基于交配的酵母超表达文库筛选

这种方法可以帮助回答神经退行性疾病领域的关键问题，例如哪些遗传因素和途径调节疾病相关蛋白的毒性。该技术的主要优点是酵母交配的高效过程用于针对大量文库基因筛选酵母模型。虽然这种方法可以深入了解神经退行性疾病蛋白的毒性，但它也可以应用于酵母中其他细胞过程的研究，例如对其他应激条件的耐受性。

通过从阵列质粒文库中每孔 5 μL 质粒 DNA 等分到圆底 96 孔板中来开始此过程。将板保持在 4 摄氏度。接下来，在 500 毫升培养瓶中接种 150 毫升酵母蛋白胨葡萄糖或 YPD 培养基，并接种单倍体酵母菌株 W303 Alpha 菌落。

将培养物在 30 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育过夜。第二天早上，在测量过夜培养物的 OD 600 后，在 2 升 YPD 中将培养物稀释至 0.1 的 OD 600。在 30 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育约 5 小时，直到培养物达到 0.4 至 0.6 的 OD600。

要收获酵母培养物，请装满 8 个无菌 250 毫升离心瓶，并在室温下以 3000 xG 离心 10 分钟。倒出上清液，不要破坏沉淀。按照文本方案中的说明洗涤酵母，并将细胞合并到两个离心管中。

每个细胞沉淀重悬于 25 mL 的 0.1 摩尔乙酸锂溶液中。合并重悬的细胞，加入 5 毫升鲑鱼精子 DNA，然后将它们转移到 150 毫升培养瓶中。在 30 摄氏度下孵育，以 225 rpm 的速度振荡 30 分钟。

30 分钟后，将细胞混合物倒入无菌一次性试剂储液槽中。使用多通道移液器，将 35 μL 细胞混合物转移到圆底 96 孔板的每个孔中，其中包含之前制备的文库质粒 DNA。以 1000 rpm 的速度涡旋 96 孔板 1 分钟。

将板在 30 摄氏度下孵育 30 分钟，不要摇晃。不要堆叠板，这样热量可以更有效地传递。从 30 摄氏度培养箱中取出 96 孔板，并以 1000 rpm 的速度混合 30 秒。

向每个孔中加入 125 μL 转化缓冲液，然后以 1000 rpm 的速度涡旋板 1 分钟。将板在 30 摄氏度下孵育 30 分钟。然后将板放入 42 摄氏度的培养箱中 15 分钟，对酵母进行热休克。

板以 3000 xG 离心 5 分钟。通过将板倒置在废液桶上并从板中强行倾倒缓冲液，从孔中取出转化缓冲液。用干净的纸巾快速吸干倒置的板，以去除板上的任何液体。

通过向每个孔中加入 200 μL 与文库质粒上的选择标记相对应的最小缺失培养基来冲洗细胞。这里使用合成的 ura minus 培养基。将板以 3000 xG 离心 5 分钟。

如前所述，去除垃圾桶上的上清液。向每个孔中加入 160 微升含 2% 葡萄糖的最小 ura minus 培养基，并以 1000 rpm 的速度涡旋板 1 分钟。将板在 30 摄氏度下孵育 48 小时，不要摇晃。

48 小时后，每个孔的底部应可见一团转化的酵母。使用液体分配器，将 100 微升含有葡萄糖的 ura minus 培养基加入一组新的 96 孔板的每个孔中。以 1000 rpm 的速度涡旋含有转化酵母的板 30 秒。

使用无菌塑料 96 针复制器，将针放入含有转化酵母的孔中，然后将它们接种到装满培养基的新板的相应孔中。将新板在 30 摄氏度下孵育 24 小时。24 小时后，在每个含有成功转化酵母的孔的底部应可以看到一个酵母颗粒。

为了将这些酵母菌株保存为甘油原液，向每个孔中加入 50 微升 50% 甘油，以 1000 rpm 的速度涡旋板 30 秒，用铝箔密封板，并在零下 80 摄氏度下冷冻。要从甘油原液中恢复文库菌株，请将 96 孔板从零下 80 摄氏度的冰箱中取出，去除铝箔，让酵母在室温下解冻约 30 分钟。酵母解冻后，使用无菌塑料 96 针复制器将甘油原液接种到 96 孔板中 160 微升含有 2% 葡萄糖的新鲜 ura minus 培养基中，并在 30 摄氏度下孵育 24 小时。

使用文库菌株后，立即密封板，并将其放回零下 80 摄氏度的冰箱中。在文库菌株解冻的同一天，将查询酵母菌株接种在 50 毫升 YPD 中，并在 30 摄氏度下以 250 rpm 振荡生长过夜。第二天早上，将查询酵母菌株倒入无菌一次性试剂储液槽中，并将 160 微升查询菌株分装到 96 孔板的每个孔中。

使用液体分配器，将每孔 160 μL 的 YPD 培养基分配到 96 孔板中。短暂涡旋包含查询菌株和文库菌株板的 96 孔板，然后使用无菌 96 针复制器将文库菌株转移到接种了查询菌株的 YPD 板上。将 YPD 板在 30 摄氏度下孵育 24 小时。

24 小时后，每个孔的底部都会看到一个酵母颗粒。用含有 2% 棉子糖的最小 droupout 培养基填充 96 孔板，对应于查询菌株中质粒以及文库质粒上的选择标记。使用无菌 96 针复制器将酵母从 YPD 交配培养物转移到选择性培养基中。

将 96 孔板在 30 摄氏度下孵育 48 小时。只有具有交配并形成二倍体细胞并因此同时包含查询质粒和文库质粒的酵母细胞才能在该培养基中生长。在含有棉子糖的选择性培养基中生长 48 小时后，观察到在含有二倍体细胞的孔底部可以看到沉淀。

以 1000 rpm 的速度涡旋 96 孔板 1 分钟。使用机器人点样机将琼脂平板上的酵母点样，一式四份到含有 2% 半乳糖和 2% 琼脂的 ura-his-droupout 板，以及含有 2% 葡萄糖和 2% 琼脂的 ura-his-droupout 板。点样后，让琼脂板干燥，然后将它们倒置在 30 摄氏度的培养箱中四天。

每 24 小时对琼脂平板进行拍照以记录酵母的生长。首先在二倍体酵母中检测 ALS 相关蛋白 FUS 的毒性。如含有诱导 FUS 的半乳糖的琼脂平板所示，FUS 毒性在二倍体酵母和单倍体酵母中是一致的。

通过交配方法测试了先前从基于转化的方法中鉴定为 FUS 毒性抑制因子的 5 个基因。泳道 1 是用两个空载体转化的对照酵母菌株。泳道 2 是具有空载体的二倍体 FUS 酵母菌株，其中 FUS 的表达毒性很大。

泳道 3 到 7 显示表达 FUS 的二倍体酵母以及抑制基因。所有 5 个基因都挽救了二倍体酵母中 FUS 的毒性，表明交配方法是有效的。然后将这种基于交配的方法应用于 940 个基因的过表达文库筛选。

并显示了一个代表性板的照片。如半乳糖板上所示，FUS 和文库基因表达的地方，FUS 对二倍体酵母细胞具有毒性。由绿色方块表示的文库基因挽救了 FUS 毒性。

而文库基因，由红色方块表示，毒性增强。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 120 小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住事先检查用于筛选的表型是否不依赖于单倍体交配类型。

看完这个视频后，你应该对如何识别过表达的遗传因素有一个很好的了解，这些遗传因子可以挽救酵母中疾病相关蛋白的毒性。开发后，该技术可以为神经退行性疾病领域的研究人员铺平道路，以探索酵母模型中疾病相关蛋白的细胞毒性机制。按照此程序，可以进行其他方法，例如 β 半乳糖苷酶测定，以回答其他问题，例如救援是否具有特异性。