Name: 高通量定量表达筛选与纯化应用到重组二硫键丰富的蛇毒蛋白产于 E。大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学习高通量表达筛选与纯化方法，利用自动化液体处理机器人在大肠杆菌中定量可溶性蛋白，优化富含二硫键的蛇毒融合蛋白表达条件，提高蛋白生产效率。

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本研究由VENOMICS项目资助，该项目通过第七框架计划（FP7 HEALTH 2011-2015）获得欧洲项目资助编号N° 278346。VENOMICS项目是欧洲多家科研机构与企业之间的合作项目：
法国艾克斯-马赛大学（AFMB）、法国萨克雷原子能委员会（CEA Saclay）、葡萄牙NZY科技公司（NZYTech）、西班牙基因组系统公司（SistemasGenomicos）、比利时列日大学（University de Liege）、法国VenomeTech公司、法国Vitamib公司、丹麦Zealand制药公司（Zealand Pharma）
本工作由法国整合结构生物学基础设施（FRISBI）ANR-10-INSB-05-01 项目资助。
作者还感谢 Jeremy Turchetto 先生在视频拍摄准备工作中的协助。

<ol><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li>
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<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li>
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<li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li>
<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
<li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37(2013).</li>
<li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusions+to+maltose-binding+protein%3A+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li>
<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
<li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865(2013).</li>
<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
<li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+%28Collection+Rencontres+en+Toxicologie%2C+Publications+de+la+SFET%2C+Chatenay-Malabry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+and+new+technologies+in+toxinology%22%5BJournal%5D)">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li>
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<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 Forthcoming.</li>
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<li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+approach+to+protein+crystallization%3A+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li>
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<li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P1%27+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li>
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<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RF+cloning%3A+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

目前尚无一种通用的单一方案可用于表达可溶性、正确折叠且具有功能的蛋白质。为了节约成本和时间，大多数实验室或蛋白质核心设施在处理多个靶标时，通常采用高通量蛋白质表达筛选方法，以寻找最佳的“通用”变量组合，从而为大多数靶标获得可溶且有活性的蛋白质。我们已确定DsbC是一种普遍适用的融合伴侣，可用于富含二硫键的多肽和蛋白质的可溶性表达11。通过使用DsbC融合蛋白及高通量方法，可在一周内观察到多个靶标的可溶性表达情况11，随后可在后续轮次中针对需要进一步优化的靶标，筛选其他变量，例如引言中讨论的那些因素。本文所述方案旨在表达富含二硫键的蛋白质和多肽。然而，对于希望以高通量方式表达非交联蛋白质的用户，相应的实验方案此前已有发表，可参见其他文献22,24。
高通量实验体系适用于多种应用场景，包括对大量不同蛋白质进行可溶性表达的筛选，或同时对多个目标基因（或单个目标基因的多个表达载体）的大量表达构建体（包含多种融合标签）进行筛选，以提高实验成功率。该平台还可用于在大量目标分子上对新建立的实验方案进行性能评估与验证。其他应用还包括针对单一难表达目标蛋白的突变体筛选。 例如，所有直系同源物或同一家族的成员，或在一次实验中检测单个靶标的一组突变体的表达效果。该方案还可与共表达载体（仅带有一个标签蛋白）联用，以实现蛋白质复合物的下拉及初步表征，随后通过更深入的生物物理分析验证复合物的正确形成及其化学计量比33纯化的蛋白量有时适用于微量检测（功能检测、蛋白质-DNA结合实验）34 或蛋白质-蛋白质相互作用实验）。高通量表达筛选策略具有多项优势：（i）可在单次实验中测试大量靶标或大量变量；（ii）批次间变异较小；（iii）使用深孔板进行小规模操作简便易行；（iv）易于放大并具有良好的可重复性；（v）具备自动化潜力；（vi）样品追踪与处理简便（无需对单个管子进行标记，使用板式格式相比单独操作试管在克隆混合或更换过程中可减少错误）。
尽管实验方案部分未予讨论，但实验准备过程中有几个重要事项需简要说明。有关更详细的讨论，请参见我们之前的发表文献24为了获得最高效率，建立一个适用于高通量克隆的系统将非常有益，可简化大量目标基因的亚克隆过程。在VENOMICS项目的初始阶段，我们采用了通用的Gateway重组系统。25 可实现每周数百个克隆的任意目的载体亚克隆。Gateway 重组克隆的相关实验方案可在 Invitrogen 网站获取。其他高通量克隆方法包括连接酶无关克隆（LIC）35,36 无限制性克隆（RF克隆）37有多种方法可获得用于表达的目的基因，包括通过PCR从模板DNA中扩增、从入门克隆文库中获取，或直接合成基因，后者是VENOMICS项目所采用的策略。合成基因可在基因两端带有重组位点进行订购，且基因合成可方便地对目的基因序列进行密码子优化（以排除稀有密码子） E. coli 密码子）。这一步是推荐的，但并非必需。对于未进行密码子优化且含有大量稀有密码子的靶基因，建议使用Rosetta 2 (DE3) pLysS菌株（该菌株携带在大肠杆菌中通常表达水平较低的稀有密码子对应的tRNA） E. coli）可能比 BL21 (DE3) pLysS 更为适用。尽管已有可限制细胞质正常还原环境中二硫键还原的菌株，但在我们的实验中，这些菌株的效果不如常规菌株理想 E. coli 菌株11.
为了回收可溶性融合蛋白并定量其产量，需从测试表达培养物中进行分析级亲和纯化。可获得关于在每升培养液中表达量为 0.1 – 100 mg 范围内的融合蛋白可溶性产量的定量数据。如果目标蛋白不具可溶性，可在尝试不同融合伴侣之前，先测试替代的表达条件和诱导温度、菌株或培养基。对于富含二硫键蛋白的可溶性表达，我们此前对融合伴侣的效果排序如下：DsbC &#62; DsbA &#62; GST &#62; MBP &#62; TRX &#62; HIS-tag，适用于胞质表达11。周质表达是另一种可能有助于富含二硫键目标蛋白成功折叠的策略。周质环境的还原性弱于胞质，并含有有助于二硫键形成的有用氧化还原伴侣分子。DsbC、DsbA 和 MBP 蛋白通常通过其周质信号序列被定位至周质空间。这为利用这些标签将富含二硫键的目标蛋白靶向输送至周质空间以促进其正确折叠提供了机会。对于难以处理的目标蛋白，下一步可能是从包涵体中纯化不溶性的 HIS 标签目标蛋白，随后进行溶解和复性（此过程超出本方案的范围，此处不予讨论39）。对于仅含一个或两个二硫键的目标蛋白，该过程可能相对简单，但随着二硫键数量的增加，复性难度也逐渐升高。此外，特别是对于含有四个或更多二硫键的蛋白质和多肽，尝试更复杂的表达系统（如酵母、昆虫或哺乳动物表达系统）可能是有益的。
随着微型化和自动化技术的进步，高通量电生理芯片实验室技术28无疑将成为未来功能分析的发展方向。我们预计，对于大多数应用而言（可能结构研究除外），这将消除对大规模培养的需求。小规模培养不仅可用于筛选表达条件，还能为这些微型化的功能检测提供足够量的样品。并行生产多个目标蛋白并获得足量样品以进行功能表征的能力，将降低培养和使用此类平台的成本，使重组蛋白的表达与表征更加经济高效且节省时间。
本文所述方案已应用于FP7欧洲VENOMICS项目的初始阶段，用于表达富含二硫键的多肽和蛋白质。动物毒液是生物活性多肽的优良来源，这些多肽通常具有重要的药理学潜力。然而，由于其复杂的二硫键连接模式和分子量较小，这类多肽的生产面临挑战。通过使用本文所述的高通量平台，VENOMICS项目旨在构建一个包含10,000种新型毒液多肽的文库，以重现自然界中观察到的多样性。该文库将用于鉴定具有潜在药理学或治疗应用价值的富含二硫键的多肽，目标是开发新药。目前，该平台正被用于对VENOMICS项目中新方案的性能进行基准测试和验证。

随着基因组学的发展以及新蛋白质发现速度的加快，人们已开发出高通量技术流程，以并行化传统方法，用于筛选和鉴定最优的蛋白质生产策略。需要优化的潜在变量包括但不限于：不同表达菌株1,2、温度3,4、培养基2,3、靶蛋白变体5、融合伴侣6-13、与分子伴侣共表达14,15、胞质或周质表达16-18，以及纯化缓冲液组分3。通过实施高通量方法，可高效地并行测试多个变量或多个靶标，同时减少批间差异。根据我们的经验，采用相同的培养条件（温度、培养基、通气等）和纯化条件（相同树脂、缓冲液等）进行放大时，该策略也表现出良好的可重复性。在过去十年中，已有多种高通量平台被用于确定可溶性蛋白表达的条件，主要是通过改变融合伴侣、表达菌株或温度等参数来实现19-23。
我们最近采用了高通量筛选方法用于表达可溶性富含二硫键的蛋白质11。所选蛋白质不仅来源于毒液，还包括来自多种物种（如植物、猪、牛和人类）的富含二硫键的酶抑制剂。该实验比较了12种不同的融合伴侣和3种不同表达菌株对28种二硫键交联蛋白质的可溶性和折叠特性的影响。我们证明，在BL21 (DE3) pLysS菌株中使用DsbC作为融合伴侣进行表达，在产量以及获得可溶性蛋白的数量方面，显著优于其他所有测试的菌株与融合伴侣组合11。该实验结果为我们原有通用高通量流程（此前已用于多种蛋白质的表达筛选）22,24 的优化提供了依据，使其更适用于富含二硫键靶蛋白的表达。来自动物毒液的富含二硫键蛋白质尤其具有研究价值。毒液是多种生物活性肽和蛋白质的复杂混合物，在药理学和治疗学上具有潜在应用价值。然而，含二硫键蛋白质的表达并非易事。这类蛋白质通常含有1至7个二硫键，必须以正确的二硫键连接模式进行氧化才能具备活性。目前，该平台正被用于欧洲第七框架计划VENOMICS项目（www.venomics.eu）中大量动物毒液富含二硫键蛋白的表达筛选，并用于建立新方法以实现数千个靶标的高通量表达标准化评估。本文提供了一种自动化方法，用于对富含二硫键的动物毒液蛋白进行高通量小规模表达筛选与纯化（见图1）。该策略针对富含二硫键的肽和蛋白质，利用HIS标签进行纯化，并采用具有氧化还原活性的融合伴侣DsbC，从而构建可切割的HIS-DsbC与目标蛋白的融合体（见图2）。
尽管本方案的重点是使用液体处理机器人和高通量电泳进行自动化操作，但这些方法同样适用于高通量手动操作。这意味着即使设备基础较为简单的实验室，也可以在无需昂贵仪器的前提下应用这些方案。有关从转化到纯化及分析的手动操作流程（不限于富含二硫键的蛋白质）已在其他文献中发表。24 且此处不再重复。手动操作的通量（从表达克隆开始，通过重组克隆产生）25，用于分析可溶性蛋白水平）为96（使用SDS-PAGE检测）或384（4 × 96；使用点印迹和SDS-PAGE）26每周培养（见 图1）。如果以半自动化方式（使用液体处理机器人和点印迹）进行，效率可进一步提高。26 或高通量电泳，例如使用 Caliper GXII LabChip 系统22 可并行处理多达1,152（12 × 96）个培养物，持续一周，用于结果分析，具体方法如本文所述。培养采用深孔24孔板（DW24）格式，因此可使用常规摇床培养箱；相比之下，深孔96孔板（DW96）格式的培养则必须使用短轨道高速振荡培养箱以实现充分通气（振荡速度为800 rpm）。采用自诱导培养基27 同时也简化了表达过程，消除了手动诱导步骤。即使在实验室已使用预定义的表达和纯化条件的情况下，这些条件也可直接转移至该高通量系统中，以提升效率。文中提供了二硫键丰富蛋白高通量筛选流程的详细示意图。 图3. 流程中的参数是基于大量筛选实验确定的11,22，这使我们能够选择最适合蛋白质生产的条件。
在初步研究中，可直接从小规模表达中纯化带有标签的蛋白质进行表征，此时数十微克样品已足够使用，或用于灵敏的功能检测和结合检测（例如低体积高通量膜片钳系统28）。只要去除标签和蛋白酶（例如通过反相高效液相色谱法），同样也可对切割后的无标签目标蛋白进行表征。质量控制还可通过质谱法（确认预期分子量及氧化状态）或色谱方法（确认纯度或异质性）进行29。有时标签的切割并非必需，甚至可能不利（特别是对于溶解性差的蛋白质30,31），因此本方案中标签切割为可选步骤。无论如何，所有构建体中，目标基因的上游均包含TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQ/[G]32），以便切割后获得天然序列的蛋白（见图2及讨论部分）。若需切割融合标签，可在小规模条件下对洗脱组分或“柱上”样品进行切割试验，以分析切割效率、必要时优化反应条件，并为后续放大实验提供可靠的产量估算。
在亲和纯化过程中，磁珠的使用体积有两种选择，具体取决于实验目的和预期。若需尽可能多地捕获蛋白（用于初步检测、质谱分析或放大生产时的产量推算），应使用终体积为200 µl的树脂，此条件下可在系统饱和前检测到培养物中1–100 mg/L范围内的可溶性蛋白（见第8.1节中的方案(A)）。然而，若实验目的是检测少量可溶性蛋白，则使用终体积为50 µl的树脂更为合适，此条件下可检测到培养物中0.1–25 mg/L范围内的可溶性蛋白（见第8.2节中的方案(B)）。
如有需要，可扩大生产规模，以获取毫克级纯化目标蛋白，用于进一步的结构与功能研究，具体条件基于可溶性表达所确定的条件。AFMB所用的放大工艺详细方案已在其他文献中讨论过22,24。
讨论部分提供了与实验设置相关的更多细节、方案中的关键步骤、技术的修改与故障排除方法以及该技术的局限性。在开始实验之前，请务必阅读讨论部分。
在整个实验流程中，我们期望每一步的成功率达到90%（例如，在任何特定步骤中，至少有90%的培养物能够正常生长）。如果实验中任一步骤的成功率低于90%，则应弃用这些样品，并对全部构建体重新进行实验。然而，该成功率标准不适用于可溶性蛋白表达的构建体数量或切割效率达到100%的构建体比例，因为这些指标在很大程度上取决于所测试的蛋白质本身。
每种实验方案中均提供了机器人工作台设置的具体细节（另见图4），但也可根据需要调整以适应其他类型的工作台配置。机器人硬件（Tecan）包括96通道多通道臂（MCA96）、机器人操作臂（RoMa）以及8通道液体处理头（LiHa）。所有使用MCA96的步骤在无MCA96时也可通过LiHa完成，但耗时更长，因为LiHa在各步骤之间需要进行清洗。尽管机器人系统在技术上并非无菌环境，但添加抗生素通常可确保不会出现污染或无菌问题。

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 液体处理机器人</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>实验方案可适配于配备真空多孔板装置的任何液体处理机器人。&lt;br/&gt; http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&amp;&ID=5270&amp;amp;Menu=1&amp;amp;Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96孔PCR（PCR96）板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr><tr><td>LB培养基</td><td></td><td></td><td>经高压灭菌以确保无菌。</td></tr><tr><td>抗生素储备液</td><td></td><td></td><td>卡那霉素（50 mg/ml）、氨苄青霉素（100 mg/ml）、氯霉素（34 mg/ml，溶于乙醇），储存于 &amp;minus;20 &amp;deg;C. 使用1:1,000的稀释比例。</td></tr><tr><td>96孔深孔板（DW96），每孔体积容量为2.42 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>经高压灭菌以确保无菌。&lt;br/&gt; http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr><tr><td>表达载体</td><td></td><td></td><td>用于目标表达载体的表达。储存于 &amp;minus;20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS 感受态细胞</td><td></td><td></td><td>或替代方案 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 用户选择的表达菌株。储存于 &amp;minus;80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Breathseal 可透气粘性薄膜</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>96孔板模块PCR仪</td><td></td><td></td><td>用于转化热激及 SDS-PAGE/Caliper 样品的煮沸处理。</td></tr><tr><td>24孔无菌组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr><tr><td>LB-琼脂</td><td></td><td></td><td>经高压灭菌以确保无菌。</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;无菌一次性吸头</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&amp;&ID=4118&amp;amp;Menu=1&amp;amp;Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron 摇床培养箱，3 mm 振幅</td><td>Infors</td><td>AJ103</td><td>非必需，也可使用普通振荡培养箱。&lt;br/&gt; http://www.infors-ht.com/index.php/zh-cn/</td></tr><tr><td>平板培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td></td><td></td><td>用于甘油菌种保存及采用纯化方案B进行洗脱。</td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td>用于制备甘油菌种保存液。</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;一次性吸头</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&amp;&ID=4118&amp;amp;Menu=1&amp;amp;Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>粘附胶带垫&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Group</td><td></td><td>或同等微生物消毒剂。</td></tr><tr><td>ZYP-5052 培养基</td><td></td><td></td><td>参见 &lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt; 有关组分的配方。</td></tr><tr><td>深孔24孔（DW24）板，10 ml 容量</td><td>沃特曼</td><td>7701-5102</td><td>经高压灭菌以确保无菌。&lt;br/&gt; http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>平底透明微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>用于吸光度测定。&lt;br/&gt; http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr><tr><td>平板读数分光光度计</td><td></td><td></td><td>可选。用于测量 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 培养物的</td></tr><tr><td>使用适用于深孔板的转子进行离心&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>适用于 3,800 × g。</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml，溶于水。储存于 &amp;minus;20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>咪唑 ACS 级</td><td>默克</td><td>IX0005-1</td><td>必须使用高纯度级别的咪唑，以免干扰 A&lt;sub&gt;280&lt;/sub&gt; 用于计算蛋白质产量的读数。</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8，含 0.25 mg/ml 溶菌酶（或您偏好的缓冲液）。每次均需从储备液中添加溶菌酶，避免长期储存。</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>平板超声仪（Ultrasonic processor XL，适配深孔板）</td><td>Misonix公司</td><td></td><td>非必需。通常仅溶菌酶就足以实现几乎完全的裂解。</td></tr><tr><td>DNase&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg/ml 储存液，溶于水，过滤除菌。分装后于 &amp;minus;20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>2 M 水溶液，经高压灭菌。</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 或 Caliper 样品缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8（或您偏好的缓冲液）。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris，300 mM NaCl，50 mM 咪唑，pH 8（或您偏好的缓冲液）。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8（或您偏好的缓冲液）。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>96孔接收/过滤板 20 &amp;micro;m，1.8 ml 容量</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/zh-CN/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;一次性宽口吸头</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&amp;amp;ID=4118&amp;amp;Menu=1&amp;amp;Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow 树脂</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>用于目标融合蛋白的纯化。4 ℃保存 &amp;deg;C. 使用前洗涤并平衡。&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr><td>烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶</td><td></td><td></td><td>可选，用于切割。2 mg/ml，储存缓冲液中不含还原剂。储存于 &amp;minus;80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>96孔 0.22 &amp;micro;m 滤板</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>可选步骤。用于在切割后过滤可溶性组分。&lt;br/&gt; http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/点印迹设备或Caliper Labchip GXII设备</td><td></td><td></td><td>电泳设备及凝胶类型的选择由用户决定&amp;rsquo;由研究者自行决定。</td></tr><tr><td>分光光度计和比色皿</td><td></td><td></td><td>用于测量 280 nm 处的吸光度（A&lt;sub&gt;280&lt;/sub&gt;）以计算可溶性蛋白的产量。若在Caliper上进行分析，则无需此步骤。</td></tr><tr><td>ZipTip 吸头</td><td>Millipore</td><td></td><td>可选。ZipTip 的类型由用户自行决定。对于较大的蛋白质应使用 C4 树脂，而对于肽段则 C18 可能更合适。也可采用其他样品脱盐方法，在进一步质量控制前对样品进行纯化。&lt;br/&gt; http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">材料按方案部分中的使用顺序列出。除特别注明外，试剂均可在室温下保存。作者参考编号&amp;rsquo;推荐使用指定材料，但同等产品也可适用。对于品牌不会影响实验结果的试剂，已省略公司信息。</td></tr></tbody></table>

高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（e. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) 是用于生产重组蛋白以进行结构与功能研究的最常用表达系统。然而，蛋白质纯化有时具有挑战性，因为许多蛋白质以不溶性形式表达。因此，在处理难以表达或多个目标蛋白时，建议在小规模（1–4&#160;ml 培养液）条件下进行高通量（HTP）蛋白表达筛选，以快速确定可溶性表达的条件。为应对实验室中各类结构基因组学项目的需求，已建立并验证了一种定量（重组蛋白产量范围为 0.1–100 mg/L 培养液）且高通量的蛋白表达筛选流程。该流程已通过液体处理机器人实现自动化，但也可在无专用设备的情况下手动操作。
富含二硫键的毒液蛋白因其作为治疗性药物先导分子的潜力而日益受到关注。这些蛋白可能具有高度的活性和选择性，但其复杂的二硫键网络使其制备极具挑战性。作为欧盟第七框架计划“欧洲毒理组学项目”（FP7 European Venomics project，<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>）的成员，我们的任务是开发高效的生产策略，旨在表达数千种新型毒液蛋白，用于功能表征。借助二硫键异构酶 DsbC 的氧化还原特性，我们优化了高通量生产流程，使其能够在大肠杆菌（E. coli）细胞质中表达氧化态且具有功能的毒液肽。该流程同样适用于多种富含二硫键蛋白的生产。本文以动物毒液蛋白的制备为例，展示了该流程的应用。采用本文所述方案，有望在短短一周内获得可溶性的富含二硫键蛋白。即使小规模制备，所纯化的蛋白也可用于通过质谱法验证其氧化状态、开展初步研究中的功能表征，或用于高灵敏度的微量检测。

代表性结果如图所示 图6 用于VENOMICS流程中96种富含二硫键蛋白的表达筛选. 蛋白质按照二硫键数目递增，随后按残基数递增的顺序排列。这些多肽在细胞质中表达，带有HIS标签和DsbC融合伴侣。在使用推荐的培养条件时，OD600 12 通常可达到。使用方案 8.2-B 进行肽的纯化，最终体积为 50 µl 镍亲和树脂的结合能力有限，因此本实验中最多可检测到约25 mg/L的融合蛋白。
图6A展示了Caliper LabChip系统获得的电泳结果（显示切割前的融合蛋白）以及基于外推法得出的融合蛋白产量评分系统（以每升培养液中的毫克数表示，分为0.1至2 mg/L培养液、2至10 mg/L培养液、10至25 mg/L培养液以及未检出）。请注意，切割后的DsbC标签通常迁移至约32 kDa处，而非预期的27 kDa。类似地，DsbC融合蛋白的迁移位置也通常比预期高出约5 kDa。在许多靶蛋白中，我们不仅观察到完整的融合蛋白（上条带），还观察到单独的融合伴侣蛋白（下条带）。对于其中部分靶蛋白，优化培养条件可提高完整融合蛋白（上条带）相对于单独DsbC的比例，从而提升最终产量。评分仅依据完整融合蛋白的水平进行。在96种蛋白中，仅有16种在融合蛋白水平上未能检出，总体成功率为83%。在可检测到的80种蛋白中，有45种的表达水平超过2 mg/L培养液（占56%）。根据靶蛋白和融合形式的不同，蛋白产量通常在2–100 mg/L培养液范围内（尽管在本示例中，采用方案8.2B时最多可检测到约25 mg/L的融合蛋白）。
根据二硫键数量对成功率进行的分析（如图6B所示）显示，对于所测试的所有二硫键数量（介于1至7之间），实验均取得了较为理想的成功率，其中含有6个二硫键的靶蛋白成功率最低，为66%。基于等电点和残基数对表达成功率分布的分析（如图6C所示）表明，该技术无明显偏好性，成功表达的靶蛋白与未检测到的靶蛋白在图中均呈分散分布。
图6D 展示了通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）对单一目标物在使用DTT还原前后所获得的质谱结果示例。通常情况下，无需进行如此全面的质谱分析（还原后的样品无需额外分析），但为了充分演示，我们展示了两种结果。所示目标物是一种分子量为5.7 kDa、富含二硫键的毒液蛋白，含有4个二硫键。左侧谱图显示的是蛋白在DTT还原前的结果，即裂解并脱盐后未进一步处理的状态。右侧谱图显示的是蛋白经DTT还原后再脱盐以去除过量DTT的结果。谱图中用箭头标出了对应于实验测得质量的离子峰，各离子的标识以绿色显示。这些离子所对应的实验母离子质量（分别为还原前（-DTT）和还原后（+DTT）的蛋白）列于表格中。测得的质量（还原前样品为5709.6 Da，还原后样品为5717.6 Da）相差8 Da。2 Da的质量差对应于1个氧化态二硫键的存在，因此8 Da的质量差表明未还原样品中存在4个二硫键（与预期一致）。
<img alt="基因转化过程示意图，包含PCR96板、表达载体和SDS-PAGE分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 高通量表达筛选流程的示意图。 使用本方案，单人每周可通过手动操作测试96至384种条件，或使用所述半自动化设备测试多达1,152种条件。表达质粒采用重组克隆技术构建，可同时对多个目标基因进行亚克隆。一旦确定可溶性表达条件并完成（如需要）切割反应，蛋白质即可进入质量控制环节，以检测氧化状态和纯度，并进行微量分析和/或大规模生产。
<img alt="使用HIS-DsbC载体进行蛋白质表达的基因克隆过程示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通用重组克隆与构建体设计示意图。 从目标入门克隆出发，可在单次实验中以高通量方式亚克隆出多种表达载体（每周最多可处理6 × 96个入门克隆）。所表达的蛋白质带有HIS标签，可用于镍亲和纯化。DsbC融合伴侣（缺失其周质信号序列，以实现胞内表达）可提高目标蛋白的可溶性，或辅助其正确折叠与氧化。需要注意的是，若需切除标签，目标编码序列应包含N端TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQ）。左上角插图展示了使用供体载体和目标序列构建入门克隆的过程，目标序列可通过PCR或基因合成获得。此外，也可从商业化的入门克隆文库中获取入门克隆。目前存在多种重组克隆系统，但本研究采用如示意图所示的Gateway系统。
<img alt="HIS-DsbC 蛋白表达流程图；基因合成、镍柱纯化、液相色谱/质谱分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 多个富含二硫键靶蛋白的高通量筛选流程。 靶蛋白最初以 HIS-DsbC 融合形式在 BL21 (DE3) pLysS E. coli 的细胞质中表达，使用自诱导培养基（ZYP-5052），培养温度为 37/17 °C。随后通过镍树脂进行纯化，并利用高通量电泳（或点印迹/SDS-PAGE）检测可溶性构建体。如果第一轮表达筛选未成功，则尝试替代的培养条件。若构建体能够产生足够产量的可溶性蛋白，则可进行微量分析和质量控制，如有需要，还可进行大规模生产。对于可溶性产量不足的靶蛋白，可继续采用其他菌株和培养温度进行表达筛选，随后尝试其他融合伴侣及周质表达。虚线框表示可选步骤。
<img alt="用于样本处理和分析的 MP4 和 MP3 槽位的自动化实验装置示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 高通量平台的机器人工作台设置。 图中展示了我们液体处理机器人工作台的布局，尽管只要具备相应的可用位置，也可使用其他类型的工作台。该设置包括一个清洗站（WS），用于8通道液体处理头（LiHa）；两个各含4个位置的微孔板架（MP4，位置1-4和5-8）；一个具有两个位置的真空站（Te-VacS，位置9和10）；一个含三个位置的微孔板架（MP3，位置11-13）；两个各含两个位置的板式振荡器（Te-Shakers，位置14-15和16-17）；以及一个用于一次性吸头、含三个位置的吸头架（DiTi，位置18-20）。此外，还包括两个深孔板储板架和一个微孔板储板架（图中未显示）。液体处理机器人上安装的硬件包括一个96通道多通道臂（MCA96），用于配合一次性吸头使用；一个带固定吸头的8通道液体处理头（LiHa）；以及一个可在工作台上移动微孔板/设备的机器人机械臂（RoMa）。本方案中所有步骤均参照上述位置编号进行描述。
<img alt="PCR96板分裂为四个TC24板；样品分布的孔板布局示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 从一个96孔板转移至四个24孔板的示意图。
<img alt="蛋白质表达分析；虚拟凝胶、二硫键、等电点；柱状图、散点图、ESI-MS结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 96种富含二硫键的毒液蛋白质表达筛选的代表性结果。这些蛋白质以HIS-DsbC融合形式在细胞质中表达，并使用50 µl镍树脂进行纯化（方案8.2-B）。A) 表达筛选结果，显示虚拟凝胶图像及表达产量评分。虚拟凝胶中各泳道的对比度已进行调整，以补偿条带过弱或过强的情况。请注意，某些目标蛋白可见两条条带，上方条带对应完整的融合蛋白，下方条带对应单独的融合标签。B) 不同表达水平下蛋白质所占比例与其蛋白质中二硫键数量的关系。每组中实际的蛋白质数量已叠加显示在图中。C) 基于等电点（pI）和残基数的表达水平分布情况。D) 一种分子量为5.7 kDa、含有4个二硫键的富含二硫键毒液蛋白的质谱分析结果示例。左侧谱图显示DTT还原前的蛋白，右侧谱图显示经DTT还原并脱盐后的蛋白。对应实验质量的离子以箭头标出，其归属以绿色显示。还原前与还原后蛋白的实验质量列于表格中，二者质量差为8 Da，表明在加入还原剂前蛋白处于氧化状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>配方</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZY</td>
			<td>~928 ml 
			10 g 胰蛋白胨 
			5 g 酵母提取物 
			925 ml 水</td>
			<td>混合后高压灭菌以达到灭菌效果。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgSO4</td>
			<td>100 ml 
			49.3 g MgSO4·7H2O 
			~60 ml 水</td>
			<td>搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x 5052</td>
			<td>1 L 
			250 g 甘油 
			730 ml 水 
			25 g 葡萄糖 
			100 g α-乳糖</td>
			<td>按顺序加入，加热搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x NPS</td>
			<td>1 L 
			900 ml 水 
			66 g (NH4)2SO4 
			136 g KH2PO4 
			142 g Na2HPO4</td>
			<td>按顺序加入并搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. ZYP-5052培养基各组分配方。

本文描述并应用了一种从小规模大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中对融合蛋白进行定量、高通量表达筛选及分析性纯化的方法，该方法适用于富含二硫键的动物毒液蛋白靶标的表达。

高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是用于结构与功能研究中重组蛋白表达最常用的表达系统。

以下实验方案的总体目标是利用高通量表达筛选流程，通过自动化液体处理机器人在大肠杆菌中定量可溶性蛋白的表达水平。该流程首先将转化了编码目标融合蛋白质粒的细胞接种至96孔预培养板中。次日，将含有自动诱导培养基的24孔板用前一晚的预培养菌液接种，以启动蛋白表达。收获培养物后，从表达培养物中冻存可溶性蛋白，再通过固定化金属亲和层析进行纯化。最终，可测定每种完整目标融合蛋白的溶解度水平，以确定蛋白质生产的最佳表达条件及成功靶点的生成。相较于传统方法，该技术具有效率更高、批次间差异有限以及数据处理与追踪简便等优势。该方法的可视化演示至关重要。自动化步骤仅以文本形式呈现时可能显得令人生畏且难以理解，因为文本无法传达该操作的速度或简便性。在细菌转化开始后，首先使用机器人夹具将第一个24孔LB琼脂平板的盖子移开。接下来，使用八通道液体处理臂从96孔转化板中混合并吸取50 µL转化混合液。将液体处理臂前四个通道中的转化混合物加入LB琼脂平板的第一列，后四个通道中的转化混合物加入LB琼脂平板的第二列。加样后彻底清洗所有吸头，然后继续将96孔板中的转化混合物转移至LB琼脂平板接下来的四列所有孔中，直至该平板完成。第一块平板的转移完成后，盖上盖子，开始下一块平板的转移。所有转化样品接种完毕后，以1200 RPM振荡所有平板一分钟，使转化混合物均匀分布。混匀后，使用96道移液臂从96孔板中吸取剩余转化混合物60微升，并将其加入含有LB肉汤的深孔96孔板中。用透气性胶膜密封深孔96孔预培养板，以保证培养过程中的通气，随后将该板置于37摄氏度摇床培养箱中，以最大转速过夜培养。预培养板放入培养箱后，将LB琼脂平板在生物安全柜中打开皿盖干燥约10分钟。然后将平板倒置，于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，使用液体处理臂将过夜预培养物各100微升转移至深孔96孔板中，按1:40的稀释比例接种表达培养物，操作方案与之前相同，并在每次处理预培养物的不同列之间，于清洗站彻底清洗液体处理臂。接种完成后，将表达培养物置于37摄氏度摇床培养箱中，密封透气胶带，培养四小时。然后将温度降至17摄氏度，过夜培养。次日早晨，将24孔深孔板在3000 ×g 条件下离心10分钟。将上清液弃入含有抗菌剂的废液容器中，然后将孔板倒扣在吸水纸上轻拍，以去除残留培养基，确认培养物生长正常。检查深孔中是否有菌体沉淀形成。接下来，吸取125微升裂解缓冲液，使用四个吸头将缓冲液分两次加入深孔24孔板的每个孔中。为达到重悬沉淀物所需的1毫升裂解缓冲液终体积，将板子在1200 RPM条件下震荡5分钟。在机器人上，将细胞悬液转移回深孔96孔板中对应的孔内，并将板子密封后于-80摄氏度保存至少1小时。本实验演示中，我们将使用50 µL镍珠来纯化目标融合蛋白。首先，在水浴中解冻深孔96孔板，约15分钟。然后，在摇床培养箱中以最大速度重新悬浮细胞裂解物，继续孵育10分钟，此时菌液应变得黏稠。接下来，使用手动八通道移液器将 DNA 和硫酸镁溶液分别加入深孔 96 孔板的每个孔中，使其终浓度分别为 10 微克/毫升和 20 毫摩尔。密封后继续震荡培养板 15 分钟，此时菌液应不再具有黏稠性。为避免纯化过程中滤板堵塞，必须仔细肉眼检查，确保所有裂解液均不再黏稠。在液体处理机器人上，使用 200 微升宽口吸头在转移 200 微升树脂悬液之前充分混匀。将 200 微升树脂悬液转移至含有裂解液的深孔 96 孔板中。在 1400 转/分钟及室温条件下振荡深孔 96 孔板 10 分钟，以促进结合。随后使用宽口吸头混匀树脂-裂解液悬液，并将全部 1200 微升悬液以每份 200 微升分批转移至滤板上。接着开启真空约 30 秒，使裂解液通过滤板过滤，并将滤过液收集至深孔板中。将含有穿流液的96深孔板从滤板下方移除，并放置于架子上保存，直至实验结束。随后，每次用800 µL结合缓冲液对树脂清洗两次；第二次清洗后，使用机器人夹具在滤板下方放置一个新的96深孔板，用于收集50 mM咪唑洗脱液。向滤板中加入150 µL洗涤缓冲液，再次施加真空，直至缓冲液完全通过含有树脂的96深孔板。从滤板下方移除的洗涤液被收集并置于架子上，保存至实验结束。随后，用800微升洗涤缓冲液再洗涤两次，操作方式与结合缓冲液的洗涤步骤相同；洗涤完成后，使用机器人夹具将微孔板转移至工作台，并将SPE柱块和滤板重新放回微孔板上方，以收集洗脱液。然后，向滤板中的树脂加入190微升洗脱缓冲液。三分钟后，施加真空一分钟，使所有缓冲液完全通过。迅速目视检查 Ellucian 加样体积是否正确。最后，收集 Ellucian 洗涤液和流穿液样品，用于可溶性表达水平的定量分析。首先分析ellucian板，仅在必要时检测相应的洗涤和流穿组分。这些数据展示了Caliper Lab Chip系统获得的电泳结果。完整的切割后融合蛋白由上方条带表示，而切割产生的蛋白片段则由下方条带表示。每种目标蛋白的融合产量分别处于每升培养液0.1至2、2至10以及10至25微克的范围内，在某些情况下则未检测到。通过各融合蛋白片段中二硫键的数量来评估蛋白表达的成功率，结果显示，对于所有测试数量的二硫键，表达均取得了合理成功，其中含有六个二硫键的目标蛋白成功率最低，为66%。基于等电点和残基数对表达成功率分布进行分析，表明该技术无明显偏好性，成功表达的目标蛋白和未检测到的目标蛋白在图中分布广泛。在检测到融合蛋白并进行切割后，纯化的目标产物需通过电喷雾电离质谱法进行质量控制。此处展示的代表性目标蛋白是一种分子量为5.7千道尔顿、富含二硫键的毒液蛋白，含有四个二硫键。该谱图显示的是蛋白在切割和脱盐后、但尚未用DTT还原时的检测结果，未进行其他干预处理。该谱图显示了蛋白质经DTT还原并脱盐以去除过量DTT后的结果。箭头指示对应于实验质量的离子，每种离子的标识以绿色标出。表中列出了这些离子计算得到的实验母离子质量，其质量差为8道尔顿，相当于四个被氧化的二硫键。建立后，可在一周内对一千多个培养物进行完整的实验流程。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用小规模的大肠杆菌培养，通过高通量方法确定可溶性蛋白表达所需的成功条件。

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生物学

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