寡肽竞争测定磷酸化位点测定

该程序的总体目标是同时评估多个潜在的磷酸化位点，并确定位点，以便通过磷酸化位点突变体进行后续验证。这种方法可以帮助回答生物化学和细胞生物学领域关于翻译后修饰在细胞信号传导中的作用的关键问题。该技术可轻松、经济、友好地对磷酸化位点和目标蛋白进行初步筛选。

该技术的含义扩展到包括炎症和癌症在内的疾病的诊断和治疗，因为磷酸化是人类疾病信号通路中的重要生化事件。协助演示的是我实验室的研究生 Sol-Bi Shin，他在进行定点诱变时。首先在冰上混合 50 ng 血浆 pGEX JST NRF2、125 ng 正向引物、125 ng反向引物、1 μL DNTP 混合物、2.5 单位的 PFU DNA 聚合酶和 10x 反应缓冲液。

加入无菌蒸馏水，使体积达到 50 μL。进行 PCR 以掺入突变链，然后将样品在冰上冷却 2 分钟。向冷却的样品中加入 1 μL DPNI 限制性内切酶。

移液混合样品，然后以 13， 000 次离心 G 离心样品 1 分钟，将样品在 37 摄氏度下孵育 2 小时以消化亲本双链 DNA。然后将具有 endA1 和 RACA1 突变的超感受态大肠杆菌细胞扔在冰上。向冷藏的细胞中加入 50 μL 反应混合物，并在冰上孵育 30 分钟。

同时，将加热块预热至 42 摄氏度。孵育完成后，将混合物在 42 摄氏度下加热 90 秒，然后在冰上冷却混合物 2 分钟。将预热的溶原肉汤添加到转化的细胞中。

将混合物在 37 摄氏度下孵育 1 小时，同时以 180 RPM 的速度摇动。然后将细胞铺展在 LB 氨苄青霉素琼脂平板上，并在 37 摄氏度下孵育平板过夜。将单个菌落转移到 5 毫升含氨苄青霉素的溶原肉汤中。

将样品在 37 摄氏度下孵育过夜，同时以 180 RPM 振荡。使用标准小型制备试剂盒提取样品 DNA，用于 DNA 序列分析。在 DNA 分析仪中运行至少 200 ng 的 HDNA 构建体以验证突变序列。

表达和纯化经过验证的突变 NRF2 蛋白。在进行激酶测定之前确定产生的突变 NRF2 的数量。要开始肽竞争检测，请制备一磷酸腺苷浓度为 500 μmol 的 5X 激酶缓冲溶液。

然后解冻 AMPK 野生型人 NRF2 的冷冻样品和三种模拟 NRF2 的 AMPK 磷酸化位点的卵肽。对于每种肽，在冰上时，将 0.43 毫克肽与 0.15 μg AMPK、0.4 μg NRF2 和 6 μL 5X 激酶缓冲液混合。加入无菌蒸馏水，使最终体积达到 30 微升。

然后在屏蔽区域，将加热块设置为 30 摄氏度。向每个试管中加入 1 微居里 γ 32P ATP，通过上下移液彻底混合每种溶液。将反应混合物在 30 摄氏度下孵育 15 至 30 分钟。

在孵育过程中，制备 7.5%STS PAGE 凝胶。然后向每管中加入 3 μL 10X STS 样品缓冲液，并充分混合以终止激酶反应。将样品在凝胶中以 70 伏电压电泳 20 分钟，然后在 140 伏电下电泳 1 小时。

完成凝胶电泳后，小心地去除溴酚蓝线以下的高放射性凝胶。轻轻地将凝胶从灌篮转移到玻璃管上。将凝胶在 50% 甲醇、40% 水和 10% 乙酸的溶液中固定 20 分钟。

然后轻轻地将凝胶放在滤纸上，并用透明包装膜覆盖。用真空凝胶干燥器在 80 摄氏度下干燥凝胶 1 小时。将干燥的凝胶暴露在磷屏或 X 射线胶片上约 16 小时，分别持续两天。

使用 Phosphorimager 生成屏幕的高分辨率 TIFF 或 Bitmap 文件。要开始 AMPK 活性测定，请在冰上解冻 AMPK 以及突变型和野生型 GST NRF2 的样品。将 0.4 μg 突变型 GST NRF2 与 0.15 μg AMPK 和 6 μL 5X 激酶缓冲液混合。

加入无菌蒸馏水，使体积达到 30 微升。以这种方式用 0.4 μg 野生型 GST NRF2 制备另一种反应混合物。向每个反应瓶中加入 1 微居里 γ 32P ATP

上下移液混合物数次，然后短暂离心混合物。将混合物在 30 摄氏度下在屏蔽区域孵育 30 分钟，然后用 3 μL 10X STS 样品缓冲液终止激酶反应。运行 STS PAGE，固定凝胶，并使用与竞争性激酶测定相同的条件干燥凝胶。

将凝胶暴露在磷屏下过夜，然后用 Phosphorimager 扫描屏幕。在三个模拟人 NRF2 上 AMPK 磷酸化位点的 10 个残基寡肽存在下进行体外 AMPK 测定。模拟丝氨酸 558 位点的寡肽为 AMPK 磷酸化提供了最大的竞争。

然后合成用丙氨酸替代丝氨酸 558 的 NRF2 突变体，并在体外活性测定中进行评估。观察到 S558 A 突变体的 AMPK 磷酸化非常少，表明 AMPK 在丝氨酸 558 位点直接磷酸化人 NRF2。由于肽与蛋白质竞争性结合，该方法的原理也可用于鉴定其他后翻译和修饰，例如乙酰化和赖氨酸残基以及蛋白质蛋白质相互作用。

不要忘记，使用放射性同位素可能非常危险。在执行此程序之前，应已经接受了放射性同位素安全培训。