高通量定量表达筛选与纯化应用到重组二硫键丰富的蛇毒蛋白产于 E。大肠杆菌

一种协议，用于定量，高通量表达筛选，从小规模的大肠杆菌文化融合蛋白的纯化分析说明，并应用到的二硫键丰富的动物毒液蛋白靶点的表达。

以下程序的总体目标是使用高通量表达筛选方案，使用自动液体处理机器人定量大肠杆菌中可溶性蛋白的水平。这是通过首先接种来完成的.96。第二天用编码靶融合蛋白的质粒转化的细胞进行孔预培养，用填充有自动诱导培养基的 24 孔板接种过夜预培养物以产生表达。

收获后的培养物和来自表达培养物的冷冻可溶性蛋白然后通过固定化金属亲和层析进行纯化。最终，可以测量每个完整靶标融合的溶解度水平，以确定蛋白质生产的最佳表达条件和成功靶标的生成。从这种提高效率的传统方法技术的优势来看，有限的批次间辐射以及数据处理和跟踪的简单性这种方法的视觉演示至关重要。

自动化步骤似乎令人生畏且难以仅以文本格式理解，因为文本并不能传达程序的快速或简单性。细菌转化后，首先使用机器人夹具将第一个 24 孔 LB 琼脂板的盖子放在一边。接下来，使用八通道液体处理臂混合，然后从 96 孔转化板中吸出 50 μL 转化混合物。

将液体处理臂前四个通道内的转化混合物分配到 LB 琼脂板的第一列，将最后四个通道内的转化分配到 LB 琼脂板的第二列中分配分配后彻底清洗所有吸头，然后继续将转化混合物从 96 孔板转移到 LB 琼脂板接下来四列中的所有孔中，直到那个盘子已经完成了。完成到第一个板的转移后，盖上盖子并开始转移到下一个板。所有转化板铺板后，以 1200 RPM 摇动所有板 1 分钟，以产生均匀分布的转化混合物。

然后，混合后，使用 96 多通道臂从 96 孔板中吸出 60 μL 剩余的转化混合物，并将混合物分配到含有 LB 肉汤的深孔 96 板中。用透气的胶膜密封深孔 96 预培养物，以允许培养物通风，然后将板以最大速度放入 37 摄氏度的振荡培养箱中过夜。将预培养物放入培养箱中后，将 LB 琼脂板放入罩中，盖上盖子约 10 分钟。

然后将板在 37 摄氏度的板培养箱中倒置过夜。第二天，使用液体处理臂将 100 微升过夜预培养物吸出到深孔 96 板中，以 1/40 稀释度接种表达培养物，使用与以前相同的方案，在预培养物每列之间的清洗站彻底清洗液体处理臂。接种完成后，将表达培养物放入 37 摄氏度的振荡培养箱中，用透气粘合剂密封 4 小时。

然后将温度降至 17 摄氏度进行过夜孵育。第二天早上，将深孔 24 板以 3000 Gs 离心 10 分钟，将上清液倒入含有抗菌剂的废液容器中，然后将板倒置在吸水纸上以去除任何残留培养基，以验证培养物是否已正确生长。检查深井中是否存在沉淀。

接下来吸出 125 微升裂解缓冲液，并将缓冲液分配到深孔 24 板的每个孔中两次，每个孔中有四个吸头。要达到 1 mL 裂解缓冲液的最终体积以重悬沉淀，请以 1200 RPM 摇动板 5 分钟。在机器人上，将细胞悬液转移回深孔 96 板的适当孔中，并将板密封在零下 80 摄氏度下存放至少一小时。

在本演示中，我们将使用带有 50 μL 镍珠的方案来纯化目标融合蛋白。首先，将深孔板 96 板置于水浴中解冻约 15 分钟。然后以最大速度将细胞裂解物在振荡培养箱中再悬浮 10 分钟，培养物应变得粘稠。

接下来，使用手动八通道移液器将 DNA 和硫酸镁混合物分配到深孔 96 板的每个孔中，最终浓度分别为 10 微克/毫升和 20 毫摩尔。将密封的板再摇晃 15 分钟，此时培养物应变为非粘稠。为避免在纯化过程中堵塞滤板，仔细目视检查是否没有任何裂解物不再粘稠，这一点至关重要。

在液体处理机器人上，使用 200 μL 宽口径尖端彻底混合树脂浆料，然后将 200 μL 浆料转移到含有裂解物的深孔 96 板中。以 1400 RPM 和室温摇动深孔 96 板 10 分钟以使其结合，然后使用宽口径尖端混合，然后将 200 微升等分试样的 1200 微升树脂裂解液浆液转移到滤板上。现在打开真空约 30 秒，通过板过滤裂解物，将流出的液流收集到深孔中。

从滤板下方取出含有流出物的深孔 96 96 并储存在架子上直至实验结束。然后每次洗涤后用 800 μL 结合缓冲液洗涤树脂两次，使用机器人夹具在滤板下放置新鲜、深的 96 孔板，以收集 50 毫摩尔 I midaz 洗涤液。在过滤板上加入 150 微升洗涤缓冲液，然后再次施加真空，直到缓冲液通过含有 96 的深孔。

从滤板下方取出清洗液并储存在架子上，直到实验结束。然后，如结合缓冲液所示，用 800 μL 洗涤缓冲液再洗涤两次后，使用机器人夹具将微孔板转移到工作台上，并将 SPE 模块和滤板放回微孔板顶部以收集 elucian 样品。然后将 190 μL 的 Elucian 缓冲液添加到滤板中的树脂中。

三分钟后，真空一分钟，让所有缓冲液通过。快速、直观地检查 Ellucian 卷是否正确。最后，封闭 Ellucian 洗涤液和流经板的样品，以定量可溶性表达水平。

首先分析 ellucian 板，仅在必要时检查相关的洗涤和流过馏分。这些数据说明了 Caliper Lab 芯片系统的电泳结果。完整的裂解融合蛋白由上条带表示，裂解的蛋白质片段表示下条带。

确定每种靶蛋白的融合产率在 0.1 至 2、2 至 10 和 10 至 25 μg/L 培养水平范围内，或者在某些情况下未检测到。通过每个融合蛋白片段中存在的 diss 硫键数量来评估蛋白质表达的成功，表明测试的所有二硫键数量都取得了合理的成功，对于含有 6 个二硫键的靶标，最低成功率为 66%。基于等电点和残基数量的表达成功分布分析表明，该技术没有特别的偏差，成功表达的靶标和未检测到的靶标都散布在整个图中。

一旦检测到并裂解融合，纯化的靶标就会通过电喷雾电离、质谱进行质量控制。此处显示的代表性靶标是具有四个二硫键的 5.7 道尔顿富含二硫化物的毒液蛋白。该图谱显示了用 DTT 还原前蛋白质的结果，以及在没有进一步干预的情况下切割和脱盐后的结果。

该光谱显示了用 DTT 还原后进行脱盐以去除任何过量 DTT 后的蛋白质。箭头表示与实验质量数相对应的离子，每个离子的名称以绿色表示。为这些离子计算的实验母体质量数如表所示，对应于 8 道尔顿的质量差，相当于 4 个氧化的硫化物键。

设置完成后，可以在一周内对 1000 多种培养物执行完整的方案。观看本视频后，您应该对如何使用小规模大肠杆菌培养物来确定使用高通量方法生产可溶性蛋白所需的成功条件有很好的了解。