Name: 小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解利用免疫磁珠分选技术从新生小鼠中快速分离高纯度初级少突胶质细胞的方法。该技术可在约一小时内获得纯度超过80%的细胞，为研究髓鞘形成及相关神经系统疾病提供可靠的体外实验模型。

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本研究得到了美国国家多发性硬化症协会（RG4591A1/2）和美国国立卫生研究院（R03NS06740402）资助项目的资助。作者感谢Ivan Hernandez博士及其实验室成员提供实验空间、设备和建议。

本研究中使用的小鼠均按照纽约州立大学下州医学中心实验动物资源部（DLAR）方案编号 15-10492 的指南进行饲养和管理。
注意：原代少突胶质细胞来源于新生（P5-P7 野生型 C57Bl/6N）小鼠。在此阶段，未成熟少突胶质细胞（OL）占啮齿类动物白质的 80% 以上，可确保较高的细胞得率。所有缓冲液和试剂的组成均列于材料表末尾。
1. 盖玻片准备
注意：应在少突胶质细胞分离前准备好经多聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包被的盖玻片。
<ol>
	<li>将 #1 德国盖玻片放入 50 mL 圆锥形离心管中，加入 35 mL 70% EtOH 以清洗。</li>
	<li>盖紧管盖，置于摇床中，室温下轻轻摇动孵育至少 30 分钟；盖玻片也可过夜孵育。</li>
	<li>弃去 70% EtOH。</li>
	<li>用去离子水洗涤盖玻片 3 次，每次均用真空抽吸法去除水分。</li>
	<li>向 50 mL 管中的盖玻片加入 30–35 mL 浓度为 50 µg/mL 的 PDL，用量以能完全覆盖盖玻片为宜。</li>
	<li>将装有盖玻片的 50 mL 管置于摇床上，室温下轻轻摇动孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>用去离子水洗涤盖玻片 3 次，每次均用真空抽吸法去除水分。</li>
	<li>将盖玻片转移至含有去离子水的 60 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用 P200 移液器吸头将盖玻片排列成一层，覆盖培养皿整个表面。</li>
	<li>用真空抽吸法小心地从培养皿中去除水分。</li>
	<li>去除盖玻片周围的多余水分，将培养皿敞盖置于生物安全柜内的紫外线下过夜干燥。 
	注意：PDL 包被的玻璃盖玻片可在无菌培养皿中 4 °C 保存，最长可达三个月。</li>
	<li>用精细镊子将盖玻片放入 24 孔板中，每孔一片。</li>
	<li>将盖玻片移至孔中央，确保其边缘不接触孔壁。</li>
	<li>在每片盖玻片中心开始，以环形方式向边缘移动，加入 100 µL 用 B27NBMA（见材料表）稀释的 10 µg/mL 层粘连蛋白，以覆盖整个区域。 
	注意：由于层粘连蛋白参与 OL 的维持并促进其向成熟 OL 分化，因此是 in vitro 培养中重要的 OL 存活因子41,42,43,44。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育至少 1 小时，或直至 OL 准备接种。</li>
</ol>
2. 小鼠脑皮层解离
<ol>
	<li>使用先前用70%乙醇清洁过的剪刀，通过快速剪头法处死出生后5-7天的C57Bl/6N小鼠幼崽。 
	注意：每次制备使用5-6只新生小鼠的大脑皮层。平均而言，每只小鼠大脑可获得1-1.5 × 106个OLs。</li>
	<li>用小型解剖剪刀沿中线剪开头皮皮肤，并向两侧剥离以暴露颅骨。</li>
	<li>从颅骨后部开口处开始，沿中线小心剪开颅骨，向前额区域延伸，用剪刀轻轻抬起骨片，避免损伤脑组织。然后，从颅骨后部开口处沿颅底向每侧眼眶方向剪开。</li>
	<li>用精细镊子轻轻将大脑皮层从中脑分离，并转移至含有7 mL B27NBMA的60 mm组织培养皿中。对每个大脑重复步骤2.2至2.4，汇集所有分离的皮层组织。</li>
	<li>将皮层组织转移至另一个含有5 mL解离缓冲液（B27NBMA、20-30 U/mL木瓜蛋白酶和2,500 U DNase I）的60 mm组织培养皿中。</li>
	<li>使用#15手术刀片将皮层组织切成约1 mm3的小块，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>加入1 mL牛生长血清（BGS）以终止酶反应。</li>
	<li>用10 mL移液管将组织块连同解离液转移至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>用10 mL移液管缓慢吹打6-8次，轻柔地开始解离脑组织，注意尽量减少气泡产生。</li>
	<li>静置组织块2-3分钟使其沉降，然后将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>向组织沉淀中加入3 mL含10% BGS/2,500 U DNase I的B27NBMA。</li>
	<li>用5 mL移液管轻柔吹打6-8次，进一步解离脑组织，注意尽量减少气泡。</li>
	<li>静置组织块2-3分钟使其沉降。</li>
	<li>将上清液转移至新的离心管中。向组织沉淀中加入3 mL含10% BGS/DNase I的B27NBMA。</li>
	<li>使用P1000移液枪头轻轻吹打介质与脑组织的混合物，进一步解离组织。重复步骤2.13和2.14，直至无大块组织残留或含10% BGS/DNase I的B27NBMA耗尽（以先发生者为准）。注意尽量减少气泡。</li>
	<li>将细胞悬液与之前的上清液合并。</li>
	<li>将70 µm细胞筛置于50 mL离心管上。用10 mL移液管将合并的细胞悬液轻柔地通过70 µm细胞筛过滤。</li>
	<li>用含10% BGS/DNase I的1 mL B27NBMA冲洗细胞筛。</li>
	<li>弃去细胞筛。用含10% BGS/DNase I的B27NBMA定容至30 mL。</li>
	<li>将细胞悬液转移至两个15 mL锥形离心管中。在200 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>去除上清液，避免细胞暴露于空气中。由于细胞碎片的存在，上清液呈浑浊状。向沉淀中加入3 mL含10% BGS的B27NBMA。</li>
	<li>用P1000移液枪小心解离细胞沉淀。用含10% BGS的B27NBMA定容至15 mL。</li>
	<li>将细胞悬液通过新的40 µm细胞筛过滤。</li>
	<li>用含10% BGS的1 mL B27NBMA冲洗细胞筛。弃去细胞筛。</li>
	<li>用含10% BGS的B27NBMA定容至30 mL。</li>
	<li>将细胞悬液转移至两个15 mL锥形离心管中。在200 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>去除大部分上清液，避免细胞暴露于空气中。用5 mL冰冻的磁性细胞分选（MCS）缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
3. 细胞计数和活力的测定
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，将100 µL细胞悬液与400 µL台盼蓝溶液混合，制成体积比为1:5、浓度为0.4%（w/v）的稀释液。</li>
	<li>将盖玻片置于血细胞计数板的计数室中央，使用P10移液器向两个计数室各加入10 µL细胞稀释液，避免过量填充。溶液将通过毛细作用渗入盖玻片下方。</li>
	<li>将血细胞计数板放置于显微镜载物台上，使用40倍物镜调节焦距。 
	注意：使用手持计数器记录五个方格（四个角和中央一个）中的细胞数量。只有死细胞会吸收染料而呈蓝色，活细胞则呈圆形且具有折光性，不吸收蓝色染料，由此可确定每毫升中活细胞和总细胞的数量。</li>
</ol>
4. O4+ 少突胶质细胞的分离
<ol>
	<li>将细胞悬液在 200 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>使用真空抽吸小心弃去上清液，避免细胞暴露于空气中。</li>
	<li>每 1 × 107 个总细胞，用 90 µL MCS 缓冲液重悬沉淀，随后每 1 × 107 个细胞加入 10 µL 抗 O4 磁珠。</li>
	<li>用手指轻弹 15 mL 圆锥形离心管管壁 4–5 次，轻轻混匀细胞悬液与磁珠。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育混合物 15 分钟，每隔 5 分钟用手指轻弹管壁 4–5 次。</li>
	<li>每 1 × 107 个细胞，向管中轻柔加入 2 mL MCS 缓冲液洗涤混合物。在 200 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>使用真空抽吸小心弃去上清液，避免细胞暴露于空气中。每 1 × 107 个细胞，用 500 µL MCS 缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将磁性分离器固定于磁性分离架上。将分选柱连接至磁性分离器，并在分选柱上方放置一个 40 µm 细胞筛。在分选柱下方放置两个 15 mL 或一个 50 mL 圆锥形离心管，用于收集流穿液。</li>
	<li>用 3 mL MCS 缓冲液预冲洗 40 µm 细胞筛和分选柱，使缓冲液流过分选柱，注意避免柱体干燥。</li>
	<li>将细胞悬液与磁珠的混合物加入细胞筛并流入分选柱中。</li>
	<li>用 1 mL MCS 缓冲液冲洗 40 µm 细胞筛。</li>
	<li>弃去细胞筛，使细胞、磁珠和缓冲液的混合物流过分选柱，注意避免柱体干燥。</li>
	<li>用 3 mL MCS 缓冲液洗涤分选柱 3 次，再用 OL 增殖培养基洗涤 1 次。</li>
	<li>将分选柱从磁性分离器上取下，迅速放入一个 15 mL 圆锥形离心管中，并立即加入 5 mL OL 增殖培养基。</li>
	<li>将推杆置于分选柱顶部，用力下压，将标记的细胞冲洗至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>取 100 µL 细胞悬液，按照第 3 节所述方法，使用台盼蓝和血细胞计数板测定细胞数量和活率。 
	注意：细胞活率高于 80% 可视为适合继续进行 OL 培养，但活率大于 90% 为最佳。</li>
</ol>
5. 分离的 O4+ 少突胶质细胞的接种
<ol>
	<li>使用少突胶质细胞增殖培养基将细胞悬液稀释至所需的铺板密度（每盖玻片 5 × 105 个细胞）。 
	注意：少突胶质细胞的接种密度非常重要，因此在继续操作前应使用组织培养显微镜确认适当的细胞密度。每盖玻片接种密度低于 10,000 个细胞可能导致细胞存活率低下。在每盖玻片 10,000 至 25,000 个细胞的铺板密度下，少突胶质细胞的形态学分化较慢45。我们以每盖玻片至少 50,000 个细胞的接种密度进行铺板，以确保细胞存活。</li>
	<li>将含有层粘连蛋白包被盖玻片的 24 孔板从培养箱转移至组织培养超净台。</li>
	<li>移除每个盖玻片上的层粘连蛋白，并替换为 100 µL 少突胶质细胞悬液。</li>
	<li>将少突胶质细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育最多 45 分钟，以促进其在盖玻片上的贴附。</li>
	<li>孵育后，将 24 孔板从培养箱中取出，向每个孔中加入 500 µL 少突胶质细胞增殖培养基。</li>
	<li>将少突胶质细胞重新放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养 24 小时。</li>
	<li>少突胶质细胞铺板 24 小时后，移除增殖培养基，并替换为少突胶质细胞分化培养基以诱导分化。</li>
	<li>将少突胶质细胞重新放回培养箱中，直至细胞准备固定前不再取出。 
	注意：pH 值的变化对少突胶质细胞有害，并会降低细胞活力，因此应避免不必要的培养板移出培养箱操作。</li>
</ol>
6. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>检测细胞表面标志物（NG2、O1 和 O4）时，先从孔板中移除培养基。</li>
	<li>加入 250 µL 含有抗 O1（未稀释）13 和抗 O4（未稀释）13 的小鼠杂交瘤上清液，以及以 B27NBMA 稀释 1:150 的兔多克隆抗 NG2 抗体。 
	注意：若使用商业化抗 O1 和抗 O4 抗体，建议采用生产商推荐的稀释比例。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 培养箱中，将细胞与一抗共同孵育，时间最长不超过 45 分钟。</li>
	<li>用 0.05% Tween-20/1X PBS 洗涤两次。室温下用 4% 多聚甲醛（4% PFA）固定细胞 10 分钟。</li>
	<li>用 0.05% Tween-20/1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 B27NBMA 中按 1:400 稀释 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgM 或抗兔 IgG 二抗。</li>
	<li>移除盖玻片上的 0.05% Tween-20/1X PBS，加入二抗，室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% Tween-20/1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>若需进行双重染色以检测胞内标志物（GFAP），则移除 0.05% Tween-20/1X PBS，并用封闭/通透缓冲液在室温下封闭/通透细胞 15 分钟；否则直接进入步骤 6.17。</li>
	<li>移除封闭/通透缓冲液，加入 250 µL 以封闭/通透缓冲液按 1:100 稀释的鸡抗 GFAP 抗体。</li>
	<li>室温下与抗 GFAP 抗体共同孵育 1 小时，然后用 0.05% Tween-20/1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 B27NBMA 中按 1:400 稀释 Alexa 594 标记的山羊抗鸡 IgG 二抗。</li>
	<li>移除盖玻片上的 0.05% Tween-20/1X PBS，加入二抗，室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% Tween-20/1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，并用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片。</li>
	<li>将盖玻片在室温避光条件下过夜固化。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜观察染色后的细胞。 
	注意：本方案中，细胞在 40X 放大倍数下成像，曝光时间保持一致。</li>
</ol>

作者无披露信息。

本文介绍了一种高效分离高纯度小鼠未成熟少突胶质细胞培养物的方法。与先前发表的方案39，40相比，该方法获得了更高的纯度，GFAP阳性星形胶质细胞含量显著更低，其他未鉴定细胞的比例也非常低。需要强调的是，这些细胞是已承诺进入少突胶质细胞系的未成熟OLs。因此，这些细胞不适用于分化早期阶段的研究。
对 Dincman 方案的一项改进40 去除增殖培养基中的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。已有报道称 体外，bFGF 作为一种强效有丝分裂原因子，不仅抑制少突胶质前体细胞（OPCs）的分化，还减少其突起的数量46,47此外，bFGF 可促进少突胶质细胞系传代细胞的去分化与增殖 48因此，O4阳性细胞数量减少是合理的+ 细胞...

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统（CNS）中的髓鞘形成细胞1在严格调控的环境中分离和培养原代少突胶质细胞是一种有价值的工具，用于 体外 少突胶质细胞发育以及多发性硬化等脱髓鞘疾病生物学的研究2这需要一种高效且稳定的少突胶质细胞分离与培养方法3本研究利用少突胶质细胞特异性细胞表面标志物的表达，采用了一种改良的快速且特异的分离技术。
已鉴定出少突胶质细胞成熟的四个不同阶段，每个阶段均具有特定的细胞表面标志物表达特征（图1）。这些细胞表面标志物可被特异性抗体识别4,5，并可用于分离特定阶段的少突胶质细胞。在第一阶段，少突胶质前体细胞（OPCs）具有增殖和迁移的能力，并特异性表达血小板源性生长因子受体（PDGF-Rα）6、神经节苷脂A2B5、蛋白聚糖NG27,8、多唾液酸-神经细胞黏附分子9以及脂肪酸结合蛋白7（FABP7）10。OPCs呈双极形态，从细胞体相对的两极发出少量短突起，这是神经前体细胞的典型特征11。
<img alt="少突胶质细胞分化阶段示意图，显示细胞标志物 E13、P2、P7、P17。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠少突胶质细胞发育过程中细胞表面标志物的表达。 少突胶质细胞（OLs）的细胞表面标志物，如 A2B5、GalC（O1）、NG2、O4 和 PDGF-Rα，可用于通过特异性抗体在特定发育阶段特异性分离少突胶质细胞。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在第二阶段，少突胶质前体细胞（OPCs）分化为前少突胶质细胞，并在细胞膜上表达不仅包括OPC标志物，还包括O4抗体所识别的硫酸脑苷脂（一种硫酸化半乳糖脂）12,13，以及GPR17蛋白14，后者一直持续表达至未成熟少突胶质细胞（OL）阶段。在此阶段，前少突胶质细胞伸出多极的短突起。前少突胶质细胞是出生后第2天（P2）大鼠和小鼠脑白质中主要的OL阶段，同时存在少量未成熟OL15。
在第三阶段，未成熟的少突胶质细胞（OL）继续表达O4，失去A2B5和NG2标志物的表达，并开始表达半乳糖脑苷脂C16。在此阶段，OL已特化于少突胶质细胞系，成为具有长分支突起的终末分化非增殖性细胞17,18。在出生后第7天（P7），未成熟OL占啮齿类动物白质细胞总数的80%以上，此时可首次观察到髓鞘碱性蛋白阳性（MBP+）细胞15,19,20,21。因此，在P7时分离OL可确保获得较高的细胞产量。
在少突胶质细胞（OL）发育的最终第四阶段，成熟的少突胶质细胞表达髓鞘形成蛋白（髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（MOG）22,23,24,25,26。在此阶段，成熟的少突胶质细胞延伸出膜结构，形成致密的包裹轴突的髓鞘，并具备髓鞘化能力。这一过程与在大鼠和小鼠脑中观察到的现象一致：MBP+ 细胞在出生后第14天（P14）逐渐增多19,20,21。
自从 Fewster 及其同事于 1967 年首次分离出少突胶质细胞以来27，已建立了多种从啮齿类动物中枢神经系统（CNS）分离少突胶质细胞（OLs）的方法，包括免疫贴壁法28,29,30、利用细胞表面特异性抗原的荧光激活细胞分选（FACS）28,31、差速梯度离心32,33,34,35，以及基于不同中枢神经系统胶质细胞黏附特性差异的振荡分离法36,37。然而，现有的培养方法仍存在局限性，尤其是在纯度、得率以及操作所需时间方面38。因此，亟需更高效的少突胶质细胞分离方法。
本文介绍了一种简单高效的免疫磁珠分离法，用于从新生小鼠中分离第三阶段O4+前少突胶质细胞。该方法是在Emery et al.39和Dincman et al.40报道的技术基础上改进而来，可在约4小时内获得纯度超过80%的少突胶质细胞制备物。

<table><tbody><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器鲁尔锁扣式接头</td><td>BD，Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗鸡 IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>抗O4磁珠-抗O4微磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>人转铁蛋白（无铁形式）</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil 完整瓶顶过滤器组件，0.22 μm 滤膜，250 ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil 完整瓶顶过滤器组件，0.22 μm 滤膜，250 ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>牛生长血清（BGS）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-生物素</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I)</td><td>沃辛顿</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>配备 Olympus DP70 相机的落射荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>一次性羽毛状手术刀</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>德国玻璃盖玻片，1号厚度，直径12毫米，圆形</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>鸟类</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>磁力分离架 - MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>磁力分离器-MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&amp;micro;m 滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>封片剂——含 DAPI 的 Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸（NAC）</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>天然小鼠层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基 A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>神经营养素-3（NT-3）</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca2+ 的 PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 和 Mg²⁺&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>抗pm-2</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>选择柱-LS柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>微量元素 B</td><td>康宁</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸（T3）</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>康宁</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 mL Neurobasal 培养基 A；10 mL B27 添加剂；1 mL Primocin；1.25 mL Glutamax；过滤除菌后于 4 ℃ 保存 &amp;deg;C，直至使用。</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA；3 mL 牛生长血清</td></tr><tr><td>CNTF 溶液储备液（10 &amp;micro;g/ml；1000倍</td><td></td><td></td><td>从 Peprotech（货号 450-50）订购。根据生产商说明配制为 0.1 至 1 mg/ml&amp;rsquo;按照缓冲液中的说明（可能因批次而异）进行操作（例如 DPBS + 0.2% BSA）。储存于 -80 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; 工作液（10 &amp;micro;g/ml，1000 倍浓缩&lt;br/&gt; 1. 配制0.2% BSA（Fisher scientific BP-1600-100）的DPBS溶液，并经滤膜除菌。&lt;br/&gt; 2. 将母液分装物稀释至 10&amp;micro;g/ml，置于无菌、预冷的 0.2% BSA/DPBS 中。&lt;br/&gt; 3. 分装（20&amp;micro;l/管），并在液氮中速冻。&lt;br/&gt; 4. 将分装样品于 -80 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>d-生物素储备液（50 &amp;micro;g/ml；5000倍</td><td></td><td></td><td>将d-生物素（Sigma-B4639）溶于双蒸水，配制成50 &amp;micro;g/ml（例如，2.5 mg 溶于 50 ml ddH2O 中）。重悬可能需要较长时间的振荡或涡旋，或在 37℃ 短暂温和加热。&amp;deg;C. 如果d-生物素仍然无法溶解，配制较低浓度的溶液（例如10&amp;micro;g/ml），并增加B27NBMA的添加体积（1/1000而非1/5000）。4 ℃保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I 储存液</td><td></td><td></td><td>1. 将脱氧核糖核酸酶 I 以 12,500 U/ml 的浓度溶解于预冷的 HBSS 中。&lt;br/&gt; 2. 在冰上进行过滤除菌&lt;br/&gt; 3. 分装至200 &amp;micro;l 并在 -20℃ 过夜冷冻&amp;deg;C.&lt;br/&gt; 4. 将分装样品储存在 -20 至 -30&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）</td><td></td><td></td><td>将一袋粉末溶于 1 升水中，配制成每升培养基含 9.6 克粉末的 1 升培养基。2-8 ℃ 保存。 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Forskolin 储存液（4.2 mg/ml；1000×）</td><td></td><td></td><td>向含有50 mg福斯科林（Forskolin）的瓶子（Sigma-F6886）中加入1 ml无菌DMSO，用移液器吹打至重悬。转移至15 ml离心管中，再加入11 ml无菌DMSO，使其终浓度为4.2 mg/ml。分装（例如20 &amp;micro;l）并在 -20 保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1. 量取 900 ml 水（温度 15–20 °C），加入搅拌子后置于磁力搅拌器上。缓慢加入 9 g 氯化钠、3 g 氯化钾、1.2 g 磷酸二氢钠和 4.8 g 磷酸氢二钠，持续搅拌直至完全溶解。用 1 M 盐酸调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。将溶液分装至 500 ml 瓶中，15 psi 高压灭菌 20 分钟。室温保存。 &amp;deg;C）在量筒中轻轻搅拌。&lt;br/&gt; 2. 加入电源并搅拌至溶解。&lt;br/&gt; 3. 用少量水冲洗原包装，以去除粉末的所有残留。&lt;br/&gt; 4. 向第2步中的溶液中添加。&lt;br/&gt; 5. 每升终体积加入0.35克碳酸氢钠（7.5% w/v）。&lt;br/&gt; 6. 持续搅拌直至溶解。&lt;br/&gt; 7. 在搅拌过程中将缓冲液的pH值调节至比pH=7.4低0.1–0.3个单位，因为过滤过程中pH可能会上升。建议使用1N HCl或1N NaOH调节pH。&lt;br/&gt; 8. 加入蒸馏水至终体积为1 L。&lt;br/&gt; 9. 使用孔径为0.22微米的滤膜过滤除菌。&lt;br/&gt; 10. 储存于 2-8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>胰岛素储备液（4000 &amp;micro;g/ml</td><td></td><td></td><td>解冻瓶子并分装 25 &amp;micro;每微离心管1升，于-20℃保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>层粘连蛋白溶液</td><td></td><td></td><td>在低温（2℃）下缓慢解冻层粘连蛋白&amp;deg;C至8&amp;deg;C）以避免凝胶形成。然后分装至聚丙烯管中。于5℃保存&amp;deg; C 至 -20&amp;deg; C，分装保存（例如 20 &amp;micro;l）且避免反复冻融。层粘连蛋白在此温度下可保存长达六个月。</td></tr><tr><td>磁性细胞分选（MCS）缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制含有磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）、0.5 mM EDTA 的溶液，5&amp;micro;g/ml 胰岛素，1 g/L 葡萄糖。将缓冲液通过 0.22 微孔滤膜过滤，以除菌并去除溶解气体 &amp;micro;m Millex 滤器。将缓冲液于 4&amp;deg;C，直至使用</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）储备液（5 mg/ml；1000倍）</td><td></td><td></td><td>将 N-乙酰-L-半胱氨酸（Sigma-A8199）以 5 mg/ml 的浓度溶解于 DMEM 中（例如，50 mg NAC 溶于 10 ml B27NBMA）。过滤除菌后分装（例如，20） &amp;micro;l). 储存于 -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NT3 储存液（1 &amp;micro;微克/毫升；1000倍</td><td></td><td></td><td>母液&lt;br/&gt; 购自 Peprotech（货号 450-03）。根据制造商说明配制成 0.1 至 1 mg/ml&amp;rsquo;s 说明（可能因批次而异），置于缓冲液（如 DPBS + 0.2% BSA）中。于 -80 保存&amp;deg;C.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 工作液（1&amp;micro;微克/毫升；1000倍&lt;br/&gt; 1. 配制0.2% BSA的DPBS溶液，并经滤膜除菌。&lt;br/&gt; 2. 将母液分装物稀释至1 &amp;micro;g/ml，置于无菌、预冷的0.2% BSA/DPBS中&lt;br/&gt; 3. 分装（例如 20&amp;micro;l/管）并在液氮中速冻。&lt;br/&gt; 4. 将分装样品储存在 -80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PDGF 储存液（10 &amp;micro;g/ml；1000倍</td><td></td><td></td><td>母液：&lt;br/&gt; 从 Peprotech 购买（货号：100-13A）。根据生产商说明配制成 0.1 至 1 mg/ml&amp;rsquo;s 说明（不同批次可能有所差异）加入缓冲液（如 DPBS）+ 0.2% BSA 中。储存于 -80&amp;deg;C.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 工作液（1&amp;micro;g/ml；1000倍&lt;br/&gt; 1. 配制0.2% BSA的DPBS溶液，并过滤除菌。&lt;br/&gt; 2. 将母液分装物稀释至1&amp;micro;g/ml，置于无菌、预冷的0.2% BSA/DPBS中&lt;br/&gt; 3. 分装（例如 20&amp;micro;l/管）并在液氮中速冻。&lt;br/&gt; 4. 将分装样品于 -80 保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸（1 mg/ml；100倍）</td><td></td><td></td><td>将聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine，分子量70–150 kD，Sigma P6407）以0.5 mg/ml的浓度溶于0.15 M、pH 8.4的硼酸溶液中（例如，50 mg溶于50 ml硼酸缓冲液）。过滤除菌后分装（例如，100 μl/管）&amp;micro;l/管。于 -20℃ 保存&amp;deg;C. 使用前，将100倍储存液（1 mg/ml）稀释至50倍 &amp;micro;g/ml，溶于无菌水。</td></tr><tr><td>少突胶质细胞增殖培养基</td><td></td><td></td><td>见 &lt;a href=&quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;补充表 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>少突胶质细胞分化培养基</td><td></td><td></td><td>见 &lt;a href=&quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;补充表 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sato 补充剂（100X）</td><td></td><td></td><td>见 &lt;a href=&quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;补充表 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>参考文献：试剂与配方列表采用自 Emery 等人 2013 年 previously 描述的实验方案（Emery, B. &amp;amp; Dugas, J. C. 通过免疫贴壁法纯化小鼠大脑皮层少突胶质细胞系细胞。Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) 以及 Dincman 等人 (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. &amp;amp; Whittemore, S. R. 皮质小鼠少突胶质前体细胞的分离。J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

高效且稳定的原代少突胶质细胞（OLs）的分离与培养，是研究少突胶质细胞发育以及多发性硬化和Pelizaeus-Merzbacher样疾病（PMLD）等脱髓鞘疾病生物学机制的有力工具。in vitro 此处我们介绍一种简单高效的免疫磁珠分离法，用于从新生小鼠中分离第三阶段 O4+ 前体少突胶质细胞。由于在出生后第7天（P7）时，未成熟OL占啮齿类动物脑白质的80%以上，该分离方法不仅能确保较高的细胞得率，还可特异性地分离已定向分化为少突胶质细胞系的OLs，从而降低星形胶质细胞及其他小鼠脑细胞等污染细胞被分离的可能性。本方法是在先前报道技术基础上的改进，可在约4小时内获得纯度超过80%的少突胶质细胞制备物。

本研究的目的是建立一种改进的O4+原代小鼠少突胶质细胞分离方法，以尽可能减少对靶细胞的操作。从处死幼鼠到细胞接种至盖玻片的整个过程约需4小时，本文所示数据来自三次独立实验。组织解离后，每次独立实验平均可获得4.3 ± 0.46 x 107个细胞，细胞活力为91% ± 5.6%。经抗O4标记的磁性微珠进行免疫磁珠分离后，平均获得6.9 ± 0.38 x 106个少突胶质细胞（每只小鼠可得1-1.5 x 106个），占初始解离总细胞数的16.2% ± 1.6%；细胞活力为96.3% ± 3.5%。
<img alt="细胞分化显微镜图像；各图显示NG2、O4、GFAP和O1标记物染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000...

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外 培养

原代少突胶质细胞（OLs）的高效且稳定的分离与培养是体外研究少突胶质细胞发育以及多发性硬化和类佩利齐乌斯-梅尔茨巴赫病（PMLD）等脱髓鞘疾病生物学的重要工具。本文介绍了一种简单高效的免疫磁珠分离法，用于从新生小鼠中分离第三阶段O4+前少突胶质细胞。由于在出生后第7天（P7）时，未成熟少突胶质细胞占啮齿类动物脑白质细胞总数的80%以上，该分离方法不仅能确保较高的细胞得率，还可特异性地分离已定向进入少突胶质细胞系的细胞，从而降低星形胶质细胞及其他脑组织细胞污染的可能性。本方法是在先前报道技术基础上的改进，可在约4小时内获得纯度超过80%的少突胶质细胞制备物。

该技术的总体目标是利用免疫磁珠分离法从新生小鼠中选择 O4 阳性少突胶质细胞，用于其体外培养分析。该方法有助于解答神经科学领域中与影响髓鞘及髓鞘形成相关疾病研究有关的关键问题。该技术的主要优势在于，可在约 4 小时内获得纯度超过 80% 的终末少突胶质细胞培养物。首先使用小型解剖剪刀沿出生后第5至7天小鼠头皮的中线剪开皮肤。将皮瓣向两侧拉开以暴露颅骨，然后从颅骨后部开口处沿中线小心地向前额区域剪开颅骨。从颅骨后部的开口开始，沿骨骼基部向每侧眼眶剪开，用精细镊子轻轻将大脑皮层与中脑分离。然后，将皮层组织转移至一个含有 7 毫升 B-27 Neurobasal A 培养基的 60 毫米组织培养皿中。当所有脑组织收集完毕后，将皮层组织转入另一个含有 5 毫升解离缓冲液的 60 毫米组织培养皿中，并使用 15 号手术刀片将皮层切成 1 立方毫米大小的组织块。将脑组织块置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 20 分钟。然后，加入一毫升牛生长血清以终止酶促反应。使用10毫升血清移液管将组织悬液转移至15毫升锥形管中，通过移液操作轻柔地吹打6至8次以解离脑组织。让解离后的组织碎片静置沉降2至3分钟。然后，将上清液转移至一个新的离心管中。接着，向组织中加入3毫升Neurobasal A培养基，该培养基需添加胎牛生长血清和DNase I，并使用5毫升移液器通过反复吹打轻柔地分散组织。需要注意，适当的吹打力度对于确保获得高活力的细胞产量至关重要。如果吹打过于剧烈，细胞活力可能较低；而如果吹打过于轻柔，则细胞得率可能较低。让组织块再静置两到三分钟。然后，将上清液转移至新离心管中，并向组织中加入3毫升新鲜的Neurobasal A培养基，该培养基需添加牛生长血清和DNase I。使用P-1000移液器枪头轻轻吹打脑组织，直至无明显组织块残留，注意避免产生气泡。用10毫升移液管将细胞悬液经70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中，并用添加了牛生长血清和DNase I的新鲜Neurobasal A培养基将单细胞悬液终体积补至30毫升。将细胞悬液均分至两个15毫升锥形管中，通过离心沉淀神经细胞。除去混浊的上清液，仅保留最后5至10微升，然后向细胞中加入3毫升添加了牛生长血清的Neurobasal A培养基。轻轻重悬细胞沉淀，并用含10%牛生长血清的新鲜Neurobasal A培养基将终体积调至15毫升。将细胞悬液通过40微米细胞滤筛过滤至新的50毫升锥形管中，并用含10%牛生长血清的新鲜Neurobasal A培养基将终体积补至30毫升。然后，将过滤后的细胞悬液分装到两个15毫升的锥形离心管中进行离心，并将沉淀物重新悬浮于2.5毫升预冷的磁性细胞分选缓冲液中，随后合并细胞。计数后再次离心细胞，并将沉淀物按每1×10⁷个细胞加入90微升新鲜磁性细胞分选缓冲液重新悬浮。接着，每 1×10⁷ 个细胞加入 10 微升抗-O4 磁珠，轻轻弹动混匀细胞悬液。在 4°C 条件下孵育 15 分钟，每 5 分钟轻弹混匀一次。然后每 1×10⁷ 个细胞加入 2 毫升磁性细胞分选缓冲液，通过离心洗涤，并小心用真空抽吸弃去上清液。每 1×10⁷ 个细胞用 500 微升新鲜磁性细胞分选缓冲液重悬细胞沉淀，并将合适大小的磁珠分选柱放入相应的磁性分离器中。将40微米细胞筛置于层析柱上，用3毫升磁性细胞分选缓冲液预冲洗细胞筛，让缓冲液流过层析柱，注意避免柱子干燥。将细胞加入细胞筛中，随后用1毫升磁性细胞分选缓冲液冲洗。每次用3毫升磁性细胞分选缓冲液洗涤柱子，共洗涤3次，再用少突胶质细胞增殖培养基洗涤1次。然后，将柱子转移至15毫升离心管中，使用推杆立即冲洗5毫升新鲜的少突胶质细胞增殖培养基通过柱子。计数后，将细胞稀释至适当的铺板密度，并用100微升少突胶质细胞增殖培养基替换24孔板中预先包被的盖玻片上的层粘连蛋白。将少突胶质细胞在37摄氏度和5%CO2条件下孵育，时间不超过45分钟，以促进少突胶质细胞在盖玻片上的贴附。然后，向24孔板的每孔中加入500微升少突胶质细胞增殖培养基，于37°C孵育24小时。次日，将上清液更换为少突胶质细胞分化培养基，并将细胞重新放回培养箱中继续培养，直至准备进行固定。接种24小时后，细胞在相差显微镜下呈现双极或三极形态，这是早期增殖阶段少突胶质细胞的典型特征。免疫荧光染色显示，接种后24小时，这些前体少突胶质细胞中的大多数同时呈现NG2和O4标记，而GFAP和抗-01抗体标记则少见得多，表明此阶段的大多数细胞为前体少突胶质细胞，仅有少量未成熟或成熟少突胶质细胞。在72小时时，少突胶质细胞的形态较24小时更为复杂，早期少突胶质细胞标志物NG2阳性的细胞频率显著降低。此外，大多数细胞呈现O4标记，近一半细胞在此阶段对01抗体呈阳性染色，提示细胞正在向更成熟的表型分化。值得注意的是，星形胶质细胞的存在极低。这些结果表明，随着时间的推移，通过免疫磁珠分离的少突胶质细胞能够在体外分化至成熟第三阶段，且其他细胞类型（如星形胶质细胞）的污染极少。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用免疫磁珠分离法从小鼠幼崽中分离原代少突胶质细胞。一旦掌握，该技术可在四小时内完成，前提是操作得当。感谢观看。祝您的实验顺利。

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小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离

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从小鼠幼崽大脑中磁分离小胶质细胞

本视频演示了一种从小鼠幼崽脑皮层中分离和培养少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的技术。...

从小鼠幼崽脑皮层中分离与培养少突胶质前体细胞

本视频展示了一种利用磁性分离法从小鼠幼鼠神经细胞悬液中分离原代少突胶质细胞的方法。该技术采用包被有针对少突胶质细胞抗原的特异性抗体的磁珠，从而实现这些细胞的选择性分离。...

使用免疫磁珠分离小鼠原代少突胶质细胞

本视频演示了一种利用磁性细胞分选技术从小鼠脑内脱髓鞘病灶中提取小胶质细胞的实验方案。该方案包括解剖含有小胶质细胞的病灶脑组织，使用特定酶处理组织以获得单细胞悬液，并利用针对小胶质细胞受体的磁珠分离小胶质细胞。...

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