通过实验设计和自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样

生物传感器的开发和优化是我们研究的范围。具体来说，我们的目标是了解如何通过调节生物传感器的遗传元素来优化和设计生物传感器。直觉驱动的设计选择，例如经典启动子工程和荧光激活细胞分选，是生物传感器表征和设计中常规应用的技术。

实验设计方法尚未在遗传电路设计中得到广泛采用。通过该协议，我们寻求增加这些类型技术在遗传回路和生物传感器设计中的采用。首先，确定理论文库大小并计算确保文库覆盖率大于 95% 所需的单个变体数量。

根据要筛选的菌落数量计算补充抗生素的溶原性肉汤培养基的所需体积。打开液体处理器软件，然后单击 MTP 液体传输程序旁边的运行。将准备好的培养基放在相应的储液器位置。

然后根据布局用空的微量滴定板填充甲板。将程序设置为分配 200 微升培养基。点击 确定 确认程序启动。

现在，将填充的微量滴定板孔转移到菌落选择器平台上，并将用质粒变异文库DNA转化的恶毒假单胞菌的方形螺旋板打开并转移到菌落选择器平台中。使用菌落选择器用转化板中的单个菌落接种每个预填充孔。重新密封接种板并将它们转移到离线摇动培养箱中。

孵育后，将生长的板放回液体处理器平台并解封。单击将甘油添加到 MTP 方案旁边的运行。确保屏幕上的板布局与液体处理器底座的布局相匹配。

然后依次单击确定以运行协议。完成后，密封板并在离线摇动培养箱中以每分钟 800 转的速度短暂混合 5 分钟。在盘子上贴上条形码，并在 80 摄氏度下储存，直到需要为止。

计算深孔模块所需的抗生素补充培养基体积。单击 DWB 液体传输程序旁边的运行。确保将介质添加到正确的储液器中。

空的深井块处于正确的布局位置，并且有足够的尖端供应。将程序设置为分配 495 微升培养基。准备就绪后，依次单击 确定 启动程序。

现在，用透气膜密封填充的深井块，并在 4 摄氏度下转移到临时储存。接下来，单击从解冻的 MTP 程序中接种旁边的运行。确保 MTP 冷冻库存和填充深井块按布局转移到平台上，并装载足够的吸头。

依次单击确定进行初始化。程序结束后，用透气膜密封接种的过夜深孔块。将它们转移到离线摇板器培养箱中，在 30 摄氏度、每分钟 800 转和 75% 湿度下放置 16 小时。

重新密封、混合并将冷冻液微量滴定板放回 80 摄氏度的冰箱中。现在，计算要筛选的过夜深孔块所需的补充有各种效应器和抗生素浓度的培养基体积。单击 DWB 液体传输程序旁边的运行。

然后确保正确放置了补充效应器的培养基储液器。将空的深孔块添加到液体处理器平台中。当有足够的提示可用时，依次单击确定以启动协议以生成测定深孔块。

填充后，用透气膜密封测定深孔块。用空板重新填充液体处理器。重复接种，直到所有测定块都被填满。

接下来，单击转移到检测 DWB 程序旁边的运行。正确放置带有效应子补充培养基的未密封测定深孔块后，根据布局转移和打开含有生长的恶臭假单胞菌的过夜深孔块。依次点击确定启动协议。

程序完成后，将检测板密封到离线培养箱。接种后丢弃过夜的深井块。接下来，将深井块转移到离心机中。

将细胞以 4， 000 G 沉淀在 18 摄氏度的冰控转子中 5 分钟。丢弃上清液后，将离心机块放在液体处理器平台上。根据要筛选的深孔块数量计算所需PBS的体积的一倍。

单击检测设置PBS重悬DWB程序旁边的运行，并将分配体积设置为500微升。然后确保将PBS添加到正确的储液器中，并根据布局排列离心板。单击确定在确认提示可用性后启动程序。

重新密封并从液体处理器中取出重悬的深孔块。检查板的底面，确保颗粒完全重悬。单击检测设置细胞和 PBS 版 MTP 程序旁边的运行。

然后根据布局将重悬的深孔块转移到液体处理器中。根据布局加载空的微量滴定板，并将分配体积设置为 200 微升，然后单击确定。将填充的微量滴定板转移到离线多模式酶标仪上，并测量相对荧光和OD600。

对 5， 000 个启动子变体的自动筛选确定了激活率超过 3.6 倍的顶级候选者。绘制了 100 个独特变异的 EC 50 值，以可视化敏感性分布并确定稳健的候选者。计算 226 个富集变体的 EC 50 值，并使用 Lin-log 变换进行排名以形成灵敏度缩放的文库。

使用来自四个模块的 1、0 和 1 水平方差构建了最终筛选设计。转运、调节剂、P-out 和输出核糖体结合位点模型曲线揭示了四个模块的表达水平变化如何非线性影响 EC 50 和 Hill 系数。与RBS-Out确定最佳表达组合，对灵敏度和斜率均有很强的积极影响。

与亲本和 DSD 优化版本相比，结合理想模块强度的全球优化生物传感器变体表现出更高的灵敏度和希尔系数。