Lambda 选择cII突变检测系统
April 26th, 2018
我们描述了一个详细的协议, 为 Lambda 选择cII突变试验的培养细胞的转基因啮齿动物或相应的动物处理的化学/物理剂的利益。该方法已广泛用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。
该方案的总体目标是可视化转基因啮齿动物或用感兴趣的化学和物理试剂处理的相应动物的培养细胞中涉及 Lambda Select cII 突变测定的逐步程序。这种测试方法可以帮助回答突变研究领域的关键问题，例如，测试化合物是否会诱变？如果是这样，它的诱变剂有多强效？
它会诱导序列特异性突变吗？该技术的主要优点是它几乎是任何测试化合物的最小剂量。该方法可用于使用染色体整合的报告基因在哺乳动物细胞中进行致突变性测试。
为了构建单个包装反应，在含有第一个反应混合物的微量离心管中加入 5 μg 基因组 DNA。然后将试管在 30 摄氏度下孵育 90 分钟。孵育后，向试管中加入 12 微升第二反应混合物，并在 30 摄氏度下再放置 90 分钟。
90 分钟后，向试管中加入 1.1 mL SM 缓冲液。然后在室温下用包装的 DNA 剧烈涡旋试管约 10 秒。在微型离心机中快速脉冲旋转。
然后将试管放在冰上直至使用。接下来，为每毫升包装的 DNA 添加 50 μL 氯仿。如果样品当天未处理，则轻轻涡旋样品并在 4 摄氏度下储存长达两周。
为单个包装的 DNA 样品准备 16 个无菌圆底管和 16 个 TB1 琼脂板。使用 10 个试管进行筛选，使用 6 个试管进行滴定。然后在每个圆底管中分装 300 微升 G1250 电镀培养物。
接下来，为了测定滴度，将 10 μL 包装的 DNA 添加到 990 μL SM 缓冲液中，并以 1：100 的比例稀释。然后涡旋样品。分别向三个滴度为 20 或滴度为 100 的试管中加入 20 或 100 μL 的 1：100 DNA 溶液。
为了进行筛选，向 10 个筛选管中的每个试管中加入 100 μL 未稀释的包装 DNA 样品。处理所有 16 个滴定和筛选管。涡旋试管 10 秒钟以混合组分。
然后将试管在室温下孵育 30 分钟，让宿主大肠杆菌吸收噬菌体。接下来，加入 2.5 毫升熔融的 TB1 顶琼脂。保持 55 摄氏度，以达到适当的滴定和筛选试管。
添加后，立即轻轻涡旋试管。现在，将 TB1 琼脂倒入适当的滴度或筛选 TB1 琼脂平板中。让板在室温下静置 15 到 30 分钟。
琼脂凝固后，将所有 10 个筛选板倒置并放置在 24 摄氏度的固定培养箱中 46 至 48 小时。将剩余的六个滴定板放在 37 摄氏度的固定培养箱中过夜或一天。在 37 摄氏度下孵育后，计算所有 3 滴度 20 和滴度 100 板中形成的斑块数量。
在 24 摄氏度下孵育后，计算 10 个筛选板中形成的斑块数量。为了验证假定的突变菌斑，用无菌宽口径移液器吸头对斑块进行取芯。然后将斑块转移到装有 500 微升无菌 SM 缓冲液的无菌微量离心管中。
然后将微量离心管在室温下孵育至少两个小时。接下来，在无菌圆底管中将 1 微升带芯噬菌体溶液与 200 微升 G1250 电镀培养物混合。然后将混合物在室温下孵育 30 分钟。
30 分钟后，将带芯噬菌体溶液接种在 2.5 毫升熔融 TB1 顶部琼脂中，并在 24 摄氏度下孵育 46 至 48 小时。一旦次级噬菌斑可见，使用移液器吸头挑选单个充分分离的 Lambda cII 突变菌斑。将斑块转移到微量离心管中，在移液管中多次加入 25 微升双蒸水。
将试管放在沸水中 5 分钟。然后在室温下以 18， 000 倍 G 离心管 3 分钟。离心后，立即将 10 μL 上清液转移到含有 40 μL PCR 预混液的新微量离心管中。
PCR 扩增后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化带有 cII 基因及其侧翼区域的 432 碱基旁扩增产物。然后使用 DNA 分析仪对 cII 转基因进行测序以检测突变。将滴定度 20 和滴定度 100 板中获得的噬菌斑放在白色灯箱旁边，在深色背景下清晰可见。
在这里，条形图描述了测试的物理化合物中各种化学物质的致突变效力。这是通过分析从小鼠胚胎纤维原始细胞中分离的相对 cII 突变频率的增加程度来完成的。条形图描述了所有这些测试试剂，显示 cII 突变频率的统计学显着倍数增加。
接下来，证明了 UVB 照射的小鼠胚胎纤维原始细胞中 cII 转基因的突变光谱。饼图显示，与对照相比，嘧啶二核苷酸处单个或串联胞苷向胸苷转变的相对频率显著增加。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 8 到 10 小时内完成，不包括培养中细菌条纹板的准备时间。
在 DNA 测序中，对 cII 突变体进行评分后。看完这个视频后，你应该对如何在体外模型系统中对测试化合物进行突变分析有了很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本协议概述了Lambda Select cII突变测定法，用于评估接触各种物质的转基因啮齿动物或动物培养细胞中的突变原性。该方法对于了解待测化合物的致突变潜力至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 突变研究
- 基因毒性测试
- 致癌物评估
背景
- Lambda Select cII突变测定法是一种广泛认可的方法。
- 它评估化学和物理物质的致突变效应。
- 该测定法利用染色体整合的报告基因。
- 它提供了对致突变物质的效力和特异性的见解。
研究目的
- 可视化Lambda Select cII突变测定法的逐步程序。
- 确定待测化合物是否具有致突变性及其效力。
- 研究序列特异性突变的诱导。
所用方法
- 利用转基因啮齿动物的培养细胞。
- 接触感兴趣的化学和物理物质。
- 通过报告基因评估致突变性。
- 逐步可视化测定程序。
主要结果
- 该测定法有效识别致突变化合物。
- 它展示了各种待测物质的效力。
- 可以分析序列特异性突变。
- 该方法适用于广泛的待测化合物。
结论
- Lambda Select cII突变测定法是突变研究的有价值工具。
- 它提供了关于化合物致突变性的关键数据。
- 该协议增强了对致突变机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Lambda Select cII mutation detection system enables quantitative assessment of mutagenic potential in mammalian cells, supporting early-stage genotoxicity screening in drug discovery. By measuring mutant frequency and spectrum, it provides mechanistic insights that help de-risk lead compounds before significant investment. This assay supports data-driven go/no-go decisions in preclinical development by identifying DNA-reactive agents with statistical confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA damage mechanisms and functional validation of genotoxic risk in lead candidates.
- Operational Value: Provides a chromosomally integrated reporter system for consistent, reproducible mutation detection across cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mutant frequency data to rank-order mutagenic potency of test compounds.
- Operational Value: Delivers standardized plaque-based readouts compatible with high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes mutation spectra (e.g., UVB-induced C→T transitions) to link mechanism to structural alerts.
- Operational Value: Supports cross-species extrapolation from transgenic rodent models to human relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the genotoxicity testing cascade, informing early discovery through lead optimization by providing quantitative mutagenicity data prior to traditional assays like Ames or micronucleus.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on DNA repair pathways and mutagenic mechanism elucidation.
- Screening: Enables reproducible, quantitative scoring of mutant plaques for compound prioritization.
- Analytics: Delivers mutant frequency and spectrum data for structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo mutagenicity via transgenic rodent models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mutagenicity profiling across therapeutic areas and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genotoxic risk assessment through mutation spectrum analysis.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized phage rescue and plating protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering mutagenic leads early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mutagenicity thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, phage techniques, and DNA sequence analysis.
- Dependent on lambda phage packaging systems, bacterial host strains, and selective agar media.
- Necessitates cross-team standardization between discovery toxicology and analytical genomics groups.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies across primary and immortalized cell lines.
- Practical limitations include multi-day workflow duration and sensitivity to genomic DNA quality and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
In Vitro Packaging Reaction
1:51
Plating the Packaged DNA Samples
3:36
Examination of the Titer and the Screening Plates to Determine the Putative cll Mutants, Verification of Mutant Plaques, PCR Amplification, and DNA Sequencing
5:31
Results: Use of λ Select cll Assay to Detect Mutations in the cll Transgenes from the Genomic DNA
6:31
Conclusion
