Name: 基于交配的酵母超表达文库筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学习基于酵母交配的高效超表达文库筛选方法，用于研究神经退行性疾病相关蛋白毒性机制。该技术可快速筛选大量基因，揭示调控疾病蛋白毒性的遗传因子，为神经退行性疾病研究提供重要工具。

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我们感谢朱实验室和钟实验室成员的深入讨论，以及来自莱特州立大学的经费支持。

注意：此处描述的方案适用于筛选包含在十个96孔板中的文库质粒，但可根据需要相应扩大或缩小规模。为完成整个文库的筛选，该方案需要重复进行。通常情况下，每次筛选10块板的文库基因可由1人轻松完成。
1. 96孔酵母转化的准备工作
注意：此步骤按先前所述方法进行7,10。
<ol>
	<li>从阵列式质粒文库中，将每份 5 µL（约 50–100 ng）质粒 DNA 分装至圆底 96 孔板的各个孔中。 
	注意：此类文库的一个示例是酵母基因过表达文库10。</li>
	<li>在 500 mL 三角瓶中加入 150 mL 酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基，并接种单个单倍体酵母菌株 W303α 的菌落（直径 2–3 mm）。在 30 °C 条件下振荡培养（200 rpm）过夜。</li>
	<li>次日早晨，测定过夜培养物的 OD600，并将酵母培养物用 YPD 培养基稀释至 OD600 = 0.1（总体积最多可达 2 L）。在 30 °C 条件下振荡（200 rpm）培养约 5 小时，直至培养物 OD600 达到 0.4–0.6。</li>
</ol>
2. 酵母转化
<ol>
	<li>通过将8个无菌的250 mL离心瓶装满酵母培养物，并在室温下以3,000 × g离心10分钟来收获酵母。倾去上清液，注意不要扰动沉淀。 
	注意：所有离心步骤均需在室温下进行。</li>
	<li>用无菌蒸馏H2O洗涤酵母。向每个离心瓶中加入100 mL无菌H2O，涡旋振荡以重悬细胞沉淀。将洗涤后的细胞合并至2个离心瓶中，在3,000 × g下离心5分钟，然后倾去上清液。</li>
	<li>用100 mL的0.1 M LiOAc/1×TE（100 mM LiOAc；10 mM Tris，pH 8.0；1 mM EDTA）洗涤每个离心瓶中的细胞，并在3,000 × g下离心5分钟。倾去上清液。</li>
	<li>在离心的同时，使用金属浴将5 mL鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）在100 °C下煮沸3分钟，随后置于冰上冷却。</li>
	<li>将每个离心瓶中的细胞沉淀重悬于25 mL的0.1 M LiOAc/1×TE中，合并重悬的细胞并转移至一个150 mL的锥形瓶中。加入5 mL预冷的鲑鱼精子DNA，在30 °C下以225 rpm振荡培养30分钟。</li>
	<li>将细胞混合液倒入无菌一次性试剂储液槽中，使用多通道移液器将35 µL细胞混合液转移至含有文库质粒DNA的圆底96孔板的每个孔中。使用板式涡旋振荡器以1,000 rpm涡旋振荡96孔板1分钟。将板在30 °C下静置孵育30分钟。 
	注意：不要叠放板，以利于热量有效传递。我们发现以1,000 rpm涡旋振荡96孔板不会导致液体溢出，但在执行该步骤前应先测试安全的涡旋速度。</li>
	<li>在锥形瓶中配制200 mL转化缓冲液，终浓度为40% PEG3350、10% DMSO和0.1 M LiOAc。转化缓冲液需在使用前立即配制，并通过振荡充分混匀。</li>
	<li>从30 °C培养箱中取出96孔板，使用板式涡旋振荡器以1,000 rpm混匀30秒。向每孔中加入125 µL转化缓冲液，然后以1,000 rpm涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>将板在30 °C下孵育30分钟，随后通过将板放入42 °C培养箱中15分钟进行热激。 
	注意：不要叠放板。</li>
	<li>以3,000 × g离心5分钟。将板倒置在废液桶上方，用力倾倒去除转化缓冲液。将倒置的板迅速在干净的纸巾上轻拍，以去除板顶部残留的液体。</li>
	<li>向板中每孔加入200 µL与文库质粒上筛选标记相对应的最小缺陷培养基，以洗涤细胞。 
	注意：我们使用了合成的Ura-培养基。</li>
	<li>以3,000 × g离心5分钟，并参照步骤2.10的方法在废液桶上方倾去上清液。</li>
	<li>向每孔中加入160 µL含2%葡萄糖的最小Ura培养基。以1,000 rpm涡旋振荡1分钟，并在30 °C下静置培养48小时。48小时后，可见每个孔底部出现转化酵母的沉淀。</li>
	<li>使用液体分配器，向一组新的96孔板的每孔中加入100 µL含葡萄糖的Ura培养基。</li>
	<li>将含有转化酵母的板（来自步骤2.13）以1,000 rpm涡旋振荡30秒。使用无菌塑料96针复制器，将针插入含有转化酵母的孔中，然后接种至装有培养基的新板的对应孔中。将新板在30 °C下培养24小时。 
	注意：若处理10块板，也可使用多通道移液器手动添加培养基。</li>
	<li>24小时后，成功转化的酵母孔底部应可见沉淀。为将这些酵母菌株保存为甘油菌种，向每孔中加入50 µL 50%甘油，以1,000 rpm涡旋振荡30秒，用封板膜密封板后于-80 °C冷冻保存。 
	注意：上述步骤仅需执行一次。未来使用相同文库一次性试剂储液槽对不同酵母模型进行筛选时，可直接从甘油菌种开始，并立即进入以下步骤。</li>
</ol>
3. 含文库基因的细胞与查询酵母的杂交
<ol>
	<li>从-80 °C冰箱中取出含有酵母菌株的96孔板，移除密封膜，于室温下解冻约30分钟，以复苏文库菌株。</li>
	<li>酵母解冻后，使用无菌的96针塑料复制器将甘油菌种接种至96孔板中含2%葡萄糖的160 µL新鲜Ura培养基中，于30 °C培养24小时。文库菌株使用完毕后，立即用封板膜密封培养板，并放回-80 °C冰箱保存。</li>
	<li>同一天解冻文库菌株（W303α）时，将待测酵母菌株（此处为W303a中的FUS）接种至50 mL YPD培养基中，于30 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，将待测酵母菌株倒入无菌一次性试剂储液槽中，使用多通道移液器将待测菌株各160 µL分装至96孔板的每个孔中。</li>
	<li>使用液体分液器，将160 µL YPD培养基加入十个96孔板的每个孔中。后续将使用这些孔板进行待测酵母菌株与文库酵母菌株的交配。</li>
	<li>轻轻涡旋含有待测菌株的96孔板，然后使用无菌96针复制器将待测菌株转移至YPD平板。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀文库菌株板，然后针对每块文库菌株板，使用新的无菌96针复制器将文库菌株转移至已接种查询菌株的YPD平板上。 
	注意：甘油中的细胞在多次冻融循环后会丧失活力。应尽快将文库菌株放回长期保存环境（-80 °C 冰箱），以保持文库的良好质量，确保未来可正常使用。若妥善维护，甘油保存液至少可冻融10次。我们还强烈建议保留一份工作副本和若干备份副本。当工作储备液失效时，应立即从备份副本中制备新的工作副本。</li>
	<li>在30 °C下孵育YPD平板24小时。注意，24小时后每个孔底部将可见酵母沉淀。</li>
	<li>用含有2%棉子糖的最小脱落培养基（minimal dropout medium）填充96孔板，该培养基应含有与查询菌株质粒以及文库质粒上的选择标记相对应的营养成分（例如，此处为Ura-His-。</li>
	<li>使用无菌的96针复制器将酵母从YPD交配培养物转移至选择性培养基中。将96孔板在30 °C下孵育48小时；只有完成交配并形成二倍体细胞的酵母（因此同时含有查询质粒和文库质粒）才能在此培养基中生长。孵育2天后，观察可见各孔底部出现菌体沉淀。</li>
</ol>
4. 斑点实验
<ol>
	<li>在含棉子糖的选择性培养基中培养48小时后，将酵母点种到琼脂平板上。
	<ol>
		<li>准备两组含2%琼脂的尿嘧啶-组氨酸缺陷型培养基平板，使用透明聚苯乙烯平板，一组添加2%半乳糖，另一组添加2%葡萄糖。</li>
		<li>将96孔板在1,000 rpm条件下涡旋震荡1分钟，然后使用机器人点样仪将酵母分别点样至含有2%半乳糖和2%琼脂的Ura-His-缺失培养基平板（FUS和文库基因被诱导表达）以及含有2%葡萄糖和2%琼脂的Ura-His-缺失培养基平板（FUS和文库基因被抑制表达），每个孔中的培养物在琼脂平板上以四重复形式点样即，将1个孔中的培养物在琼脂平板上划分为4个区域。</li>
		<li>点样后，将琼脂平板静置干燥，然后倒置于30 °C培养箱中。每隔24小时拍摄琼脂平板照片，记录酵母生长加快或增多（表明查询菌株的毒性被挽救）或生长减慢或减少（表明查询菌株的毒性被加剧）的情况。培养平板4天。 
		注意：每个孔中的培养物均可按1比1比例点种于琼脂平板上，如先前基于转化的方法所示10然而，此处的1对4点样（可方便地使用机器人点样仪设置）通过减少假阳性数量显著提高了检测的稳健性。只有当来自同一孔的4个菌落均表现出相似表型时，才被视为阳性结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
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<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
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<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
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<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
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<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种利用酵母交配将质粒文库导入酵母模型中，从而在酵母中进行质粒过表达筛选的实验方案。通过该方法，可使用同一组携带质粒文库的酵母，对多种神经退行性疾病相关毒性蛋白的酵母模型进行筛选。繁琐的转化过程仅需进行一次，之后通过高效的酵母交配将质粒文库导入待测菌株。本方案依赖于机器人设备来分配培养基并将酵母培养物点样至琼脂平板上。尽管该方案可在无&#160;机器人设备的条件下完成，但将更加耗时。该方法已成功用于筛选能够修饰FUS毒性作用的基因。
我们观察到&#160;FUS 在二倍体酵母背景下毒性略低。这很可能归因于&#160;基因拷贝数以及二倍体酵母在&#160;生长速率上的差异。除非所研究的表型与&#160;交配型或倍性相关，否则毒性引起的生长表型在单倍体和二倍体酵母中具有一致性。因此，基于交配的方法预期可在具有多种生长表型的多种酵母模型中广泛应用。尽管如此，在使用该筛选方法之前，应先验证酵母模型的表型，以确保其在二倍体背景下仍然存在。该方法可用于研究酵母中的多种不同表型，不仅限于神经退行性疾病相关蛋白毒性的研究。此外，任何包含酵母表达载体的质粒文库均可用于此方法。
<p ...

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae在基础科学研究中被广泛用于理解与人类疾病直接相关的细胞过程1。此外，它还被用作研究与人类疾病相关蛋白的模式生物，例如与最常见的神经退行性疾病相关的蛋白，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）2。酵母模型的一个优势在于能够简便地进行全基因组筛选，以鉴定与疾病相关蛋白毒性有关的细胞通路，从而揭示其毒性的机制。其中一种筛选方法称为过表达文库筛选，在&#160;该方法中，将包含5,500个酵母基因的阵列文库中的每个基因逐一转化至酵母模型中，以鉴定哪些基因在过表达时能够改变毒性表型。该筛选方法已成功应用于多种与神经退行性疾病相关蛋白的酵母模型，包括亨廷顿病相关的亨廷顿蛋白3、帕金森病相关的α-突触核蛋白4,5、阿尔茨海默病相关的Aβ蛋白6，以及ALS相关的FUS和TDP-43蛋白7,8,9。尽管该筛选通常以高通量方式进行10，但其中最耗时费力的步骤是将阵列文库中的5,500个酵母基因逐一进行转化。每次重复筛选实验时，以及每当需要研究新建立的酵母模型时，都必须执行这一操作。因此，寻找一种更高效的方法来完成这一任务至关重要。
酵母细胞可以稳定地以单倍体和二倍体形式存在。单倍体细胞具有两种相反的交配型，即交配型a和α。每种交配型的单倍体细胞会合成并分泌各自特异的交配信息素，且仅被相反交配型的细胞所响应。这使得a型与α型细胞之间能够发生交配，形成稳定的二倍体细胞a/α。该过程为自发进行，且效率极高11我们可以利用这种生物独特的生命周期 S. cerevisiae 以引入阵列式质粒文库。更具体而言，阵列式质粒文库中的每个基因将被转化至一种交配型的单倍体细胞中， 即，α细胞。含有文库基因的这些细胞将以阵列式96孔板形式保存于甘油冻存液中。对于每个需要筛选的酵母模型，可从甘油冻存液中复苏含有文库基因的酵母细胞，并通过以下方法进行筛选&#160;与目标酵母模型相反交配型的酵母进行交配， 即，交配型a。利用交配将两个基因导入酵母的思想并非新颖，该方法已成功应用于高通量酵母双杂交筛选，其中诱饵载体（即，通过与阵列文库中的猎物构建体进行交配，使一种交配类型的Gal4-DNA结合域融合蛋白与另一种交配类型的猎物构建体结合12然而，这一策略从未被应用于&#160;过表达文库筛选，该方法一直采用传统的转化技术。
本实验室先前建立了与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关蛋白FUS的酵母模型7。通过使用转化方法进行过表达文库筛选，我们发现&#160;五个酵母基因（ECM32, NAM8, SBP1, SKO1 和 VHR1）在过表达时能够缓解FUS的毒性。这些结果已被另一研究团队的类似研究独立证实8。ECM32 的人类同源基因 hUPF1 后来也被证明可在原代神经元细胞13&#160;以及ALS动物模型14中抑制FUS的毒性。以这五个基因为原理验证，我们展示了当通过酵母交配方式将这五个基因引入FUS酵母模型时，它们均能同样地缓解FUS的毒性。由于含有文库基因的酵母细胞可永久保存于甘油菌种中，并可在需要时随时复苏，这种基于交配的方法将省去每次筛选文库时繁琐的转化步骤。由于交配效率高，且无需质粒转化，该策略还显著降低了大规模质粒文库纯化与转化相关的成本。我们将成功应用此方法对FUS酵母模型进行文库筛选。
基于交配的筛选流程简要描述于图1中。首先，使用高通量酵母转化方法将阵列式质粒文库转化至交配型为α的单倍体酵母菌株中，每个96孔板的孔中均含有携带特定文库质粒的酵母。该转化后的酵母集合被保存为甘油菌种，可在后续实验中解冻并复苏使用。所研究的酵母模型（在&#160;本例中为FUS毒性）需构建于具有相反交配型（交配型a）的单倍体酵母菌株中。使用无菌的96针复制器，以高通量方式将FUS菌株和携带质粒文库的酵母菌株转移至含有丰富培养基的96孔板中，使其进行交配。交&#160;配后，将每孔交配培养物中的少量液体转移至含有合成缺失培养基的96孔板中，在该培养基中仅有同时携带FUS基因和文库基因的二倍体酵母能够生长。随后使用机器人点样仪将各孔中的酵母培养物点样到琼脂平板上，以诱导FUS基因和文库基因的表达。&#160;此外，还将酵母培养物点样&#160;至对照琼脂平板，其中FUS基因和文库基因不被诱导表达。在&#160;琼脂平板上培养&#160;后，可鉴定出能够缓解或加重FUS毒性的基因。

<table><tbody><tr><td>鲑鱼精DNA（SS-DNA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD液体培养基</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>颗粒状琼脂</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-半乳糖</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-棉子糖五水合物</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>合成尿嘧啶缺陷型培养基（Synthetic Ura- drop out medium）</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>酵母氨基酸缺陷补充剂 -组氨酸/-尿嘧啶</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>无水乙酸锂</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇3350（PEG-3350）</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96针复制器&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray培养盘</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96孔圆底带盖检测板</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>未经处理，无菌</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300 μL体积</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp数字干浴器/金属浴加热模块</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R离心机</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI离心机</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX多功能分液器</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>转子HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于交配的酵母过表达文库筛选

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

芽殖酵母已被广泛用作研究与人类疾病相关蛋白的模型。全基因组遗传筛选是酵母研究中常用的有力工具。在酵母中表达多种与神经退行性疾病相关的蛋白会导致细胞毒性及聚集体形成，重现了在患有这些疾病的患者中观察到的现象。本文描述了一种用于筛选肌萎缩侧索硬化症相关蛋白FUS毒性调节因子的酵母模型筛选方法。该新筛选平台不采用转化方法，而是依赖酵母交配将阵列化的质粒文库引入酵母模型中。交配法具有两个明显优势：第一，效率高；第二，预先转化的阵列化质粒文库可长期以甘油保存液形式储存，并可快速应用于其他筛选，无需每次都将文库转化至酵母模型，避免了繁琐耗时的转化步骤。我们展示了该方法如何成功用于筛选能够修饰FUS毒性的基因。

与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的蛋白FUS是一种RNA/DNA结合蛋白，此前已在单倍体酵母中进行过研究7,8。利用基于转化的方法进行遗传筛选，发现了若干能够抑制FUS毒性的酵母基因。其中一种酵母基因的人类同源基因随后被证明可在原代神经元细胞及ALS大鼠模型中有效抑制毒性13。本文中，我们采用相同的酵母模型，证明通过接合方式可与转化法同样高效地进行过表达文库筛选。
FUS 对单倍体和二倍体酵母细胞均有毒性 
先前的FUS酵母模型及后续的过表达文库筛选是在单倍体细胞背景下进行的。为了使基于交配的方法能够成功，需要在二倍体酵母中验证FUS的毒性。为此，我们将w303a（交配型a）中的FUS酵母模型与w303&#945; 用空载体转化（交配型 &#94...

本文介绍了一种基于交配的方法，利用阵列式质粒文库促进芽殖酵母中的过表达筛选。

芽殖酵母已被广泛用作研究与人类疾病相关蛋白的模式生物。全基因组遗传筛选是一种强大的工具……

该方法有助于解答神经退行性疾病领域中的关键问题，例如哪些遗传因素和通路调控与疾病相关蛋白的毒性。该技术的主要优势在于利用酵母交配的高效过程，对大量文库基因构建的酵母模型进行筛选。尽管该方法可用于研究神经退行性疾病相关蛋白的毒性，也可应用于酵母中其他细胞过程的研究，例如对其他应激条件的耐受性。首先，从阵列式质粒文库中将质粒DNA按每孔5 µL分装至96孔圆底板中，并将该板置于4 °C保存。接着，在500 mL三角瓶中加入150 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基，并接种单个单倍体酵母菌株W303 Alpha的菌落。将培养物在30摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。次日早晨，测定过夜培养物的OD600后，将培养物稀释至OD600为0.1，总体积为两升YPD培养基。在30摄氏度、200 rpm振荡条件下继续培养约五小时，直至培养物的OD600达到0.4至0.6。为收获酵母培养物，请将八个无菌的250毫升离心瓶装满，并在室温下以3000 ×g离心10分钟。倾去上清液，注意不要扰动沉淀。按照文本方案中所述方法洗涤酵母，并将细胞合并至两个离心管中。将每份细胞沉淀重悬于25毫升0.1摩尔的醋酸锂溶液中。混合重悬的细胞，加入5毫升鲑鱼精子DNA，转移至150毫升锥形瓶中。在30摄氏度、225转/分钟振荡条件下孵育30分钟。30 分钟后，将细胞混合物倒入无菌一次性试剂储液槽中。使用多通道移液器，将 35 µL 细胞混合物转移至含有先前制备的文库质粒 DNA 的 96 孔圆底培养板的每个孔中。以 1000 rpm 涡旋振荡 96 孔板 1 分钟。将培养板置于30摄氏度条件下静置孵育30分钟。切勿叠放培养板，以利于热量更高效传递。从30摄氏度培养箱中取出96孔板，以1000 rpm速度振荡混匀30秒。向每个孔中加入125微升转化缓冲液，然后以1000 rpm的速度涡旋振荡平板1分钟。将平板在30摄氏度下孵育30分钟。随后通过将平板置于42摄氏度的培养箱中15分钟对酵母进行热激处理。将培养板在3000 ×g条件下离心5分钟。将培养板倒置在废液桶上方，用力倾倒以去除孔中的转化缓冲液。将倒置的培养板迅速在干净的纸巾上轻拍，以去除板表面残留的液体。用与文库质粒上筛选标记相对应的200微升基本缺失培养基冲洗各孔细胞，此处使用合成尿嘧啶缺失培养基。以3000 ×g离心平板5分钟。将上清液弃入废液桶中，操作方法如前所述。向每个孔中加入160 µL含有2%葡萄糖的尿嘧啶缺陷基本培养基，并以1000 rpm涡旋振荡平板1分钟。将平板置于30 °C条件下静置培养48小时。48 小时后，每个孔底部应可见转化酵母的沉淀。使用液体分配器，向一组新的 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 含葡萄糖的尿嘧啶缺陷培养基。将含有转化酵母的板在 1000 rpm 条件下涡旋振荡 30 秒。使用无菌的96针塑料复制器，将针插入含有转化后酵母的孔中，然后将其接种到装有培养基的新培养板的相应孔中。将新培养板在30°C下孵育24小时。24小时后，每个成功转化的酵母孔底部应可见酵母沉淀。为将这些酵母菌株保存为甘油菌种，向每个孔中加入 50 微升 50% 甘油，以 1000 转/分钟涡旋振荡 30 秒，用铝箔密封培养板，并在 -80 摄氏度下冷冻保存。为从甘油菌种中复苏文库菌株，将 96 孔板从 -80 摄氏度冰箱中取出，移除铝箔，让酵母在室温下解冻约 30 分钟。酵母完全解冻后，使用无菌的 96 针塑料复制器将甘油菌种接种至另一块 96 孔板中含 2% 葡萄糖的 160 微升新鲜尿嘧啶缺陷型培养基（ura minus media）中，并在 30 摄氏度下培养 24 小时。使用文库菌株后，立即密封培养板，并将其放回负80摄氏度冰箱中。在解冻文库菌株的当天，将待测酵母菌株接种于50毫升YPD培养基中，于30摄氏度、250 rpm振荡条件下过夜培养。次日早晨，将待测酵母菌株倒入无菌一次性试剂储液槽中，并向96孔板的每个孔中分装160微升待测菌液。使用液体分配器，将YPD培养基以每孔160 µL的量加入96孔板中。轻轻涡旋混匀含有查询菌株和文库菌株的96孔板，然后使用无菌的96针复制器，将文库菌株转移至已接种查询菌株的YPD平板上。将YPD平板在30 °C条件下孵育24小时。24 小时后，每个孔底部将可见酵母沉淀。用含有 2% 棉子糖的最小dropout培养基填充96孔板，该培养基应含有与查询菌株质粒以及文库质粒上的选择标记相对应的选择性标记。使用无菌的96针复制器将酵母从YPD交配培养物转移到选择性培养基中。将96孔板在30摄氏度下孵育48小时。只有发生交配并形成二倍体细胞、因而同时含有诱饵质粒和文库质粒的酵母细胞才能在此培养基中生长。在含棉子糖的选择性培养基中培养48小时后，可观察到含有二倍体细胞的孔底部出现可见的沉淀。将96孔板在1000 rpm下涡旋震荡1分钟。使用机器人点样仪将酵母以四重复的方式点样到含有2%半乳糖和2%琼脂的ura-his-缺失培养基平板上，以及含有2%葡萄糖和2%琼脂的ura-his-缺失培养基平板上。点样后，让琼脂平板干燥，然后倒置放入30°C培养箱中培养四天。每24小时拍摄一次琼脂平板照片，以记录酵母的生长情况。首先在二倍体酵母中检测了与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的蛋白FUS的毒性。如含有可诱导FUS表达的半乳糖的琼脂平板所示，FUS的毒性在二倍体和单倍体酵母中均表现一致。通过交配法检测了先前利用基于转化的方法鉴定出的五个抑制FUS毒性的基因。第一泳道为携带两个空载体的对照酵母菌株。第二泳道为携带空载体的二倍体FUS酵母菌株，其中FUS的表达具有很强的毒性。第3至第7泳道显示表达FUS以及一种抑制基因的二倍体酵母。这五个基因均能挽救FUS在二倍体酵母中的毒性，表明交配方法是有效的。随后，该基于交配的方法被应用于包含940个基因的过表达文库筛选。展示了一块代表性平板的照片。如半乳糖平板所示，在表达 FUS 和文库基因的条件下，FUS 对二倍体酵母细胞具有毒性。由绿色方块标示的文库基因能够挽救 FUS 的毒性。尽管文库基因（以红色方块表示）增强了毒性。一旦掌握，该技术可在120小时内完成，前提是操作正确。在进行该实验时，重要的是要提前确认用于筛选的表型不依赖于单倍体交配型。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定在酵母中过表达时可缓解疾病相关蛋白毒性的遗传因子。该技术建立后，可为神经退行性疾病领域的研究人员探索疾病相关蛋白在酵母模型中的细胞毒性机制提供新的途径。在完成本实验步骤后，还可进一步开展其他方法，例如β-半乳糖苷酶活性检测，以回答更多问题，如该缓解效应是否具有特异性。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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基于交配的酵母过表达文库筛选

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