Name: 光遗传学玻璃光纤化学传感在醒鼠中的神经型鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习使用定制玻璃光纤电极在清醒小鼠中进行光遗传学单细胞记录的技术。该方法利用VGAT-channelrhodopsin-II转基因小鼠模型，可可靠识别GABA能和谷氨酸能神经元，为神经环路研究提供经济高效的工具。

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作者受到日本促进科学振兴会（JSPS）KAKENHI 资助项目 JP16K11200 和 17H02223，以及金泽医科大学研究资助项目 S2016-8 和 C2017-3 的支持。我们感谢 Yuhichi Kuda 在拍摄照片过程中提供的协助。

所有操作均遵循日本生理学会的指导原则，并经金泽医科大学动物护理委员会批准。
1. 玻璃光导电极架的构建
注意：构建玻璃光导电极架时，需使用商用的电极架（图1A）。
<ol>
	<li>轻轻将压力控制用的不锈钢管从持针器筒体中抽出。</li>
	<li>通过钻孔，扩大持针器筒体上针座侧的孔，使其直径为 3 mm，深度为 12 mm。</li>
	<li>将一根不锈钢管（直径 3 mm，壁厚 0.5 mm，长度 8 mm；图 1A2）插入该孔中。</li>
	<li>将一个用于 ⌀2.5 mm 插芯的陶瓷分体对接套筒（图 1A1）插入孔中。</li>
	<li>使用环氧胶将电极持针器的筒体固定在 L 形凹槽接头中。</li>
	<li>在凹槽接头上加工出孔（直径 3 mm），并用螺钉将其固定在操纵器上。</li>
</ol>
2. 头部固定装置安装
<ol>
	<li>使用电路板间隔柱制作一个定制的头固定柱。用铣刀将柱状电路板间隔柱加工成矩形，并用锯子切割成两个头固定柱（图1B）。用铣刀将头固定柱底部磨平。</li>
	<li>准备一种转基因动物，使其特定类型的神经元表达光敏感视蛋白用于研究。本实验中使用的是抑制性神经元表达通道视紫红质-2（ChR2）的转基因小鼠（VGAT-ChR2小鼠）11。</li>
	<li>通过腹腔注射给予0.3 mg/kg美托咪啶、4.0 mg/kg咪达唑仑和5.0 mg/kg布托啡诺的混合物以麻醉动物。通过夹捏尾巴测试动物反应，确认其已完全麻醉。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上的立体定位仪中。提前用70%酒精清洁立体定位仪和加热垫。将门齿放入咬杆孔中，轻轻夹紧鼻部固定器。使用耳杆固定头部两侧。当耳杆正确固定头部后，进一步收紧鼻部固定器。在眼睛上涂抹眼用软膏。</li>
	<li>用小剪刀剃除头部皮肤毛发，并用蘸有氯己定葡萄糖酸盐的棉签清洁头皮。手术前，将所有手术器械和头固定柱在高压灭菌器中灭菌（121 °C，15分钟）。</li>
	<li>用剪刀沿中线切开头皮并将其拨开。切口从头部后方延伸至眼睛前方（约20 mm）。用蘸有70%酒精的棉签去除骨膜，并将颅骨表面干燥。</li>
	<li>将头固定柱安装到操纵臂上。使用操纵臂将头固定柱平整地放置在颅骨上靠近前囟的位置。</li>
	<li>在预先冷藏的小碟中，将牙科水泥的单体（4滴）、催化剂（1滴）和聚合物（1小勺）混合均匀。将少于1 g的牙科水泥涂抹于颅骨的额骨和顶骨区域，以固定头固定柱。</li>
	<li>待牙科水泥硬化后，将小鼠从立体定位仪中取出。在暴露的皮肤上涂抹抗生素软膏。注射美托咪啶拮抗剂（0.3 mg/kg）和抗生素（土霉素；20 mg/kg）。将小鼠置于笼内加热垫上直至苏醒，并持续监测，之后将其送回饲养笼。</li>
	<li>将动物单独饲养在配备一定丰富化装置的笼中。每日更换垫料以保持笼内清洁并预防感染。密切观察动物是否出现任何不适症状。若怀疑存在疼痛，可在伤口处使用利多卡因。&#160;在头固定柱安装和开颅手术后，每24小时给予美洛昔康或卡洛芬一次，持续48小时。若非甾体抗炎药效果不足，可额外给予局部利多卡因。</li>
</ol>
3. 适应性培养
<ol>
	<li>在麻醉恢复后至少两天，使动物适应在记录室内的头部固定状态。适应性训练应持续至少5天。</li>
	<li>在适应性训练期间，将动物置于记录室内，并通过定制夹具固定其头部连接柱。训练过程中，为限制动物活动，使用3D打印机制作的定制树脂半管覆盖其身体（图1C）。 
	注意：第1天的适应性训练应持续5分钟，随后每天依次增加至第2、3、4、5天分别为10、20、40和60分钟。</li>
	<li>每次训练结束后，给予动物食物奖励。若动物在适应过程中持续挣扎，应立即终止训练。</li>
</ol>
4. 开颅术
注意：在适应期结束后，在用于记录的脑区上方进行开颅手术。开颅手术在立体定位仪框架中进行，并在麻醉条件下完成，与安装头固定装置时的操作相同。术后操作步骤与头固定装置安装时相同。&#160;
<ol>
	<li>开颅手术前，使用含有氯己定葡萄糖酸盐和70%酒精的棉签清洁颅骨。</li>
	<li>使用牙科钻小心刮除记录位点上方的颅骨。当骨层变得足够薄时，用手术刀尖将其切开并移除。</li>
	<li>在暴露区域周围涂抹牙科水泥，以增强颅骨强度。</li>
	<li>待牙科水泥硬化后，用硅胶粘合剂覆盖暴露的脑区。术后操作步骤如2.8步所述。</li>
</ol>
5. 电生理记录
<ol>
	<li>颅骨开窗术后，让动物至少恢复1天，然后再进行电生理记录。记录开始时，将动物以适应性训练期间相同的方式放入记录舱内。</li>
	<li>使用电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.5 mm，内径 = 0.9 mm，长 90.0 mm）拉制成玻璃移液管。移液管尖端直径为 2–3 µm，当其充满 10 mM PBS 时，电阻为 4–6 MΩ。电极长度为 40–50 mm。在某些记录中，向 10 mM PBS 中添加 2% 神经生物素。</li>
	<li>将装满液体的玻璃移液管连接到定制的光导探针架上。</li>
	<li>将镀有氯化银的银丝（直径0.2 mm）插入玻璃微量移液管中，并将银丝连接至一根针脚 通过 一根带涂层的细电线。将该导线连接至记录放大器的前置放大头级。</li>
	<li>将光纤跳线（纤芯 = 960 µm，包层 = 1,000 µm，数值孔径 = 0.63）一端带有氧化锆插芯（外径 = 2.5 mm）插入光探针支架的分体式对接套筒中。推动跳线使其插芯端面与玻璃移液管后端接触。该跳线用于将LED光源（波长 = 465 nm）发出的光传输至探针，LED光源由单通道LED驱动器控制。</li>
	<li>移除颅骨开窗处的硅胶粘合剂。记录过程中定期将预热的生理盐水（38 °C）滴加到脑表面，以防止脑组织干燥。必要时，使用尖头镊子去除硬脑膜。</li>
	<li>使用操纵器将玻璃电极插入脑组织。插入过程中监测电极电阻，当电阻低于预期值时更换电极，因为电极尖端可能已受损。在目标深度处，以2至5 µm的步进微调深度，搜索并分离单个神经元的动作电位。</li>
	<li>单个细胞分离后，给予LED光照并观察其对光刺激的反应。</li>
	<li>在确定细胞类型后记录神经活动，持续记录 2–3 小时。若需连续多日记录（最多 2 天），每日记录结束后用硅胶粘合剂覆盖颅骨开窗部位。记录结束后，处死动物，取下头固定装置，用丙酮清洗后保存以供重复使用。</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
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<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
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<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光遗传学已成为神经科学领域的一项强大工具，被用于鉴定特定类型的神经元 体内 以及调控特定神经元通路的活动。阐明不同类型神经元的神经活动有助于理解神经环路的机制。在此，我们展示了一种方法，通过玻璃电极将光传递至清醒状态下的VGAT-ChR2小鼠中脑下丘（IC）记录位点。
该方法中包含若干关键步骤。首先，必须使用在目标神经元中视蛋白表达充足且特异的动物。为了通过细胞外记录识别光反应，视蛋白的激活必须能够诱发目标神经元产生动作电位。在某些转基因品系中，幼年动物神经元中的转基因表达水平可能较低14，且该实验可能存在最低年龄限制。此外，可能需要进行一些额外实验，以确认对光刺激的反应是否特异性地针对目标神经元类型例如免疫组织化学）。当目标神经元为兴奋性神经元时，有必要区分直接诱发的反应与突触传递诱发的反应，可通过设定反应潜伏期的阈值来实现。其次，必须确保脑组织尽可能洁净。保持清洁尤为关键，以防止开颅和记录过程中发生出血。此外，开颅后应使用硅胶粘合剂严密覆盖脑表面，防止脑组织干燥。
<p class="j...

中枢神经系统由多种类型的神经元组成，这些神经元具有不同的功能。这些不同类型的神经元如何在神经环路中发挥作用，是神经科学领域的主要关注问题之一。然而，在许多脑区，由于电活动本身的放电信号并无明显差异（少数例外情况除外），在体内电生理记录中难以区分神经元类型。近年来光遗传学技术的进步实现了重大突破1,2。通过使用转基因动物，使光敏感视蛋白（例如，通道视紫红质-2）在特定类型的神经元中表达，现在可以在体内记录中高效地区分神经元类型3,4,5,6。在这些动物中，电生理记录期间施加光刺激可特异性激活表达光敏感视蛋白的神经元，而其他神经元则不会被激活。因此，通过其对光刺激的响应，可轻松将表达视蛋白的神经元与其他类型的神经元区分开来。
在光遗传学实验中，将光有效传递至记录位点至关重要。作为一种非侵入性方法，光通常从脑表面导入。然而，由于光在穿过脑组织时强度会逐渐衰减，因此从脑表面刺激深部脑区十分困难。尤其当脑表面光学透明度较低时，刺激光更难以到达深部脑区，这种情况在清醒动物的记录中尤为常见。电生理实验通常在麻醉动物上进行，因为动物身体的运动会在记录中引入噪声。然而，已有充分文献表明，麻醉会改变神经反应7,8,9,10。因此，为了研究不受麻醉人为效应干扰的神经反应，有必要使用清醒动物。与麻醉动物实验不同，清醒动物的电生理记录是在手术恢复后进行的。在手术与记录之间的间隔期内，组织渗出物常在脑表面聚集，导致脑表面光学透明度降低。
本文介绍了一种使用自制玻璃光刺激电极在清醒小鼠中进行单细胞记录的方法。该方法通过记录用的玻璃电极传递光信号，从而能够可靠地对深部脑区中被记录的神经元进行光刺激。这种自制的光刺激电极系统由易于获取且成本较低的材料组成，组装简便。

<table><tbody><tr><td>电极夹持器</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>用于微电极放大器的移液管夹持器</td></tr><tr><td>陶瓷分体对接套管</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>直径2.5 mm套管</td></tr><tr><td>电路板间隔柱</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>直径8.0 mm，长20.0 mm</td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>小鼠用立体定位仪器</td></tr><tr><td>操作器</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>手动操作器</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>牙科粘接树脂水泥</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D打印机</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>低毒性硅胶粘合剂</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>外径1.5 mm，内径0.9 mm，长90.0 mm</td></tr><tr><td>光纤连接线</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>单芯光纤连接线，外径2.5 mm，纤芯960 µm，包层1000 µm，数值孔径0.63</td></tr><tr><td>带连接器LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>中心波长=465 nm，输出功率=45 mW（纤芯960 µm，数值孔径0.63）</td></tr><tr><td>LED驱动器</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>单通道LED驱动器，最大输出=1000 mA</td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>双阶段玻璃微电极拉制仪</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.5 mm，内径0.9 mm，长90.0 mm</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>抗生素软膏</td></tr><tr><td>Terramycin&amp;reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>土霉素</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2小鼠</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>微电极放大器</td></tr></tbody></table>

清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

神经科学领域的一个主要关注点是不同类型的神经元如何在神经回路中发挥作用。近年来光遗传学技术的进步使得研究人员能够鉴定神经元类型 体内 在广泛的脑区进行电生理实验时，光遗传学实验的关键在于将光有效传递到记录位点。然而，从脑表面将刺激光传递至深部脑区往往具有挑战性。尤其当脑表面光学透明度较低时——这在清醒动物记录中十分常见——刺激光更难到达深部脑区。本文介绍一种利用自制玻璃光刺激电极记录清醒小鼠神经元光诱导放电反应的方法。该方法通过记录用玻璃电极传导光，从而实现对深部脑区被记录神经元的可靠光刺激。此自制光刺激电极系统采用易获取且成本较低的材料，组装简便。

在图2中，我们考察了玻璃移液管尖端尺寸和长度对移液管尖端光功率的影响（图2A–B）。光功率通过放置在距尖端1 mm处的光功率计进行测量。当改变尖端尺寸时，移液管全长设定为50 ± 2 mm；当改变全长时，尖端尺寸设定为2.5 µm。玻璃移液管的杆部长度设定为8 mm。尖端的光功率范围为3–5 mW（均值 ± 标准差；图2A：3.77 ± 0.29 mW，n = 20；图2B：4.24 ± 0.31 mW，n = 21）。移液管的尖端尺寸（图2A）与光功率几乎无相关性（R = 0.1555）。移液管长度与光功率之间仅呈现微弱的负相关（R = -0.2054）。这些结果表明，移液管的尖端尺寸和长度对尖端光功率的影...

本研究介绍了一种使用定制玻璃光导电极在清醒小鼠中可靠地进行光遗传学单细胞记录的方法。

神经科学领域的一个主要关注点是不同类型的神经元如何在神经回路中发挥作用。光遗传学技术的最新进展使得……

该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如不同类型神经元的功能。该技术的主要优势在于，可以利用廉价且易得的材料，在活体动物中可靠地识别不同类型的神经元。我将与我们的技术员村本真司（Shinji Muramoto）以及本实验室的助理教授马兰兰（Lanlan Ma）共同演示该实验流程。开始此操作时，轻轻将用于压力控制的钢管从持针器的筒体中抽出。通过钻孔扩大持针器筒体上针座侧的孔。然后，将一根不锈钢管放入该孔中。接着，将一个用于直径为2.5毫米插芯的陶瓷分体对接套筒插入孔中。在L形兔头支架上钻一个孔，并用环氧粘合剂将电极 holder 的 barrel 部分固定到兔头支架上。随后，用螺丝将其固定至操纵器上。使用铣刀将柱状电路板间隔件加工成矩形块状，制备定制的头固定柱，并用锯片将其切割成两个头固定柱。然后，使用铣刀将头固定柱的底部修平。手术前，使用高压灭菌器对所有手术器械和一个头固定柱进行灭菌处理。用70%酒精清洁立体定位仪框架和加热垫。接着，麻醉小鼠并将其置于加热垫上的立体定位仪框架中。本实验使用一种转基因小鼠，其表达通道视紫红质-II的抑制性神经元。将牙齿放入咬杆的孔洞中，轻轻固定鼻夹。随后，使用耳杆固定头部两侧。当耳杆正确固定头部后，进一步拧紧鼻夹。将眼膏涂抹于眼睛。使用小剪刀修剪头部的毛发，并用浸有氯己定葡萄糖酸盐的棉签清洁头皮。然后沿中线切开头皮并将其拨至两侧。用浸有70%酒精的棉签去除骨膜，并让颅骨干燥。然后，将头固定装置连接到操纵器上。使用操纵器将头固定装置平放在颅骨上，位置围绕前囟。在冰箱中预冷的小培养皿中，加入四滴单体、一滴催化剂和一小勺聚合物，混合均匀。将牙科水泥涂抹在额骨和顶骨上，将头固定装置固定于颅骨。待牙科水泥硬化后，将小鼠从立体定位仪中取出。在暴露的皮肤上涂抹抗生素软膏，并注射美托咪啶拮抗剂与抗生素的混合物。然后将小鼠置于带有加热垫的笼子中直至其苏醒，并将其放回含有丰富化设施的饲养笼中。为了在目标脑区进行记录而实施开颅手术，需使用浸有氯己定葡萄糖酸盐和70%酒精的棉签清洁颅骨。使用牙科钻头仔细刮除记录位点上方的颅骨。当骨质足够薄时，用手术刀尖将其切开并移除。然后在暴露区域周围涂抹牙科水泥，以增强颅骨强度。待牙科水泥硬化后，用硅胶粘合剂覆盖暴露的脑区。然后将动物置于笼子中的加热垫上，直至其苏醒，并将其放回饲养笼中。在进行电生理记录之前，需让动物在开颅术后至少恢复一天。在进行电生理记录之前，使用电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成若干玻璃微电极。用10毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）填充微电极。在某些记录中，向10毫摩尔PBS中加入2%神经生物素。接下来，将动物放入记录室中。将一支装满液体的玻璃微量移液管连接到自制的光导探针固定装置上。将一根涂有氯化银的导线插入玻璃微量移液管中。随后，将引线连接至记录放大器的前置放大头级。接着，将带有氧化锆陶瓷插芯的光纤跳线连接到光探针固定器的分体式对接套筒上。推动跳线插入套筒，直至陶瓷插芯的末端与玻璃移液管的后端接触。补光线缆将来自LED的光传递至目标区域，该LED由单通道LED驱动器控制。随后，移除覆盖在颅骨开窗部位的硅胶粘合剂。在记录过程中，需定期将温热的生理盐水涂抹于脑表面，以防止脑表面干燥。如有必要，使用尖头镊子去除硬脑膜。此处记录的是清醒状态下的VGAT通道视紫红质-II小鼠下丘中的峰电位反应。在VGAT通道视紫红质-II小鼠的下丘中，GABA能神经元特异性表达通道视紫红质-II。在清醒小鼠中，当给予光刺激时，GABA能神经元和谷氨酸能神经元分别被兴奋或抑制。当光刺激通过玻璃电极传递时，会诱发某些神经元产生动作电位反应。相反，在其他神经元中，光刺激会抑制由声音刺激诱发的动作电位反应。这些结果表明，玻璃光敏电极能够记录到分离良好的单个神经元活动，并可通过光刺激可靠地激活所记录的神经元。该技术的发展为神经科学领域的研究人员探索不同类型神经元在大脑不同区域神经回路中的功能奠定了基础。

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用于光遗传学调控与神经电生理记录同步进行的光极阵列

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清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

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