评估蛋白质聚集对酵母细胞氧化应激的影响

本实验的总体目标是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来确定细胞内蛋白质聚集体的形成与其对细胞氧化应激影响之间的关系。该方法有助于解答蛋白质错误折叠与聚集相关疾病领域中的关键问题，例如神经退行性疾病和非神经性淀粉样变性疾病。该技术的主要优势在于操作简便、快速，并可在大量酵母细胞群体中实现对细胞氧化应激损伤的定量分析。

通过该方法，我们可以深入了解酵母中淀粉样蛋白的细胞内可溶性或聚集状态与氧化应激水平之间的相关性。此外，该方法也可应用于表达重组蛋白的其他模式生物。流式细胞术分析将由乌尔米大学（UAB）流式细胞术实验室的技术员玛努埃拉·科斯塔（Manuela Costa）进行演示。

本研究利用携带表达A-beta-42与GFP融合蛋白质粒的酿酒酵母（S.cerevisiae），在半乳糖诱导型启动子调控下，追踪不同A-beta-42肽段变体的细胞内聚集状态。挑取一个转化酵母菌落，接种至20毫升含2%葡萄糖的SC缺氨酸尿嘧啶（SC minus Ura）培养基中。在30°C条件下振荡培养过夜。

次日，将100微升过夜培养物接种至5毫升新鲜的SC缺尿嘧啶（SC minus Ura）培养基中，在30摄氏度下培养2至3小时。当培养物在590纳米处的光密度（OD 590）达到0.5时，在3,000 × g下离心4分钟，弃去上清液，并将菌体重悬于5毫升含2%棉子糖的新鲜SC缺尿嘧啶培养基中。在30摄氏度下振荡培养30分钟。

30分钟后，将细胞在3,000 × g离心4分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于含有2%半乳糖的新鲜SC缺尿嘧啶培养基中，以诱导重组蛋白表达。将细胞放回培养箱中继续培养16小时。16小时后，取1毫升培养物分装至无菌微量离心管中，于3,000 × g离心4分钟，收集细胞。

开始此实验前，先测定诱导16小时的酵母细胞在590 nm处的光密度（OD 590）。然后用无菌PBS将细胞稀释至OD 590为0.1。将表达细胞悬液转移至相应标记的圆底聚苯乙烯管中，并避光保存。

以未诱导的细胞作为阴性对照，用于流式细胞术分析。向每个样品中加入氧化应激探针，终浓度为5 µM。用铝箔包裹样品，在30 °C下孵育30分钟。

孵育完成后，离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 PBS 中。用 PBS 以同样方式洗涤细胞三次。第三次洗涤后，将细胞重悬于相同体积的 PBS 中。

确保在流式细胞术分析中包含未染色的细胞。使用适当的激光器和滤光片，进行流式细胞术分析以检测 GFP 和氧化应激探针的荧光信号。首先点击“打开新工作表”面板，并为实验命名。

从工具栏中选择散点图工具，在 x 轴上以线性刻度绘制侧向散射面积（Side Scatter Area）与前向散射面积（Forward Scatter Area）的关系图。单击散点图工具，在 x 轴上绘制 FITC 面积（FITC Area），在 y 轴上以对数刻度绘制 APC 面积（APC Area）的关系图。单击仪器设置图标，在补偿选项卡中将所有补偿值设置为零。

然后点击采集选项卡，选择以低流速记录总共 20,000 个事件。由于一种荧光染料的荧光发射信号可能被另一个检测器检测到，因此需要通过单色对照进行补偿校正，以使每种荧光染料在所有检测器中的最小信号达到均衡。将试管 001 重命名为阴性对照，然后点击采集选项卡，开始运行未诱导且未染色的细胞。

在前向散射和侧向散射的仪器设置中调节电压，直至细胞群分布在左下象限的中间区域。单击多边形图标，在细胞群周围设置一个区域 R1，排除细胞碎片，并将此设门的细胞群 P1 定义为 R1，用于所有荧光散点图和直方图的显示。为了调节荧光信号的光电倍增管（PMT）电压，运行未染色细胞的 FL1 至 FL3 散点图，在仪器设置选项卡中调节增益，直至细胞分布在左下象限。

使用散点图工具，创建一个以 FITC-A 为横轴、FSC-A 为纵轴的散点图，以及第二个以 APC-A 为横轴、FSC-A 为纵轴的散点图。接下来，将样本切换为诱导后的细胞，以检测 GFP 荧光。在仪器设置选项卡中，当细胞群分布在右下象限时，调整 FSC-A 与 FITC 通道的增益。

使用门控定义GFP阳性细胞群。将样本切换为未诱导染色的细胞。在FSC-A与APC-A散点图上通过荧光显示氧化应激水平。

调节增益，直至细胞群分布在左上象限。在P3中圈选阳性细胞群。使用直方图图标，创建两个直方图以表示细胞荧光，分别对应FITC和APC荧光。建立一个表格，显示GFP荧光和氧化应激水平的平均荧光强度、中位荧光强度及其对应的标准误和/或变异系数。

单击补偿选项卡，将所有补偿水平设置为零。切换到采集选项卡，选择总共记录 20,000 个事件。准备三管新样品，分别命名为未诱导组、诱导可溶组和诱导聚集组。

使用预设参数采集样品数据。通过新建工作表并为变量 FITC-A 和 APC-A 创建散点图，分析数据，并圈选 CellROX 染色的阳性细胞。针对每个样品，生成统计表格，记录 FITC 和 APC 通道的平均荧光强度及其标准误。

在完成聚集蛋白计数后，也可以使用FACS分选仪对细胞进行分选。在诱导表达16小时后，表达A-beta-42变异体的酵母细胞可在荧光显微镜下观察，以确定细胞内重组蛋白的分布情况。这些图像代表了选定的A-beta-42 GFP变异体。

在分析的20种变异体中，有10种被证实形成了蛋白质包涵体（PI）。该柱状图显示了每种变异体在生物学重复中，总计500个荧光细胞中包含不同数量PI的细胞所占百分比。预测的聚集特性与体内实际观察结果高度一致。

使用 A-beta 特异性抗体对细胞提取物中的蛋白质表达水平进行定量。总体趋势显示，形成 PI 的 A-beta-42 变体（以绿色标示）的表达水平低于在细胞质中弥散分布的变体（以红色标示）。当将 A-beta-42 变体的氧化应激探针荧光、蛋白质水平和 GFP 荧光特性与其形成 PI 的能力以及通过 AGGRESCAN 或 TANGO 生物信息学算法预测的内在聚集倾向进行比较时，观察到不同 A-beta-42 变体之间存在显著差异。

形成PI的变异体用绿色表示，非形成PI的变异体用红色表示。通过此步骤，还可进行其他方法，如碘化丙啶或膜联蛋白V染色，以回答更多问题，例如确定细胞内表达的蛋白变异体对细胞凋亡或细胞毒性的影​​响。