rna 干扰的实际应用: 口服双链 rna 在脂质体载体为蟑螂

该方案的总体目标是通过口服摄入封装在脂质体载体中的双链 RNA 来使用 RNA 干扰耗尽蟑螂肠道中的基因表达。这种方法可以帮助回答开发新的害虫防治方法中的关键问题，例如在旷野中敲除基本基因可以杀死害虫吗？该技术的主要优点是脂质体保护基因特异性双链 RNA，以确保其递送到靶细胞。

演示该程序的是博士后 Jia-Hsin Huang 和我实验室的技术员 Yun Liu。首先，在冰上麻醉蟑螂，直到它们在三分钟内不动。然后，用拇指和食指捡起昆虫，进入昆虫的腹侧。

接下来，用解剖剪刀剪掉尾部和转子之间的后腿尾部尖端。切开髋关节的其他部位对血淋巴积液的效率较低。现在，将 10 微升微量移液器放在切口处，轻轻挤压腹部，同时吸出出血的血淋巴液。

重复此过程，直到将 5 只蟑螂的血淋巴液收集到单个微量离心管中。接下来，短暂地将汇集的血淋巴液向下旋转 10 秒钟。然后，将 10 微升血淋巴液与 50 微升 1x 昆虫盐水缓冲液混合。

现在，将稀释的血淋巴液离心 10 分钟，以将血细胞从溶液中拉出。然后，将上清液转移到新试管中。最后，使用微量紫外-可见分光光度计定量总蛋白质浓度，并将每个样品的浓度调节至每微升 6 毫克蛋白质。

要收集中肠汁，首先，在冰上麻醉蟑螂。然后，将一个转移到装有 1 倍冷昆虫盐水缓冲液的解剖板上，并使用昆虫针将其腹侧向上固定。现在，用细镊子解剖腹部。

然后，取出整个肠道，并将其转移到含有 1x 昆虫盐水缓冲液的新鲜培养皿中。接下来，隔离中肠，即作物和马尔皮基安小管之间的区域。为此，请去除动物的前部并去除后肠。

接下来，将中肠快速转移到装有 100 微升昆虫盐水缓冲液的微量离心管中。将六只蟑螂的中肠收集到同一个管中。然后，将试管涡旋 10 秒钟。

接下来，将混合物离心 10 分钟以分离出血细胞和肠道组织。然后，将上清液转移到干净的微量离心管中，并将浓度调整为每微升 6 毫克蛋白质。双链 RNA 脂质复合物必须在制备后一小时内使用。

在制备过程中，请务必将所有稀释的试剂与稀释的双链 RNA 同时混合。然后，快速涡旋并孵育混合物。准备好后，将 4 微升双链 RNA 溶液与 10 微升昆虫盐水缓冲液混合作为对照，或将其与 10 微升从血淋巴液或中肠液中提取的酶混合。

接下来，通过添加 2 μL EGTA 进行酶抑制对照。否则，加入 2 微升不含 RNase 的水。然后，将样品在 25 摄氏度下孵育一小时或更长时间。

孵育后，加入 200 μL 提取试剂和 40 μL 氯仿，然后涡旋。接下来，将样品离心 10 分钟。接下来，将 150 μL 每种上清液转移到新试管中，加入 150 μL 异丙醇，并在冰上孵育样品 15 分钟，从每个样品中沉淀双链 RNA。

孵育后，再次离心样品并弃去上清液。然后，向每个沉淀中加入 200 微升 70% 乙醇并离心试管，洗涤 RNA 沉淀两次。第二次洗涤后，使用离心真空浓缩仪干燥双链 RNA 沉淀 3 分钟。

然后，将沉淀重悬于 10 μL 不含 RNase 的水中。最后，使用 1.5% 琼脂糖凝胶检查处理过的双链 RNA 的完整性。每天喂蟑螂两次，开灯后 1 小时，关灯前 1 小时。

这样做 8 或 16 天，没有休息。在此期间，蟑螂应该缺水。对于喂养，有新鲜制备的双链 RNA 脂质复合物和裸双链 RNA 可用。

对于推注，与 4 μL 双链 RNA 脂质复合物或 250 ng 裸双链 RNA 一起使用。要喂蟑螂，首先，用灵活的镊子抓住它的翅膀。不要抓住蟑螂的身体部位。

然后，慢慢吸取靠近口器的液滴，观察蟑螂摄入液滴。最后一次喂食后，为蟑螂提供水瓶。在整个喂食期间，每天评估昆虫以检查死亡率并清除任何不再离开实验的蟑螂。

连续口服双链管状脂质复合物能够将中肠微管蛋白表达从第 9 天的 40% 降低到第 17 天的 60%。相比之下，裸露的双链 RNA 没有影响。这很可能是由于发现裸露的双链 RNA 暴露于中肠液导致在一小时内降解，而脂质体偶联的双链 RNA 保持稳定。

不仅 RNA 水平降低，而且微管蛋白双链 RNA 脂质复合物的连续喂养也导致了显着的致死性。这不太可能是由于载体造成的，因为将双链 RNA 携带到 EGFP 的脂质复合物不会致死。在尝试这种 RNA 干扰的口服递送系统时，重要的是要连续喂食双链 RNA，持续数天。

一旦掌握，如果执行得当，每只昆虫可以在两分钟内完成喂食步骤。如果需要，可以应用不同配方的脂质体纳米颗粒来改进喂养程序和 RNAi 效率。最终，这项技术使害虫管理领域的研究人员能够使用 RNAi 探索新的控制策略。