小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离
May 21st, 2018
我们描述了主鼠标少突胶质的磁隔离, 它允许对体外区域性的细胞进行快速和特定的隔离。
该技术的总体目标是使用免疫磁性分离从新生小鼠幼崽中选择 O4 阳性少突胶质细胞，用于体外培养分析。这种方法可以帮助回答神经科学领域与研究影响髓鞘和髓鞘形成的疾病有关的关键问题。该技术的主要优点是，它有助于在大约小时内制备纯度大于 80% 的最终少突胶质细胞培养物。
首先使用小解剖剪刀沿着出生后第 5 至 7 天的小鼠头皮中线切割皮肤。缩回皮瓣露出头骨，然后沿着中线从背部开口到额部小心地切开头骨。从颅骨后部的开口开始，沿着骨头底部切向每个眼窝，然后用细镊子轻轻地将皮质从中脑中梳开。
然后，将皮质转移到含有 7 mL B-27 Neurobasal A 培养基的 60 mm 组织培养皿中。收集完所有大脑后，将皮质转移到一个新的 60 毫米组织培养皿中，该培养皿含有 5 毫升解离缓冲液，并使用 15 号手术刀刀片将皮质切成一立方毫米的块。将脑碎片在 37 摄氏度的 5%CO2 培养箱中孵育 20 分钟。
然后，加入 1 毫升牛生长血清以终止酶促反应。使用 10 毫升血清移液器，将组织浆液转移到 15 毫升锥形管中，然后用移液轻轻解离脑组织 6 到 8 次。让解离的组织块静置 2 到 3 分钟。
然后，将上清液转移到新管中。接下来，向组织中加入 3 mL Neurobasal A 培养基，补充有牛生长血清和 DNase I，并使用 5 mL 移液器通过更多移液轻轻分离组织。您会看到，适当的移液力对于确保活细胞的高产量至关重要。
如果移液太难，则活力可能较低。而如果移液太温和，细胞产量可能会很低。让组织块再静置 2 到 3 分钟。
然后，将上清液转移到新试管中，向组织中加入 3 mL 新鲜的 Neurobasal A 培养基，其中补充有牛生长血清和 DNase I。用 P-1000 移液器吸头轻轻解离脑组织，直到没有大块组织残留，注意避免气泡。使用 10 毫升移液器通过 70 微米细胞过滤器将细胞溶液过滤到 50 毫升锥形管中，并使用新鲜的 Neurobasal A 培养基将单细胞悬液的最终体积降至 30 毫升，补充有牛生长血清和 DNase I.将细胞悬液分成两个 15 毫升锥形管， 并通过离心沉淀神经细胞。
除最后 5 至 10 μL 混浊上清液外，去除所有上清液，并向细胞中加入 3 mL 补充有牛生长血清的 Neurobasal A 培养基。小心地重悬细胞沉淀，并使用含有 10% 牛生长血清的新鲜 Neurobasal A 培养基使最终体积达到 15 mL。通过 40 微米细胞过滤器将细胞溶液过滤到新的 50 mL 锥形管中，并使用含有 10% 牛生长血清的新鲜 Neurobasal A 培养基使最终体积达到 30 mL。
然后，将过滤后的细胞悬液分装在两个 15 mL 锥形管中进行离心。并在混合细胞之前将沉淀重新悬浮在 2.5 mL 冰冷的磁性细胞分选缓冲液中。计数后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于 90 微升新鲜磁性细胞分选缓冲液中，每 1 乘 10 至 7 个细胞中。
接下来，向 7 个细胞中每 10 乘以 10 加入 10 微升抗 04 微升，轻轻轻弹混合细胞溶液。在 4 摄氏度下放置 15 分钟后，每 5 分钟轻轻轻弹一次，向 7 个细胞中轻轻加入 2 毫升磁性细胞分选缓冲液，每 1 乘 10 次，离心洗涤，然后小心真空抽吸弃去上清液。将沉淀重悬于 500 微升新鲜的磁性细胞分选缓冲液中，每 1 次 10 至 7 个细胞，并将适当大小的磁珠分选柱放入相应的磁性分离器中。
将 40 微米过滤器放在色谱柱上，并用 3 mL 磁性细胞分选缓冲液预冲洗过滤器，让缓冲液流过色谱柱，不要让色谱柱干燥。将细胞加入过滤器中，然后用 Magnetic Cell Sorting Buffer 洗涤 1 mL。每次洗涤用 3 mL 磁性细胞分选缓冲液洗涤柱 3 次，用少突胶质细胞增殖培养基洗涤 1 次。
然后，将色谱柱转移到 15 mL 试管中，并使用柱塞立即将 5 mL 新鲜的少突胶质细胞增殖培养基冲洗到色谱柱中。计数后，将细胞稀释至适当的铺板密度，并在 24 孔板中用 100 μL 少突胶质细胞增殖培养基替换预包被盖玻片上的层粘连蛋白。将少突胶质细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育不超过 45 分钟，以促进少突胶质细胞粘附在盖玻片上。
然后，用 500 μL 少突胶质细胞增殖培养基淹没 24 孔板的每个孔，孵育 24 小时。第二天，用少突胶质细胞分化培养基替换上清液，并将细胞放回培养箱中，直到它们准备好固定。铺板后 24 小时，细胞在相差显微镜下呈双极或三极，这是早期增殖少突胶质细胞的特征。
免疫荧光染色显示，铺板后 24 小时，这些前少突胶质细胞中的大多数也表现出 NG2 和 O4 标记，而用 GFAP 和抗 01 抗体标记则少见得多，表明这个阶段的大多数细胞是前少突胶质细胞，很少有未成熟或成熟的少突胶质细胞。72 小时时，少突胶质细胞形态似乎比 24 小时时更复杂，并且早期少突胶质细胞标志物 NG2 阳性的细胞频率要低得多。此外，大多数细胞表现出 O4 标记，在这个阶段几乎有一半的细胞进行了 01 抗体染色，表明细胞正在分化为更成熟的表型。
值得注意的是，星形胶质细胞的存在仍然极低。这些结果表明，随着时间的推移，免疫磁分离的少突胶质细胞能够在体外分化到成熟的第三阶段，而其他细胞类型（如星形胶质细胞）的污染非常小。看完这个视频，你应该对如何使用免疫磁性分离从新生小鼠幼崽中分离原代少突胶质细胞有了很好的了解。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。感谢观看。祝你的实验好运。
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概述
本研究详细说明了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁性分离，促进了快速和特异性的细胞分离以便进行体外分析。该技术针对新生小鼠的O4阳性少突胶质细胞，探索与髓鞘形成及其相关疾病相关的问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 髓鞘形成研究
背景
- 少突胶质细胞对于神经系统中髓鞘的形成至关重要。
- 了解其分离有助于研究脱髓鞘疾病。
- 该方法显著提高了细胞培养的纯度和效率。
- 免疫磁性分离有助于研究少突胶质细胞的行为和功能。
研究目的
- 分离和培养少突胶质细胞以进行体外实验。
- 研究与少突胶质细胞相关的细胞和分子动力学。
- 建立一种具有高细胞活力和纯度的方法以供未来研究。
使用的方法
- 原代少突胶质细胞培养的免疫磁性分离方法。
- 使用5-7天龄的小鼠作为生物模型。
- 未提及多组学工作流程。
- 分离过程旨在达到超过80%的纯度，大约需要一小时。
- 关键步骤包括组织解离、细胞悬液制备和磁性分选。
主要结果
- 该方法实现了适合后续实验分析的高产量和高纯度的少突胶质细胞。
- 免疫荧光染色显示了早期增殖少突胶质细胞的特征。
- 成功的分离使得能够研究髓鞘形成和相关疾病的机制。
- 研究结果的意义强调了该方法在评估少突胶质细胞功能中的作用。
结论
- 本研究展示了一种有效的少突胶质细胞分离方法，适用于神经科学研究。
- 免疫磁性分离技术显著提高了分离细胞的纯度。
- 研究结果有助于深入理解少突胶质细胞生物学及其对脱髓鞘疾病的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes enables high-purity, lineage-committed cell populations for in vitro disease modeling and mechanistic studies. This capability supports early-stage target validation and de-risking in neurobiology-focused discovery pipelines, particularly for demyelinating disease research. The method's efficiency and specificity facilitate reproducible workflows and scalable assay development for translational neuroscience portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of oligodendrocyte lineage commitment and myelination pathways in disease-relevant systems.
- Supports biological de-risking by minimizing contaminating cell types, increasing confidence in downstream analyses.
- Facilitates functional target validation for myelin-associated therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity oligodendrocyte cultures for quantitative in vitro assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based screening platforms for neuroactive compounds.
- Enables reliable evaluation of compound effects on oligodendrocyte differentiation and maturation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant cell types for demyelinating disorder studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies of myelination.
- Reduces risk of confounding results due to cellular heterogeneity in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This immunomagnetic isolation method fits at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and mechanistic de-risking in neurobiology pipelines.
- Discovery Biology: Delivers lineage-committed oligodendrocytes for hypothesis-driven studies of myelination and neurodegeneration.
- Screening: Supplies reproducible, high-purity cell populations for quantitative assay development and compound screening.
- Analytics: Enables robust measurement of differentiation markers and cell-type purity for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by maintaining disease-relevant cellular context.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across neurobiology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies of myelination.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and reproducible cell isolation for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neurotherapeutic portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiology assets through robust in vitro validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection and immunomagnetic cell sorting.
- Demands access to magnetic separation instrumentation and validated antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of cell handling and assay protocols.
- Adaptable to other neural cell types with appropriate marker selection and validation.
- Yield and purity may vary with tissue quality and operator proficiency.
