Name: 优化液体搬运机器人对拟南芥进行高通量前化学遗传学筛选的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 了解如何利用液体搬运机器人对Arabidopsis thaliana幼苗进行高通量前化学遗传学筛选，快速发现影响植物生理的新型小分子化合物，为细胞壁合成等生理过程研究奠定基础。

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感谢 Jozsef Stork、Mitchel Richmond、Jarrad Gollihue 和 Andrea Sanchez 提供的建设性与批判性讨论。感谢 Sharyn Perry 博士提供表型照片。本研究工作基于美国国家科学基金会资助的协作协议第 1355438 号支持。

1. 构建稀释文库
<ol>
	<li>手动标记625个稀释文库板，确保它们与化学文库中的对应板相匹配。此外，将进液和出液软管穿过控制台驱动器连接至5加仑储液罐上的多通道吸头清洗自动耗材定位器（ALP）（参见材料表）。</li>
	<li>访问计算机，并通过设备控制器连接多通道吸头清洗ALP，启动清洗泵以循环水。此步骤将在方案结束时自动关闭。</li>
	<li>手动将堆叠器10（Stacker 10）装载到堆叠器转盘（Stacker Carousel）上，按以下顺序放入A-D区的存放位（图4，堆叠器）：在1号位放置一盒AP96 P20吸头，在2-5号位各放置四个96孔V型底板，其中上方两个板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个&#160;板为空板（图5，堆叠器）。此外，在6号位放置一盒AP96 P20吸头，在7-9号位放置四个96孔V型底板，其中上方两个&#160;板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个板为空板（图5，堆叠器）。</li>
	<li>手动设置工作台：在P3位置放置一个300 mL水储液罐，在P7位置放置一个300 mL 70%乙醇浴，以及Tip Loader ALP（TL1）和多通道吸头清洗ALP（TW1）（图4，工作台 和 图5，工作台）。</li>
	<li>使用操作软件，从堆叠器10中取出AP96 P20吸头，并将其移至Tip Loader ALP。 
	注意：步骤1.5至1.12均通过液体处理机器人的操作软件完成；参见材料表。</li>
	<li>取出A区2号位的板，并将全部四个96孔V型底板分开放置于工作台上，将底部两个板分别置于P4和P8位置，顶部两个板分别置于P5和P9位置（图4）。</li>
	<li>使用Tip Loader ALP将AP96 P20吸头装载到96通道200 µL移液头。从300 mL水储液罐中吸取90 µL水，并分配至P4位置的96孔V型底稀释板中。对P8位置的板重复此步骤。</li>
	<li>通过反复吸取和分配15 µL溶液三次，混合P5位置的化学文库板&#160;。此外，从P5位置的化学文库板&#160;中吸取10 µL，并将10 µL分配至P4位置的稀释板中。</li>
	<li>通过反复吸取和分配50 µL溶液共三次，混合P4位置板&#160;中的溶液。混合完成后，使用P7中的70%乙醇吸取并分配70 µL以清洗AP96 P20吸头，然后在多通道吸头清洗ALP中通过吸取和分配110%体积的水四次进行冲洗。</li>
	<li>对P8和P9位置的第二对板重复步骤1.8–1.9。在制备第二个96孔V型底稀释板后，按从下至上的顺序堆叠板：P9、P5、P8和P4。然后将该堆叠放置在一个空的静态ALP上；可选P1、P2、P6、P10、P11、P12或P13中的任意一个位置。</li>
	<li>重复步骤1.6–1.10，直到A区5号位清空。当进行到6号位时，重复步骤1.5，将新的AP96 P20吸头移至Tip Loader ALP，并将使用过的AP96 P20吸头放置在一个空的静态ALP上。</li>
	<li>重复步骤1.6–1.10，直到A区9号位清空。然而，若要进入B区，必须先将工作台上的板和吸头重新装回A区。</li>
	<li>手动重新加满300 mL水储液罐。此步骤至关重要，计算机程序可设置暂停提示此信息，要求用户点击“继续”后方可执行下一步。</li>
	<li>对剩余各区重复步骤1.5–1.13，确保每次进入下一个区之前水储液罐均为满的300 mL。</li>
</ol>
2. 将培养基-种子混合物加入筛选板
<ol>
	<li>通过将 4.3 g MS 盐、0.50 g MES 和 1.0 g 琼脂加入 1 L 去离子 H2O 中，配制含 0.1% 琼脂的 ½ Murashige 和 Skoog (MS) 培养基。在 pH 探针监测下，加入 5 M 氢氧化钾调节 pH 至 5.7。</li>
	<li>将种子在含 1% 次氯酸钠和 SDS 的溶液中振荡 15 至 30 分钟进行灭菌，随后通过离心用等体积水清洗 4 次。种子灭菌后，置于 4 °C 条件下 24 小时至 7 天以完成春化处理。拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center）提供了其他灭菌、春化及培养方法22。</li>
	<li>以 0.1 g/100 mL 的密度手工将种子接种至培养基中。该密度可使每块 96 孔板的每个孔中平均分布 3 - 10 粒种子。</li>
	<li>手工将四块 96 孔平底板分别放入 A 酒店的 1 号和 2 号房间（图 6，A 酒店）。在 Tip Loader ALP 上放置一盒 AP96 P250 吸头，在 P3 位置放置一个装有步骤 2.1 - 2.3 制备的培养基-种子混合液的 300 mL 储液槽，在 P7 位置放置一个装有 70% 乙醇的 300 mL 储液槽（图 4，工作台面 和 图 6，工作台面）。 
	注意：步骤 2.5 至 2.8 需使用操作软件完成。</li>
	<li>在软件中调出 A 酒店的 1 号和 2 号房间，并分离四叠板堆。将每块板分别放置于空的静态 ALP（P4、P5、P6、P8、P9、P10、P11 和 P12）上。在 96 通道 200 µL 移液头装载 AP96 P250 吸头。</li>
	<li>从 P3 位置的 300 mL 培养基-种子储液槽中吸取 90 µL，加入第一块 96 孔平底板中。重复此操作，直至全部八块板均加入培养基-种子混合液。</li>
	<li>通过从 P7 位置装有 70% 乙醇的 300 mL 储液槽中吸取并排出 70 µL 溶液，对 AP96 P250 吸头进行清洗。随后在多通道吸头清洗 ALP 中，用 110% 体积的水吸取并排出四次以洗涤吸头，在 TL1 卸载吸头，并手工收集各培养板。</li>
</ol>
3. 向筛选板中添加小分子
<ol>
	<li>手动将一盒 AP96 P250 吸头放入 A 酒店 1 号房间，将两个 96 孔 V 型底稀释文库板分别放入 2、4、6 和 8 号房间，将两个 96 孔平底筛选板分别放入 3、5、7 和 9 号房间（图 4，堆叠器和 图 7，A 酒店）。此外，将多通道吸头清洗 ALP 的进出软管连接至 5 加仑储液罐。 
	注意：步骤 3.2 至 3.10 通过操作软件完成。</li>
	<li>配置工作台，在 P7 位置放置一个 300 mL 的 70% 乙醇清洗储液罐；培养基-种子储液罐可保留在 P3 位置的工作台上（图 4，工作台和 图 7，工作台）。此外，通过连接设备控制器启动控制台驱动，使水在多通道吸头清洗 ALP 中循环。该系统将在程序结束时自动关闭。</li>
	<li>从 A 酒店取出 AP96 P250 吸头盒，并将其移至吸头装载 ALP。</li>
	<li>将 A 酒店 2 号房间的 96 孔 V 型底稀释文库板送至工作台，分别放置于静态 ALP 的 P4 和 P8 位置。将 A 酒店 3 号房间的 96 孔平底筛选板送至工作台，分别放置于静态 ALP 的 P5 和 P9 位置。</li>
	<li>使用吸头装载 ALP 将 AP96 P250 吸头加载到 96 通道 200 µL 移液头。</li>
	<li>通过反复吸取和分配 50 µL 溶液三次，混合 P4 位置的 96 孔 V 型底稀释板中的溶液。随后，从此板中吸取 10 µL 溶液并分配至 P5 位置的 96 孔平底筛选板中。</li>
	<li>通过反复吸取和分配 50 µL 溶液三次，混合 P5 位置筛选板中的溶液。使用乙醇清洗 AP96 P250 吸头：从 P7 位置的储液罐中吸取并分配 70 µL 的 70% 乙醇，然后在多通道吸头清洗 ALP 中通过反复吸取和分配 110% 体积的水四次来清洗吸头。</li>
	<li>对第二个 96 孔 V 型底稀释文库板（P8）和 96 孔平底筛选板（P9）重复步骤 3.5 和 3.6。</li>
	<li>将两个 96 孔 V 型底稀释文库板叠放在一起，两个 96 孔平底筛选板也叠放在一起。将这些板移至静态 ALP 的 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13 位置。</li>
	<li>重复步骤 3.4 至 3.9 三次，共向筛选板中添加稀释后的化学品八次。最后，通过目视确认检查筛选板中每个孔内的种子数量，并对少于三粒种子的孔补充经过灭菌和春化的额外种子。</li>
</ol>
4. 筛选平板的孵育与显色
<ol>
	<li>将96孔平底筛选板置于22 °C的环境培养箱中，在防干燥容器内以16/8小时光照/黑暗循环培养四天。在解剖显微镜下观察96孔平底筛选板。记录所有异常表型以供进一步研究。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本实验方案旨在帮助研究人员在拟南芥中开展正向化学遗传学筛选。我们提供了一项针对50,000种化合物的筛选所获得的代表性结果（图2 和 图3），这是迄今为止在拟南芥中进行的规模最大的正向化学遗传学筛选之一9,13,23。通过使用液体处理机器人，可更高效地完成稀释文库和筛选文库的制备，从而提高新化合物鉴定的速度与效率。高通量筛选能力的提升，同时减少了研究人员所需投入的人力。本技术设计用于96孔板，适用于在体视显微镜下可观察的小种子或小型植株。若使用孔径更大的培养板以容纳较大种子，则需对通量和实验设计进行相应调整。
该技术的其他局限性包括难以将此设备与无菌操作技术结合使用；然而，由于½ MS培养基不含蔗糖，我们并未遇到较高的污染率。可以通过将机器人置于无菌室中，以实现无菌环境和细胞培养...

在过去20年中，植物生物学领域的研究人员在正向和反向化学遗传学方法的应用方面取得了巨大进展，加深了我们对细胞壁生物合成、细胞骨架、激素生物合成与信号传导、向重力性、致病过程、嘌呤生物合成以及内膜系统运输等过程的理解1,2,3,4,5。采用正向化学遗传学技术能够鉴定出感兴趣的表型，帮助研究人员理解特定生物学过程背后的基因型基础。相反，反向化学遗传学则旨在寻找能够与预先确定的蛋白质靶标相互作用的化合物6。拟南芥（*Arabidopsis*）在植物生物学的这些发现中处于领先地位，因其基因组较小，且已被测序和注释完整，具有较短的世代周期，同时存在多种突变体和报告基因品系，有助于识别异常的亚细胞机制7。
正向化学遗传筛选的进展主要受到两个关键瓶颈的限制：初始筛选过程以及确定感兴趣化合物的作用靶点8。加快小分子筛选速度的重要手段之一是使用自动化系统和自动化设备9。液体处理机器人是处理大量小分子文库的有力工具，在推动生命科学领域的发展中发挥了重要作用10。本文所介绍的方案旨在缓解与筛选过程相关的瓶颈问题，从而能够快速鉴定出具有生物活性的小分子。该技术减轻了操作人员的劳动强度和时间成本，同时也降低了课题负责人的经济投入。
迄今为止，已分析的大多数化合物库包含 10,000 至 20,000 种化合物，部分库多达 150,000 种，也有少至 70 种的9,11,12,13,14,15,16。本文所介绍的方案应用于一个包含 50,000 种小分子的化合物库（见材料表），是目前在拟南芥中开展的规模较大的正向化学生物学筛选之一。该方案符合当前正向化学生物学领域追求更高效率与速度的发展趋势，尤其适用于除草剂、杀虫剂、杀菌剂、药物发现以及癌症生物学研究17,18,19,20,21。尽管本方案以拟南芥为实验材料，但其可轻松拓展至细胞培养、孢子，甚至在 96、384 或 1536 孔板中的液体培养基内进行昆虫实验。由于拟南芥植株体型较小，适合在 96 孔板中进行筛选。然而，将种子均匀分配至各孔仍具挑战性。人工点种虽准确但耗时耗力，尽管已有专为向 96 孔板分配种子而设计的设备，但购置成本较高。本文展示了如何以极小的准确性损失规避此步骤。
该方法的总体目标是在不降低准确性的前提下，使针对拟南芥的大规模化合物库筛选更加易于操作。 通过 使用液体处理机器人。该方法通过缩短完成初始稀释系列管理和后续表型筛选所需的时间，提高研究人员的工作效率，实现解剖显微镜下对样品的快速观察，并快速鉴定新型生物活性小分子。 图1 以4个步骤展示本方案的关键结果。
<img alt="化学筛选工作流程图：文库稀释、板制备、孵育、可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：正向化学遗传学筛选的整体工作流程。 本文将概述即将描述的实验方案，并对其中4个关键步骤进行简要说明：1：接收化合物文库，2：制备稀释文库，3：制备筛选板，以及4：孵育并观察筛选板。 <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>键盘</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于设计实验方案及操作 Biomek FX</td></tr><tr><td>鼠标</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于设计实验方案及操作 Biomek FX</td></tr><tr><td>计算机显示器</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于设计实验方案及操作 Biomek FX</td></tr><tr><td>计算机</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于设计实验方案及操作 Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet 多样性筛选文库</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>化学文库</td></tr><tr><td>Biomek 软件</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>运行并设计 Biomek FX 操作流程</td></tr><tr><td>设备控制器</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>操作水泵/吸头清洗站</td></tr><tr><td>堆垛转盘吊坠</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>手动操作 Biomek 堆垛转盘</td></tr><tr><td>Biomek 堆垛转盘</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>容纳所有 FX 堆垛器 10 的旋转单元</td></tr><tr><td>FX 堆垛器 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>容纳筛选实验组件的升降单元</td></tr><tr><td>FX 堆垛器 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>容纳筛选实验组件的升降单元</td></tr><tr><td>FX 堆垛器 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>容纳筛选实验组件的升降单元</td></tr><tr><td>FX 堆垛器 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>容纳筛选实验组件的升降单元</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>执行所需操作的自动化机器人</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>固定机械臂以准确定位组件</td></tr><tr><td>定位夹具</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>在 Accuframe 中对准机械臂中心</td></tr><tr><td>多通道吸头清洗 ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>在乙醇浴后清洗吸头</td></tr><tr><td>吸头装载 ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>通过气动方式将吸头装载到机械臂上</td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>为气动吸头装载提供压缩空气</td></tr><tr><td>MasterFlex 控制台驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>用于循环水通过多通道吸头清洗器的泵</td></tr><tr><td>气管</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>将空气从空气压缩机输送至吸头装载器</td></tr><tr><td>水管</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>将水从 5 加仑储水桶输送至吸头清洗器</td></tr><tr><td>静态 ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>随 Biomek FX 提供</td><td>支撑筛选实验所需设备</td></tr><tr><td>5 加仑储水桶</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>循环清洗吸头后的脏水</td></tr><tr><td>夹持器</td><td>Beckman Coulter</td><td>随 Biomek FX 提供</td><td>抓取并移动设备至正确位置</td></tr><tr><td>96 通道 200 &amp;micro;L 头</td><td>Beckman Coulter</td><td>随 Biomek FX 提供</td><td>容纳筛选实验中使用的 96 个吸头</td></tr><tr><td>AP96 P200 移液吸头</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>用于构建筛选文库</td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>辅助筛选实验的可视化观察</td></tr><tr><td>96 孔 V 形底板</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>辅助稀释文库的储存</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 密封膜</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>用于化学文库和稀释文库储存时的密封</td></tr><tr><td>塑料自封袋（三明治袋）</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于确保筛选实验的高湿度环境</td></tr><tr><td>AP96 P20 移液吸头</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>用于构建稀释文库</td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>用于种子萌发以进行表型观察</td></tr><tr><td>刮铲</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>用于承载种子，补充液体点种未能成功落种的孔位</td></tr><tr><td>牙签</td><td>本地供应商</td><td>N/A</td><td>将种子从刮铲推入孔板中</td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 基础盐混合物</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>添加至 MS 培养基混合物中</td></tr><tr><td>MES 自由酸一水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>添加至 MS 培养基中以降低 pH 值</td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>增加培养基黏度以支撑种子悬浮</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>将 pH 值提升至适宜水平</td></tr><tr><td>1L 培养基储存瓶</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>容纳一次筛选实验所需的培养基量</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>在春化处理前对种子进行灭菌</td></tr><tr><td>pH 探针</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>用于配制培养基</td></tr><tr><td>ALP（自动化实验耗材定位器）用户手册</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>辅助设置 Biomek FX 的配套设备</td></tr><tr><td>Biomek 2000 堆垛转盘用户指南</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>辅助设置堆垛转盘</td></tr><tr><td>Biomek FX 和 FX&lt;sup&gt;P&lt;/sup&gt; 实验室自动化工作站用户手册</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>用于固定多通道模块</td></tr><tr><td>Biomek FXP 实验室自动化工作站客户启动指南</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>辅助设置 Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 软件用户手册</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>用于设置并理解软件操作</td></tr></tbody></table>

优化利用液体处理机器人对拟南芥（arabidopsis thaliana）进行高通量正向化学生物学筛选

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

化学遗传学正越来越多地被用于解析植物中可能因基因冗余或致死性而难以通过传统遗传学方法研究的性状。然而，合成小分子具有生物活性的概率较低，因此必须测试成千上万种分子才能筛选出感兴趣的化合物。液体处理机器人系统能够处理大量样品，不仅加快了化合物文库的筛选速度，还最大限度地减少或标准化了操作误差。为了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现对包含50,000种小分子的文库进行高通量正向化学遗传学筛选，研究人员开发了基于台式多通道液体处理机器人的实验方案，该方案几乎无需技术人员过多干预。利用这些方案，共发现3,271种引起明显表型变化的小分子：其中1,563种化合物诱导根长变短，1,148种化合物导致颜色改变，383种化合物引起根毛及其他未归类的形态变化，另有177种化合物抑制种子萌发。

基于在解剖显微镜下以筛选浓度添加小分子，从而准确、高效地鉴定表型，是本拟南芥正向化学遗传学方法的最终目标。 在完成全部50,000种化合物的筛选后，所观察到的表型具有多样性，可划分为若干明显不同的类别（图2）。图3A-F展示了在解剖显微镜下低倍率观察到的部分表型实例。某些表型结果不明确（图3G、H），需在更低浓度下重新测试，以确认该化合物在较低剂量下是否产生不同的表型。
结果不佳可能由多种原因导致。其中之一是种子萌发率低，这可能导致筛选平板中主要出现不萌发或萌发不完全的表型（图3G，H），从而造成误...

在模式植物物种Arabidopsis thaliana上进行了一项针对合成小分子的高通量筛选。该实验方案专为液体处理机器人开发，可提高正向化学遗传学筛选的速度，加快发现影响植物生理学的新型小分子。

优化利用液体处理机器人对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行高通量正向化学生物学筛选

化学遗传学正越来越多地被用于解析植物中可能因基因冗余或其他原因而难以通过传统遗传学方法研究的性状。

本实验方案的总体目标是对拟南芥幼苗进行高通量的正向化学遗传学筛选。通过该方法，我们能够高效且有效地发现影响植物生理功能的新型小分子。这些发现将为进一步研究生理过程（如细胞壁合成）奠定基础。该技术的主要优势在于，可在短时间内筛选数以万计的小分子。尽管本实验方案是为模式植物拟南芥（Arabidopsis）设计的，但也可轻松适用于其他生物体，例如昆虫、微生物或细胞培养。我们最初产生该实验方案的想法，源于得知学校基因组中心需要为一台多余的液体处理机器人寻找使用场所。我们立即主动提出接手这项工作。按照文本方案中的描述，准备稀释文库以及多通道移液头清洗自动实验室器皿定位器（Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner，ALP）。手动装载连接至堆叠器转盘的10位堆叠器（Stacker 10s）。在酒店 A 至 D 中，首先在一号房间加载一盒 AP96 P20 吸头。然后在二至五号房间各加载四块 96 孔 V 型底板，其中两块上层板中包含订购文库的储备浓度溶液，另外两块下层板为空。此外，在六号房间加载一盒 AP96 P20 吸头。在七至九号房间中放置四个96孔V型底板，其中上方两个板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个板为空板。在P3位置的储液槽中加入300毫升水，在P7位置放置300毫升70%乙醇浴，同时在甲板上设置Tip Loader ALP和Multichannel Tip Wash ALP。使用液体处理机器人的操作软件，从Stacker 10中取出AP96 P20吸头并将其移至Tip Loader ALP。将A酒店的二号房间中的四个96孔V型底板分别放置在甲板上，底部两个置于P4和P8位置，顶部两个置于P5和P9位置。使用Tip Loader ALP将AP96 P20吸头加载至96通道200微升吸头头上。从300毫升的水储液槽中吸取90微升液体，分配至P4位置的96孔V型底稀释板中。对P8位置的板重复此步骤。通过反复吸取和分配15微升液体三次，混匀P5位置的化合物文库板。此外，从P5位置的化合物文库板中吸取10微升液体，分配10微升至P4位置的稀释板中。通过反复吸取和分配50微升液体共三次，混匀P4位置板中的溶液。混合后，用AP96 P20移液器吸头从P7中吸取并排空70微升70%乙醇，以清洁吸头，然后在多通道吸头清洗板ALP中通过吸取并排空110%体积的水四次进行清洗。对P8和P9上的第二对板重复这些步骤。在制备第二个96孔V型底稀释板后，将P9、P5、P8和P4板按从下到上的顺序堆叠。然后将该堆叠放置在一个空的静态ALP上。使用 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13 中的任意一个。重复这些步骤，直到 A 酒店五号房间清空，然后在到达六号房间时重新开始该过程，将新的 AP96 P20 吸头移至 Tip Loader ALP，并将使用过的 AP96 P20 吸头放置在空的静态 ALP 上。重复此操作，直到 A 酒店九号房间清空为止。为了继续前往B酒店，必须将甲板上的板和吸头重新装入A酒店。尽管机器人可以无人监管运行，但每次稀释循环后仍需手动补充水箱。如果循环重新开始时水量不足，机器人将吸入空气，导致化学品无法被稀释。请手动补充300毫升的水箱。 计算机程序可插入一个显示此消息的暂停步骤，要求用户点击“继续”后才能执行下一步操作。对剩余的三个培养物重复上述稀释步骤。以每100毫升培养基加入0.1克种子的密度，手动将种子添加到培养基中。此密度可使每块96孔板的每个孔中平均含有3-10粒种子。将四块96孔平底板手动放置于A酒店的一号和二号房间内。在Tip Loader ALP上放置一盒AP96 P250吸头，在P3位置放置一个装有培养基-种子混合液的300毫升储液槽，在P7位置放置一个装有70%乙醇的300毫升储液槽。通过操作软件，将A酒店的一号和二号房间中的四块板堆栈分开，并将每块板分别放置于空的静态ALP上，然后在96通道200微升移液头装载AP96 P250吸头。从P3上的300毫升培养基-种子储液槽中吸取90微升，加入第一个96孔平底板中。重复此操作，直至全部八个板均含有培养基-种子混合物。使用P7上装有70%乙醇的300毫升储液槽，通过吸取和排出70微升液体来清洗AP96 P250移液器吸头。然后在Multichannel Tip Wash ALP中用纯水清洗吸头，每次吸取和排出110%体积的水，重复四次，最后在TL1处卸下吸头。最后，手动收集这些板。将一盒AP96 P250吸头手动放入A酒店的第一间房间。同时，将两个96孔V型底稀释文库板放入第二、第四、第六和第八间房间。将两个96孔平底筛选板放入第三、第五、第七和第九间房间。使用操作软件，将操作台配置为在 P7 位置放置一个含有 300 毫升 70% 乙醇的清洗储液槽。培养基-种子储液槽可保留在 P3 位置。此外，通过连接设备控制器启动控制台驱动，使水在多通道吸头清洗 ALP 中循环。此步骤将在程序结束时自动关闭。从 Hotel A 取出 AP96 P250 吸头盒，并将其移至吸头装载 ALP。接下来，将来自A酒店二号房间的96孔V型底稀释文库板呈递至操作台。将一块板放置在静态ALP P4位置，另一块板放置在P8位置。然后，将来自A酒店三号房间的96孔平底筛选板呈递至操作台。将一块板放置在静态ALP P5位置，另一块板放置在P9位置。使用Tip Loader ALP将AP96 P250吸头装载到96通道200微升移液头。在P4位置，通过吸取并分配50微升液体三次，混匀96孔V型底稀释板。随后，从此板中吸取10微升液体，加入至P5位置的96孔平底筛选板中。在P5位置，通过吸取并分配50微升液体三次，混匀该板中的溶液。使用乙醇清洗AP96 P250移液头：从P7位置的储液槽中吸取并分配70%乙醇70微升，进行清洗。然后，在Multichannel Tip Wash ALP中用纯水清洗移液头，吸取并分配110%体积的水四次。对第二个96孔V型底稀释文库板和96孔平底筛选板重复上述步骤。将两个96孔V型底稀释文库板叠放在一起，两个96孔平底筛选板也叠放在一起。将这些板转移至静态ALPs。然后，重复该过程三次，总共向筛选板中添加八次稀释后的化学物质。最后，通过肉眼观察确认筛选板中每个孔内的种子数量。对于种子数量少于三粒的孔，补充已灭菌并经过春化处理的种子。必须确保幼苗生长的培养基不会干燥，否则将导致发芽率降低。含有幼苗的培养板应保持在高湿度环境中，或储存在防干燥容器中。将96孔平底筛选板置于密闭防干燥容器内，在环境培养箱中于22°C、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养4天。在解剖显微镜下观察96孔平底筛选板，并记录所有异常表型以供进一步研究。正常与异常表型的示例包括：无可见形态学异常、根毛呈棕色、根发育迟缓、根严重矮缩、白化、黏液呈绿色、萌发不完全以及未萌发。以百分比形式显示的可见表型用饼状图表示。幼苗在根系形态、色素沉着、根毛和萌发方面表现出异常。此外还包括其他多种表型，例如产生绿色黏液。一旦掌握该技术，可显著提高大规模正向化学遗传筛选的效率和准确性。在进行该实验操作时，务必注意对种子进行灭菌和春化处理，在稀释步骤中及时补充水槽中的液体，确保样品保存在防潮容器中，并且所有成像均在平底培养板中进行。根据您所关注研究的生理过程，可在此初步筛选的基础上进一步开展其他检测实验，以帮助确定每种化合物的作用机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用液体处理机器人提高化学遗传筛选的效率和准确性。

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