从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

该方法可能对研究骨髓细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）生成与功能的血液学和免疫学研究人员有所帮助。该技术的主要优势在于，与以往策略相比，它能够更精确地鉴定骨髓祖细胞亚群。为了通过磁性激活细胞分选（MACS）富集骨髓中的祖细胞，需将细胞离心后形成沉淀，并将沉淀重悬于每1×10⁷个骨髓细胞40 µL的MACS染色缓冲液中。

为了去除已分化的谱系阳性细胞，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 µL 生物素标记的抗体混合液，用移液器混匀，于 4°C 孵育 10 分钟。孵育结束后，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 30 µL 染色缓冲液并混匀，随后每 1 × 10⁷ 个细胞加入 20 µL 抗生物素磁珠。在 4°C 孵育 15 分钟后，每 1 × 10⁷ 个细胞用 1 mL 染色缓冲液洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 500 µL 新鲜染色缓冲液中，最多可处理 1 × 10⁸ 个细胞。

接下来，根据制造商的说明设置自动磁力分离器，并将标记细胞的离心管放入分离器中。启动阴性筛选程序，收集含有祖细胞富集的谱系阴性细胞的阴性组分。通过离心沉淀谱系阴性细胞，并将沉淀（现呈白色）按每只小鼠2毫升的量重悬于染色缓冲液中，用于计数。

为了通过流式细胞术分选分离髓系祖细胞，将1 × 10⁵个阴性谱系细胞分别加入八个对照用微量离心管中，用于电压选择和颜色补偿；将剩余的细胞样品加入第九个微量离心管中，用于与七种目标表面标志物抗体同时孵育，以鉴定并分选祖细胞。通过离心使细胞成团，将各对照管中的细胞沉淀重悬于100 µL FACS染色缓冲液中，实验样品管中的细胞沉淀则按每5 × 10⁶个细胞加入100 µL染色缓冲液的比例重悬。接下来，在Fcγ受体单染管和样品管中加入抗-CD16/CD32抗体。

轻轻涡旋混匀，并在4°C下孵育样品10分钟。孵育结束后，将其他抗体分别加入相应的单染对照管和样品管中，轻轻涡旋混匀后，在4°C下孵育15分钟。孵育结束后，向对照管中加入900 µL染色缓冲液，向样品管中每1×10⁷个细胞加入1 mL染色缓冲液，随后进行离心。

将对照组沉淀物每管用 200 微升新鲜染色缓冲液重悬，实验组沉淀物按每 2.5 × 10⁷ 个细胞用 500 微升染色缓冲液重悬，并将标记后的细胞转移至相应的 5 毫升 FACS 管中。随后根据标准操作程序设置流式细胞仪，使用未染色和单染对照样品调节电压和荧光补偿。为鉴定并分选髓系祖细胞，将实验组细胞样品上机，绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图，设门以排除碎片和死亡细胞。

创建活细胞的前向散射高度对前向散射宽度图，并设门以排除双联体。对前向散射单细胞重复此过程，创建侧向散射高度对侧向散射宽度图，并设门以排除双联体。创建Sca-1对c-Kit图，并设门以选择c-Kit阳性而Sca-1阴性的前体细胞。

然后创建 CD-34 与 FC γ 受体的散点图，并设门以选择混合型共同髓系祖细胞和混合型粒细胞-单核细胞祖细胞群体。准确设门圈选混合型共同髓系祖细胞及混合型粒细胞-单核细胞祖细胞群体至关重要。使用伪彩色密度图或等高线图有助于更精确地设门。

利用混合的共同髓系祖细胞门控中的细胞，绘制 CD115 与 Flt3 的散点图并设门，以分选出共同髓系祖细胞中 Flt3 阳性 CD115 低表达细胞、共同髓系祖细胞中 Flt3 阴性 CD115 低表达细胞，以及 Flt3 阳性 CD115 高表达的单核细胞-树突状细胞前体细胞。利用混合的粒细胞-单核细胞祖细胞门控中的细胞，绘制 Ly6C 与 FC γ 受体的散点图并设门，以分选出 Ly6C 阴性细胞和 Ly6C 阳性细胞。随后，针对每一种分选后的混合粒细胞-单核细胞祖细胞亚群，分别绘制 CD115 与 Flt3 的散点图，并设门分选 Ly6C 阴性 Flt3 阴性 CD115 低表达的粒细胞-单核细胞祖细胞、Ly6C 阳性 Flt3 阴性 CD115 低表达的粒细胞祖细胞，以及 Ly6C 阳性 Flt3 阴性 CD115 高表达的单核细胞祖细胞。

Max谱系耗竭法在去除分化细胞以及富集c-Kit阳性前体细胞方面具有较高效率。谱系阴性组分中仍含有少量c-Kit阴性细胞，但这些细胞将在后续的流式细胞术设门步骤中被清除。经过FACS分选后，前体细胞的得率可能因分选仪设置不同而有所差异，但通常每只小鼠每个组分可获得1×10⁴至4×10⁴个细胞，分选后各组分纯度应高于95%。

良好的染色对于细胞群体的清晰分离至关重要。可能需要对抗体进行滴定或选择不同的荧光染料，以确保最佳的分离效果。本方案可用于鉴定祖细胞，以评估样本间骨髓组成的差异，分离祖细胞用于分子分析，或评估其生成髓系细胞的能力。