 
	注意：根据生产商说明书，脂复合物应尽快使用。</li>
</ol>
3. 蚕血淋巴和中肠液中外源酶的收集
<ol>
	<li>昆虫生理盐水缓冲液（10x）&#160;储备液
	<ol>
		<li>将900 mL双蒸水与109.3 g NaCl、15.7 g KCl、6.3 g CaCl混合2，以及 8.3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>调节pH至6.8，并加水定容至1,000 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血淋巴采集
	<ol>
		<li>将蟑螂置于冰上麻醉，直至其静止不动达3分钟。</li>
		<li>用两根手指（拇指和食指）握住蟑螂，将其腹面朝上。</li>
		<li>使用解剖剪剪下后肢基节的末端。 
		注意： 切断基节与转节之间的连接处。切除基节的其他部分收集血淋巴的效率较低。</li>
		<li>用中指轻轻挤压腹部，用10 µL微量移液器收集从切口流出的血淋巴。</li>
		<li>将多只蟑螂（5只个体）的血淋巴收集至微量离心管中。 
		注意： 将微量离心管置于冰上以防止黑色素化。从一只雄性蟑螂获得的血淋巴平均体积为 2 - 3 µL。</li>
		<li>用台式离心机将血淋巴短暂离心10秒。</li>
		<li>转移所需体积的血淋巴（即，10 µL），与50 µL的1x混合&#160;昆虫生理盐水缓冲液</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 1,000 x g 离心 10 分钟，使血细胞沉淀。将上清液转移至新的洁净微量离心管中。</li>
		<li>使用微量紫外-可见分光光度计通过测量A280来定量总蛋白浓度15.</li>
		<li>将每个样品调整至相同的蛋白浓度（总蛋白浓度为 6 mg/µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中肠汁液采集
	<ol>
		<li>将蟑螂置于冰上麻醉。用冰冷的1x溶液将蟑螂腹面朝上固定在解剖板上&#160;使用昆虫针将昆虫生理盐水缓冲液固定。</li>
		<li>用精细镊子解剖腹部。将整个肠道（包括前肠、中肠和后肠）移至含有1x溶液的新培养皿中&#160;昆虫生理盐水缓冲液</li>
		<li>移除前肠和后肠，迅速将中肠转移至含有 100 µL 昆虫生理盐水缓冲液的微量离心管中。</li>
		<li>将六只蟑螂的中肠合并至同一管中，涡旋振荡10秒。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟，使血细胞和肠道组织沉淀。将上清液转移至新的洁净微量离心管中。</li>
		<li>使用微量紫外-可见分光光度计通过测量A280来定量总蛋白浓度15.</li>
		<li>将每个样品调整至相同的蛋白浓度（总蛋白浓度为 6 mg/µL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. dsRNA 降解实验
<ol>
	<li>新鲜配制4 µL的裸露dsRNA或dsRNA脂复合物（1 µg）。</li>
	<li>将dsRNA溶液与10 µL昆虫生理缓冲液（对照）、血淋巴提取的酶或中肠液混合。</li>
	<li>向不同样品中分别加入2 µL EGTA（20 mM）或无RNase水，作为抑制酶活性的对照。</li>
	<li>在25 °C下孵育1小时或更长时间（6、12或24小时）。</li>
	<li>加入200 µL提取试剂和40 µL氯仿，然后涡旋振荡。</li>
	<li>在4 °C下以13,000 x g离心10分钟，然后将上清液（150 µL）转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>加入150 µL异丙醇沉淀dsRNA，并在冰上孵育15分钟。</li>
	<li>在4 °C下以13,000 x g离心15分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>加入200 µL 70%乙醇洗涤dsRNA沉淀。在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>弃去乙醇，并重复乙醇洗涤步骤。</li>
	<li>弃去乙醇，使用离心真空浓缩仪干燥dsRNA沉淀3分钟。用10 µL无RNase水重悬dsRNA。</li>
	<li>通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测处理后dsRNA的完整性。</li>
</ol>
5. 口服给予dsRNA
<ol>
	<li>保持蟑螂在 随意摄取 以干燥食物（狗粮）喂养。在进行dsRNA摄入实验前1天，停止供应水源。</li>
	<li>用弯头镊子夹住蟑螂的翅膀以固定（图1, 步骤5). 
	注意： 不要抓握蟑螂的身体部位。</li>
	<li>按照第2节所述，制备用于饲喂的dsRNA脂复合物以及裸露的dsRNA。 
	注意： dsRNA脂质复合物应在饲喂前新鲜配制。</li>
	<li>用微量移液器加入4 µL的dsRNA脂质复合物或裸露dsRNA（250 ng）。</li>
	<li>用移液器将双链RNA溶液的液滴缓慢靠近蟑螂的口器，使其完全摄入该液滴。</li>
	<li>每天进行两次摄食实验（开灯后1小时和关灯前1小时），持续8天或16天。 
	注意： 所有蟑螂仅通过人工喂食dsRNA溶液或对照试剂获取水分（例如无核酸酶水、葡萄糖溶液和脂质体试剂）用于摄食实验。</li>
	<li>在连续摄入dsRNA实验16天后，为蟑螂提供水瓶。</li>
</ol>
6. 评估基因敲低效果
<ol>
	<li>在选定的时间点（dsRNA摄入实验后的第2、9和17天），收集经dsEGFP和dsTub处理的昆虫，并解剖选定的组织（例如，中肠）。</li>
	<li>进行定量实时PCR（qRT-PCR）。qRT-PCR扩增条件及引物信息参见Lin 等.（2017）12。</li>
	<li>每天评估对照组和dsRNA处理组昆虫的死亡率，并移除不再活动的蟑螂。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了一种通过口服递送dsRNA脂复合物实现高效RNA干扰的方法，其中dsRNA可免受德国小蠊中肠液中核糖核酸酶的降解作用。正如在多种昆虫中开展的其他研究所表明的，口服递送dsRNA效果较差的主要原因是dsRNA在消化道中被降解8,9,10。本方案制备的脂质体可作为保护性载体，防止口服递送的dsRNA在肠道中发生降解。此外，dsRNA脂复合物的制备方法简便，易于应用于口服RNA干扰，尤其适用于肠道核糖核酸酶活性较强的昆虫。
与其他研究中向不同昆虫喂食相对大量裸露dsRNA的方法相比10,18,19，本方案采用口服给予相对低剂量的dsRNA（每天0.5 µg），可显著降低中肠中靶基因的表达水平 B. ...

RNAi 已被证明是一种有效的基因表达敲低方法，其机制是通过双链 RNA（dsRNA）分子在许多真核生物中触发转录后沉默通路1。在过去十年的研究中，RNAi 已成为研究基因功能的有用工具，可通过注射和/或喂食 dsRNA 的方式，在多种昆虫分类群中实现特定基因表达的耗竭，从而研究基因在发育到行为等方面的功能2,3。由于其靶向特异性强且基因耗竭效果显著，RNAi 的应用目前正被考虑作为一种潜在的害虫防控管理策略4,5。然而，RNAi 的效率在不同昆虫物种之间差异显著，这取决于靶向的基因种类以及递送方法。越来越多的证据表明，dsRNA 的不稳定性（由核糖核酸酶降解所致）是导致 RNAi 效率受限的关键因素5,6。例如，烟草天蛾（Manduca sexta）中 RNAi 敏感性较低的原因在于，dsRNA 与血淋巴混合后在1小时内即被迅速降解7。类似地，中肠中存在的碱性核酸酶能够高效降解摄入的 dsRNA，这与多个昆虫目中 RNAi 效率低下密切相关8,9,10。
口服递送dsRNA在RNA干扰（RNAi）用于害虫防治策略中具有重要意义，但目前尚未开发出能够延缓dsRNA在中肠核酸酶作用下降解的方法，而此类方法有望确保通过摄食实现有效的RNAi效应。然而，已有研究报道，通过喂食大量dsRNA后，RNAi并未产生应答。 例如 50 µg Bombyx mori，或在蝗虫物种中连续饲喂8天（总共8 µg dsRNA）。德国小蠊， Blattella germanica对通过注射dsRNA进行的RNAi具有高度敏感性11,12,13,14，但通过摄食对dsRNA无响应。最近，Lin 等 (2017) 已证明，使用脂质体载体包裹的dsRNA可成功实现RNA干扰，从而敲低目标基因 α-tubulin 中肠基因表达及引发德国小蠊显著死亡率15由于dsRNA在中肠中的降解是口服RNA干扰的限制因素，脂质体载体可作为保护dsRNA免于降解的运载工具，该方法也适用于肠道核酸酶活性较强的其他昆虫。值得注意的是，选择特定转染试剂的原因（见 材料表）我们在本方案中用作脂质体载体的优势在于，根据制造商的说明，该脂质体在昆虫细胞系转染中经过测试，具有较低的细胞毒性。根据Gharavi对不同脂质体转染系统的比较研究 等 (2013)16，该系统与其它已用于其他昆虫dsRNA递送的商业化系统相比，转染小干扰RNA（siRNA）的效率大致相同17,18此外，我们的饲喂方法能够精确确保每只蟑螂摄入适量的dsRNA，并且实验结果可靠且经过验证。总之，本研究的方案和结果表明，使用dsRNA脂质复合物可提高dsRNA的稳定性，为设计RNA干扰的口服递送策略提供了可能，这一方法在未来害虫防控中具有广阔的应用前景。

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA 体外转染试剂</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>用于脂质复合物制备</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&amp;nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>4385612</td><td>用于 qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>用于 3' UTR 鉴定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>用于双链 RNA 合成</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>从双链 RNA 中去除 DNA 模板</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>用于双链 RNA 或总 RNA 提取</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>从总 RNA 中去除 DNA 模板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>用于双链 RNA 或总 RNA 提取</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>用于双链 RNA 或总 RNA 提取</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>用于双链 RNA 或总 RNA 提取</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>用于制备无 RNase 水</td></tr><tr><td>葡萄糖溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>用于脂质复合物制备</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>昆虫生理盐水缓冲液配方</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>昆虫生理盐水缓冲液配方</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>昆虫生理盐水缓冲液配方</td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>昆虫生理盐水缓冲液配方</td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>酶抑制剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>蟑螂解剖</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>蟑螂解剖</td></tr><tr><td>柔性镊子</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>固定蟑螂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器（Pipetman）</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>样品制备</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Minispin 离心机</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>用于液体离心沉淀&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>pH 计&amp;nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>用于 pH 调节</td></tr><tr><td>微量分光光度计</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>核酸定量</td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>2720</td><td>用于模板 PCR 或&amp;nbsp; 双链 RNA 合成孵育&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>实时定量 PCR 仪</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>基因表达定量</td></tr><tr><td>离心式真空浓缩仪</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>用于双链 RNA 或总 RNA 提取</td></tr><tr><td>Multipette&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>用于实时 PCR 样品加样&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>琼脂糖 I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>用于核酸电泳</td></tr><tr><td>tub 基因特异性正向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub 基因特异性反向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub 模板正向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub 模板反向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP 模板正向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP 模板反向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR 正向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>tub qPCR 反向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR 正向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCR 反向引物</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

rna干扰的实际应用：利用脂质体载体口服递送双链rna至蟑螂

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA干扰（RNAi）已广泛应用于揭示众多基因的生物学功能，并被视为一种通过破坏必需基因表达来实现害虫控制的工具。尽管已有不同方法（如注射、饲喂和浸泡）被报道可成功递送双链RNA（dsRNA），但通过口服途径递送dsRNA的RNAi效率在不同昆虫类群中差异显著。德国小蠊（Blattella germanica）对dsRNA注射具有高度敏感性，此前已有多项研究证实了这一点。本研究描述了一种方法，证明使用脂质体载体包裹的dsRNA足以延缓中肠液对dsRNA的降解。值得注意的是，持续饲喂脂质体包裹的dsRNA可显著降低中肠中微管蛋白的表达，并导致蟑螂死亡。综上所述，利用可保护dsRNA免受核酸酶降解的dsRNA脂质复合物（lipoplexes），可能是未来RNAi在害虫防控中实际应用的一种可行策略。

口服递送dsRNA方案的简化流程见图1，其中展示了制备dsRNA脂复合物的关键步骤。
为了研究脂质体载体对中肠液中dsRNA降解的保护作用 B. germanica，一个 离体 将dsTub脂复合物与中肠液共同孵育，随后在1.5%琼脂糖凝胶上分析dsRNA的完整性。 图2 表明中肠液中存在强烈的RNA核酸酶活性 B. germanica (图2A），而脂质体载体能够在至少1小时内保护dsRNA不被降解 离体 孵育图2A，B因此，在后续实验中，每天两次口服摄入dsRNA脂质复合物，...

本论文通过口服摄入包裹在脂质体中的双链RNA，展示了德国小蠊中肠基因表达的耗竭。

RNA干扰的实际应用：利用脂质体载体口服递送双链RNA至蟑螂

RNA干扰（RNAi）已广泛应用于揭示众多基因的生物学功能，并被视为一种害虫控制工具……

本实验方案的总体目标是通过口服摄入由脂质体载体包裹的双链RNA，利用RNA干扰技术降低蟑螂肠道中的基因表达。该方法有助于回答害虫防治新技术研发中的关键问题，例如：在开放环境中敲低必需基因是否能够杀死害虫？该技术的主要优势在于，脂质体可保护基因特异性的双链RNA，确保其有效递送至靶细胞。演示该实验步骤的是我实验室的博士后黄Jia-Hsin和技师刘Yun。首先，将蟑螂置于冰上麻醉，直至其静止不动达三分钟。随后，用拇指和食指拿起一只昆虫，使其腹面朝上。接下来，使用解剖剪在后肢基节与转节之间的位置剪断基节末端。在基节其他位置剪切会降低血淋巴采集效率。现在，将一支10微升微量移液器置于切口处，轻轻挤压腹部，同时吸取流出的血淋巴。重复此过程，直至将五只蟑螂的血淋巴收集到同一个微量离心管中。接下来，将混合的血淋巴短暂离心10秒。然后，取10微升血淋巴与50微升1×昆虫生理盐水缓冲液混合。现在，将稀释后的血淋巴离心10分钟，以沉淀血细胞。然后，将上清液转移至新管中。最后，使用微体积紫外-可见分光光度计测定总蛋白浓度，并将每个样品的浓度调整为每微升含6毫克蛋白。为了收集中肠汁液，首先将蟑螂置于冰上进行麻醉。然后将其转移至盛有冰冷的1×昆虫生理盐水缓冲液的解剖板上，用昆虫针固定，使腹部朝上。接着，使用精细镊子解剖腹部。然后，取出整个肠道，并将其转移至含有1×昆虫生理盐水缓冲液的新培养皿中。接着分离中肠，即位于嗉囊与马氏管之间的区域。为此，移除动物的前部结构以及后肠部分。接下来，迅速将中肠转移至含有 100 µL 昆虫生理盐水缓冲液的微量离心管中。将六只蟑螂的中肠收集到同一根离心管中。然后，涡旋振荡该离心管 10 秒。接下来，将混合物离心10分钟，以分离血细胞和肠道组织。然后，将上清液转移至洁净的微量离心管中，并调整蛋白浓度至每微升含6毫克蛋白。双链RNA脂复合物必须在制备后1小时内使用。在制备过程中，务必同时将所有稀释后的试剂与稀释后的双链RNA混合。然后迅速涡旋并孵育该混合物。待准备就绪后，取4微升双链RNA溶液与10微升昆虫生理盐水缓冲液混合作为对照，或与10微升来自血淋巴或中肠液的提取酶混合。接下来，通过加入 2 µL EGTA 制备酶抑制对照；否则，加入 2 µL 无 RNase 水。然后，在 25 °C 下孵育样品 1 小时或更长时间。孵育后，加入200微升提取试剂和40微升氯仿，然后涡旋振荡。接下来，将样品离心10分钟。随后，将每个上清液中的150微升转移至新管中，通过加入150微升异丙醇并在冰上孵育15分钟，使每个样品中的双链RNA沉淀。孵育结束后，再次离心样品并弃去上清液。随后，通过向每个沉淀中加入200 µL 70%乙醇并离心管体，对RNA沉淀进行两次洗涤。第二次洗涤后，使用离心真空浓缩仪干燥双链RNA沉淀，持续3分钟。然后，将沉淀重悬于10 µL无RNase的水中。最后，使用1.5%琼脂糖凝胶检测处理后的双链RNA的完整性。每天喂养蜚蠊两次，分别在光照开始后一小时和光照结束前一小时进行。连续进行 8 或 16 天，中间不得中断。在此期间，应使蟑螂完全断水。喂食时，需准备好 freshly prepared 双链 RNA 脂质复合物和裸露的双链 RNA。对于推注，使用4 µL双链RNA脂质复合物或250 ng裸双链RNA。喂食蟑螂时，首先用柔软的镊子夹住其翅膀。切勿抓握蟑螂的身体部位。然后，缓慢地将一滴溶液用移液器滴至蟑螂口器附近，观察其摄入液滴的过程。最后一次喂食后，为蟑螂提供水瓶。在整个喂养期间，每天对昆虫进行观察，检查其死亡情况，并将不再活动的个体及时从实验中移除。持续口服给予双链tub脂质复合物可使中肠中微管蛋白表达量从第9天的40%下降至第17天的60%。相比之下，裸露的双链RNA无此效果。这很可能是因为裸露的双链RNA在接触中肠液后1小时内即被降解，而脂质体偶联的双链RNA则保持稳定。不仅RNA水平下降，持续喂食微管蛋白双链RNA脂质复合物还导致显著的致死效应。这种致死效应不太可能由载体引起，因为携带EGFP双链RNA的脂质复合物未导致任何致死现象。在尝试这种RNA干扰的口服递送系统时，重要的是要连续数天持续喂食双链RNA。一旦掌握，只要操作得当，每只昆虫的饲喂步骤可在两分钟内完成。如有需要，可采用不同配方的脂质体纳米颗粒，以优化饲喂过程和提高RNAi效率。最终，该技术使得害虫管理领域的研究人员能够利用RNAi探索新的防控策略。

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rna 干扰的实际应用: 口服双链 rna 在脂质体载体为蟑螂

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