蛋白质聚集对酵母细胞氧化应激的影响评价

蛋白质聚集诱发细胞氧化应激。本协议描述了一种通过流式细胞仪监测 amyloidogenic 蛋白的细胞内状态和与之相关的氧化应激的方法。该方法用于研究淀粉样β肽的可溶性和聚集易变性的行为。

该程序的总体目标是使用面包酵母酿酒酵母确定细胞内蛋白质聚集体的形成与其对细胞氧化应激的影响之间的关系。这种方法可以帮助回答蛋白质错误折叠和聚集疾病领域的关键问题，例如神经退行性疾病和非神经性淀粉样变性。该技术的主要优点是简单、快速，并且可以量化大量酵母中的细胞氧化应激损伤。

通过这种方法，我们可以深入了解淀粉样蛋白的细胞内可溶性或聚集状态与酵母中氧化应激水平之间的相关性。此外，它还可以应用于其他表达重组蛋白的模式生物。演示流式细胞术分析的是 UAB 流式细胞术设施的技术人员 Manuela Costa。

在这项研究中，使用在半乳糖诱导启动子的控制下与 GFP 融合的编码 A-β-42 的质粒转化的酿酒酵母来追踪不同 A-β-42 肽变体的细胞内聚集状态。挑选一个转化的酵母细胞菌落，接种到含有 2% 葡萄糖的 20 毫升 SC minus Ura 培养基中。在 30 摄氏度下搅拌培养物过夜。

第二天，将 100 μL 过夜培养物接种到 5 mL 新鲜 SC minus Ura 培养基中，并在 30 摄氏度下培养细胞 2 至 3 小时。当培养物的光密度为 590 纳米或 OD 590 为 0.5 时，以 3， 000 次 g 离心培养物 4 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 毫升含有 2% 棉子糖的新鲜 SC minus Ura 培养基中。将细胞在 30 摄氏度下搅拌孵育 30 分钟。

30 分钟后，将细胞以 3， 000 次 g 离心 4 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于含有 2% 半乳糖的新鲜 SC minus Ura 培养基中，以诱导重组蛋白表达。将细胞放回培养箱中 16 小时。16 小时后，将 1 毫升等分试样的培养物转移到无菌微量离心管中，并以 3， 000 次 g 离心 4 分钟，收获细胞。

通过测定 16 小时诱导的酵母细胞的 OD 590 来开始此过程。然后在无菌 PBS 中将细胞稀释至 OD 590 为 0.1。将表达的细胞悬液转移到适当标记的圆底聚苯乙烯管中，并避光保存。

准备非诱导细胞作为流式细胞术分析的阴性对照。将氧化应激探针添加到每个样品中，终浓度为 5 微摩尔。用铝箔覆盖样品，并在 30 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育完成后，离心细胞，去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 PBS 中。以这种方式用 PBS 洗涤细胞 3 次。第三次洗涤后，将细胞重悬于相同体积的 PBS 中。

确保流式细胞术分析中包括未染色的细胞。使用适当的激光器和滤光片，进行流式细胞术分析以检测 GFP 和氧化应激探针的荧光信号。首先单击 Open New Worksheet （打开新工作表） 面板，然后为实验命名。

从工具栏中，选择散点图工具，然后创建一个图，其中 y 轴上的侧向散射面积与 x 轴上的线性刻度上的前向散射面积。单击散点图工具，并在 x 轴上创建变量 FITC 面积与 y 轴上对数刻度的 APC 面积的绘图。单击 Instrument Setting 图标，然后在 Compensation 选项卡中将所有补偿级别设置为零。

然后单击 Acquisition 选项卡，并选择要以低流速记录的 20， 000 个事件的总数。由于一种荧光染料的荧光发射信号可以被另一种检测器检测到，因此必须执行补偿过程，通过单色控制来均衡所有检测器中每种荧光染料的最小信号。将试管 001 重命名为阴性对照，然后单击 Acquire 选项卡开始运行未诱导的、未染色的细胞。

在前向和侧向散射的 Instrument Settings（仪器设置）中调整电压，直到总体分布在左中象限。单击多边形图标以在不包括细胞碎片的细胞群周围设置区域 R1，并将此门控群体 P1 等于 R1 用于所有荧光点图和直方图表示。要调整荧光信号的 PMT 电压，请在 FL1 到 FL3 点图中运行未染色的细胞，在"仪器设置"选项卡中调整增益，直到细胞分布在左下象限。

使用散点图工具，创建一个 x 轴上变量 FITC-A 与 FSC-A 的点图，以及 x 轴上变量 APC-A 与 FSC-A 的第二个点图。接下来，将样品更换为诱导细胞以测量 GFP 荧光。在"仪器设置"选项卡中，设置当种群分布在右下象限时，FSC-A 与 FITC 的增益。

用门定义 GFP 阳性细胞群。将样品更改为未诱导的染色细胞。通过 FSC-A 与 APC-A 点图上的荧光显示氧化应激。

调整增益，直到细胞群分布在左上象限。在 P3 中设控阳性细胞群。使用直方图图标，制作两个直方图来表示细胞荧光，一个用于 FITC，另一个用于 APC 荧光。创建一个表格，显示平均荧光强度和中值荧光及其相应的标准误差和/或 GFP 荧光和氧化应激水平的方差系数。

单击 Compensation 选项卡，并将所有补偿级别设置为零。单击 Acquisition 选项卡，然后选择要记录的 20， 000 个事件的总数。准备三管新的样品，并将它们命名为 non-induced 、induced soluble 和 induced aggregated。

使用预设设置从样品中采集数据。通过打开一张新表格并为变量 FITC-A 和 APC-A 创建点图来分析数据，对阳性细胞进行门控以进行 CellROX 染色。对于每个样品，创建一个统计表，其中包含 FITC 和 APC 通道的平均荧光和标准误差。

也可以在聚集的蛋白质计数后使用 FACS 分选仪对细胞进行分选。在荧光显微镜下观察诱导期 16 小时后表达 A-β-42 变体的酵母细胞，以确定细胞内的重组蛋白分布。这些图像代表了选定的 A-β-42 GFP 变体。

分析集合的 20 个变体中，有 10 个证实了蛋白质包涵体或 PI 的形成。该条形图表示含有不同数量 PI 的细胞的百分比，该百分比是根据每个变体的总共 500 个荧光细胞计算到生物重复中的。观察到预测和体内聚集特性之间的极好一致性。

使用 A-β 特异性抗体定量细胞提取物中的蛋白质表达水平。作为一般趋势，形成 PI 的 A-β-42 变体（绿色）的水平低于弥散分布在胞质溶胶中的变体（红色）。当 A-β-42 变体的氧化应激探针荧光、蛋白质水平和 GFP 荧光特性相对于它们形成 PI 的能力以及由 AGGRESCAN 或 TANGO 生物信息学算法预测的内在聚集倾向时，观察到它们之间的重要差异。

PI 形成变体为绿色，非 PI 形成变体为红色。在此程序之后，还可以执行其他方法，例如碘化丙啶或膜联蛋白 V 染色，以回答其他问题，例如确定细胞内表达的蛋白质变体对细胞凋亡或细胞毒性的影响。