Lambda Select cII 突变检测系统

本方案的总体目标是可视化展示在转基因啮齿类动物的培养细胞或经受关注的化学和物理因素处理的相应动物中进行的λ选择cII突变检测的逐步操作过程。该检测方法有助于回答突变研究领域中的关键问题，例如：待测化合物是否具有致突变性？如果具有，其作为致突变剂的强度如何？

它是否会引起序列特异性的突变？该技术的主要优势在于，对几乎所有测试化合物而言，其影响极小。该方法可用于利用染色体整合的报告基因在哺乳动物细胞中进行致突变性检测。

进行单次包装反应时，将五微克基因组DNA加入含有第一反应混合液的微量离心管中。然后在30摄氏度孵育90分钟。孵育结束后，向管中加入12微升第二反应混合液，并在30摄氏度继续孵育90分钟。

孵育90分钟后，向离心管中加入1.1毫升SM缓冲液。然后在室温下剧烈涡旋振荡含有包装后DNA的离心管约10秒。随后在微量离心机中快速瞬时离心。

然后将离心管置于冰上，直至使用。接下来，每1 mL包装的DNA加入50 µL氯仿。如果样品不在当天处理，则轻轻涡旋混匀，并在4°C保存，最长可保存两周。

为单个包装的DNA样品准备16个无菌圆底试管和16块TB1琼脂平板。其中10个试管用于筛选，6个用于滴定。然后将300 µL G1250涂布培养物分装至每个圆底试管中。

接下来，进行滴定：将10微升包装好的DNA加入990微升SM缓冲液中，配制成1:100稀释液。然后涡旋混匀样品。分别取20微升或100微升该1:100稀释的DNA溶液，加入三个滴定20管或滴定100管中。

为进行筛选，向每支10个筛选管中加入100微升未稀释的包装后DNA样品。对全部16个滴定管和筛选管进行处理。涡旋振荡各管10秒，以充分混匀组分。

然后将试管在室温下孵育30分钟，使宿主大肠杆菌吸收噬菌体。接着向其中加入2.5毫升融化的TB1顶层琼脂，保持温度为55摄氏度，用于后续的滴定和筛选试管。

加入后，立即轻轻涡旋混匀各管。随后，将TB1琼脂倒入相应滴度或筛选用TB1琼脂平板中。将平板在室温下静置15至30分钟。

待琼脂凝固后，将全部10个筛选平板倒置，于24摄氏度的静止培养箱中培养46至48小时。将剩余的6个滴定平板置于37摄氏度的静止培养箱中过夜或培养一天。在37摄氏度培养结束后，计数所有3个滴定20和滴定100平板中形成的噬菌斑数量。

在24摄氏度孵育后，计数10块筛选平板上形成的噬菌斑数量。为验证疑似突变噬菌斑，使用无菌宽口移液器吸头挑取噬菌斑，然后将其转移至含有500 µL无菌SM缓冲液的无菌微量离心管中。

然后将微量离心管在室温下孵育至少两小时。接着，在无菌圆底管中，将1 µL噬菌体核心溶液与200 µL G1250涂布培养物混合。随后将混合物在室温下孵育30分钟。

30分钟后，将含有噬菌体的溶液取2.5毫升加入熔化的TB1上层琼脂中，混匀后于24摄氏度培养46至48小时。当次级噬菌斑可见时，用移液器吸头挑取单个分离良好的Lambda cII突变噬菌斑。将该噬菌斑转移至含有25微升双蒸水的微量离心管中，反复吹吸数次。

将离心管置于沸水中5分钟。然后在室温下以18,000 ×g离心3分钟。离心后立即取10 µL上清液，转移至含有40 µL PCR预混液的新的微量离心管中。

PCR 扩增后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化包含 cII 基因及其侧翼区域的 432 个碱基的扩增产物。然后使用 DNA 分析仪对 cII 转基因进行测序，以检测突变。在滴度为 20 和滴度为 100 的平板上获得的噬菌斑，通过将其置于白色光源箱旁并在深色背景下观察，可清晰可见。

此处柱状图展示了在测试的物理化合物中，各种化学物质的致突变强度。这是通过分析从小鼠胚胎成纤维细胞中分离得到的cII基因相对突变频率的升高程度而得出的。该柱状图显示了所有在cII突变频率上表现出具有统计学显著性倍数增加的测试试剂。

接下来展示了用 UVB 照射的小鼠胚胎成纤维细胞中 cII 报告基因的突变谱。与对照组相比，该饼状图显示在嘧啶二核苷酸位点，单个或串联的胞嘧啶至胸腺嘧啶转换的相对频率显著增加。一旦掌握，该技术若操作得当，不包括细菌划线培养的准备时间，可在八到十小时内完成。

在对 cII 突变体进行评分后的 DNA 测序中。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外模型系统中对受试化合物进行突变分析。