Name: 小鼠骨髓 Oligopotent 和世系髓样祖细胞的鉴定与分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学习使用磁激活细胞分选和荧光激活细胞分选技术，从小鼠骨髓中鉴定和分离六种髓系祖细胞亚群。该方法适用于体外培养、RNA和蛋白质分析等多种下游应用，有助于血液学和免疫学研究。

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本方案的开发得到了西达赛奈医学中心理事会再生医学研究所（资助对象：HSG）、美国免疫学家协会免疫学职业奖学金（资助对象：AY 和 HSG）以及美国血液学会学者奖（资助对象：AY）的资金支持。我们感谢西达赛奈医学中心流式细胞术核心实验室在FACS分选方面的协助。

本文所述所有方法均经西达斯-西奈医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 小鼠骨髓的分离及单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>根据机构指南对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>将安乐死的小鼠仰卧放置，并用70%乙醇（EtOH）喷洒。使用锋利的尖头剪刀在每侧后肢踝关节水平处做一个3–5 mm的小切口，将皮肤向上朝向身体方向撕下，以去除腿部皮肤，暴露肌肉和骨骼。</li>
	<li>去除肌肉（股四头肌、腘绳肌， 等等。用剪刀沿骨骼方向修剪，从骨骼上分离组织，注意不要损伤骨骼。</li>
	<li>将股骨从髋关节处脱臼，切除结缔组织和肌肉以分离下肢，注意避免切割到骨骼。</li>
	<li>通过将踝关节从胫骨脱位来去除足部，将骨骼放入含有无菌PBS或培养基的离心管中，并置于冰上运送到组织培养室。 
	注意：对于某些其他应用（例如， 从总骨髓细胞中分离巨噬细胞时，可将骨骼暂时置于冰上；但在分离祖细胞时，应尽快操作，以避免重要表面标志物（尤其是CD115）的下调。</li>
	<li>在生物安全柜中，用纸巾擦拭骨骼以去除残留的软组织。 
	注意：如果细胞培养需要无菌样品，则应在生物安全柜中进行该实验方案。 体内 FACS分选后的检测。如果不需要无菌细胞，整个过程可在实验台面上进行。</li>
	<li>将骨骼短暂浸入70% EtOH中进行消毒，随后浸入无菌PBS中洗涤。</li>
	<li>通过膝关节处切断，将股骨与胫骨和腓骨分离，并弃去腓骨。</li>
	<li>用锋利的剪刀剪去骨骼的两端。</li>
	<li>用预冷的无菌 PBS 按如下方法收集骨髓，直至骨骼呈白色：
	<ol>
		<li>用镊子夹住每块骨骼，将连接有含冷灭菌 PBS 的 10 mL 注射器的 26G 针头从骨骼一端插入骨干部。</li>
		<li>将骨骼置于50 mL离心管上方，用2 - 5 mL PBS冲洗骨骼以收集骨髓。</li>
		<li>从小鼠的4根骨骼（2根股骨和2根胫骨）中收集骨髓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL移液器轻轻吹打，使骨髓组织分散，形成细胞悬液。</li>
	<li>通过30 μm尼龙滤网过滤骨髓悬液，以去除骨组织碎片和细胞团块，从而获得单细胞悬液。</li>
	<li>以 280 × g 离心单细胞悬液 5 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于无菌染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）中，每只小鼠使用 5 mL 染色缓冲液例如， 来自2只小鼠股骨和胫骨的细胞，每份10 mL。</li>
	<li>取10 μL样品，与10 μL台盼蓝混合，将10 μL经台盼蓝标记的样品加载至血细胞计数板。使用光学显微镜进行细胞计数。 
	注意：如果细胞浓度过高而不利于准确计数，可在加入台盼蓝之前对样品进行稀释。</li>
</ol>
2. 通过磁激活细胞分选（MACS）富集前体细胞
<ol>
	<li>将全部单细胞悬液（或为获得所需产量而需要的足够数量的细胞）在 4°C 条件下以 280 × g 离心 5 分钟，并按每 107 个细胞加入 40 μL 染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）重悬细胞沉淀。 
	注意：也可使用谱系耗竭试剂盒厂商提供的 MACS 缓冲液（见材料表）作为染色缓冲液的替代。</li>
	<li>根据谱系耗竭试剂盒附带的说明书进行谱系耗竭操作。以下步骤适用于材料表中列出的试剂盒。若使用其他试剂盒，请遵循其厂商说明书操作，然后继续执行步骤 2.3。
	<ol>
		<li>按每 107 个细胞加入 10 μL 生物素标记抗体混合液，用移液器吹打混匀，在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>按每 107 个细胞加入 30 μL 染色缓冲液/MACS 缓冲液，混匀。</li>
		<li>按每 107 个细胞加入 20 μL 抗生物素磁珠，充分混匀后在 4 °C 下继续孵育 15 分钟。 
		注意：&#160;加入磁珠前需涡旋振荡，以确保磁珠完全分散。</li>
		<li>按每 107 个细胞加入 1 mL 染色缓冲液/MACS 缓冲液，以 280 × g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于最多 108 个细胞对应的 500 μL 染色缓冲液/MACS 缓冲液中。若细胞数量超过 108 个，应按比例增加染色缓冲液/MACS 缓冲液的体积。</li>
		<li>根据厂商说明书准备自动磁性分离装置。</li>
		<li>将含有标记细胞的离心管放入分离装置中，选择阴性筛选程序。</li>
		<li>收集阴性组分，其中含有富集的谱系阴性（Lin-）前体细胞；弃去阳性组分，其中含有被磁性标记的谱系阳性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Lin- 细胞以 280 × g 离心 5 分钟，并按每只小鼠加入 2 mL 染色缓冲液/MACS 缓冲液重悬细胞沉淀（例如，若骨髓来自 2 只小鼠，则加入 4 mL）。 
	注意：由于红细胞已被耗竭，此时细胞沉淀应呈白色而非红色。</li>
	<li>取 10 μL Lin- 细胞悬液，与 10 μL 台盼蓝混合，取 10 μL 混合后的台盼蓝标记样品加载至血细胞计数板。使用光学显微镜进行细胞计数。 
	注意：若细胞浓度过高导致计数不可靠，应在加入台盼蓝前对样品进行稀释。</li>
</ol>
3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）鉴定和分离髓系祖细胞
<ol>
	<li>标记9个微量离心管（1.5 或 2 mL），分别用于：1）未染色细胞，2–8）分别用荧光素偶联的抗FcγR（CD16/32）、c-Kit、Sca-1、CD34、Flt3（CD135）、Ly6C和CD115抗体单染的细胞，用于电压调节和颜色补偿，以及9）待用全部7种抗体染色的样本细胞，用于前体细胞鉴定与分选。</li>
	<li>将100,000个细胞分别加入各对照管（1-8号管），其余所有细胞（或根据需要减少数量）加入样品管（9号管）。 
	注意：如果样本体积大于1.5–2 mL，可能需要将样本细胞分装至15 mL离心管中，离心后重悬沉淀（见下文步骤3.3），然后将细胞转移至微量离心管中进行后续染色步骤。</li>
	<li>以 1,500 离心细胞&#160;x g 离心 5 分钟，将对照管沉淀重悬于 100 μL 染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）中，每 5 × 10⁶ 样本管沉淀也重悬于 100 μL 染色缓冲液中6 细胞（例如， 200 μL，用于1 × 107 细胞。</li>
	<li>向FcγR单染管和样品管中加入2 μg/mL抗-CD16/CD32-APC-Cy7。轻轻涡旋混匀，于4 °C孵育10分钟。 
	注意：在加入其他抗体之前，必须先用 FcγR（CD16/32）抗体对样本细胞进行染色，以防止因非特异性 Fc 介导的抗体结合而导致的竞争。切勿使用 FcγR 封闭试剂孵育细胞。</li>
	<li>将其他抗体分别加入相应的单染管（每管1种抗体）和样本管（共6种抗体）：10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue、2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7、25 μg/mL CD34-FITC、10 μg/mL Flt3-APC、2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 和 4 μg/mL CD115-PE。轻轻涡旋混匀，4 °C 避光孵育15分钟。</li>
	<li>向对照管中加入 900 μL 染色缓冲液，每 10 个样品加入 1 mL 染色缓冲液7 将细胞加入样本管中。在1,500 × g离心5分钟，弃上清后用染色缓冲液重悬细胞沉淀：每个对照管加200 μL，每个25 × 10⁶细胞管加500 μL6 样本管中的细胞。将重悬的细胞转移至5 mL流式管中。 
	注意：如果样品体积大于1.5–2 mL，可能需要将细胞转移至15 mL离心管中进行离心。</li>
	<li>根据制造商的说明准备流式细胞仪（分析仪或分选仪）。</li>
	<li>运行未染色和单染对照细胞样本，通过流式细胞仪设置电压和荧光补偿。</li>
	<li>运行待测细胞样本，按照下文所述并总结如下，对前体细胞亚群进行设门分析 图2，如需要，可进行FACS分选以分离相关的前体细胞亚群。 
	注意：通常需要获取约 200,000 个细胞，以确保每个前体细胞门中至少获得 1,000 个事件。
	<ol>
		<li>创建所有细胞的点图，横轴显示FSC-A，纵轴显示SSC-A，并设门以排除碎片和死细胞 =&#62; &#34;活体&#34; 细胞</li>
		<li>创建点图 &#34;活体&#34; 细胞，显示FSC-H（x轴）与FSC-W（y轴），设门以排除双联体=&#62; 活细胞/单细胞（FSC）门控</li>
		<li>创建活细胞/单细胞（FSC）的点图，横轴显示SSC-H，纵轴显示SSC-W，并设门排除双联体细胞&#62; 活细胞/单细胞（FSC）/单细胞（SSC）门控</li>
		<li>创建活细胞/单细胞（FSC）/单细胞（SSC）的点图，显示 Sca-1（x 轴）和 c-Kit（y 轴），并设门圈选 c-Kit+ Sca-1- 细胞 =&#62; LKS- 细胞</li>
		<li>创建LKS的点状图- 细胞，显示 CD34（x 轴）和 FcγR（y 轴），设门以选择 CD34+ FcγRlo 细胞 =&#62; &#34;CMPs&#34;，以及 CD34+ FcγR你好 细胞 =&#62; &#34;GMPs&#34;. 
		注意：必须尽可能精确地圈定“CMPs”和“GMPs”。使用伪彩色密度图或等高线图有助于准确圈门。</li>
		<li>创建点图 &#34;CMPs&#34;，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择： 
		Flt3+ CD115lo 细胞 =&#62; CMP-Flt3+ CD115lo 细胞 
		Flt3- CD115lo 细胞 =&#62; CMP-Flt3- 细胞 
		Flt3+ CD115你好 细胞 =&#62; MDPs</li>
		<li>创建点图 &#34;GMPs&#34;，显示 Ly6C（x 轴）和 FcγR（y 轴），并设门以选择 Ly6C-细胞 =&#62; &#34;GMP-Ly6C- 细胞&#34;，以及 Ly6C+ 细胞 =&#62; &#34;GMP-Ly6C+ 细胞&#34;.</li>
		<li>创建点状图 &#34;GMP-Ly6C- 细胞&#34;，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择： 
		Flt3- CD115lo 细胞 =&#62; GMPs</li>
		<li>创建点图 &#34;GMP-Ly6C+ 细胞&#34;，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择： 
		Flt3- CD115lo 细胞 =&#62; GPs, 
		Flt3- CD115你好 细胞 =&#62; MPs+cMoPs</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

韦斯曼小鼠髓系祖细胞鉴定的设门策略1 近20年来一直是免疫学家和血液学家的金标准，但现在显然 &#34;CMP&#34; 和 &#34;GMP&#34; 细胞群具有高度异质性，需要更精确的设门策略。本文所述方案可实现对C57BL/6J小鼠中具有寡能分化潜能及谱系定向的亚群进行鉴定，从而更精确地定量特定髓系前体细胞，描绘髓系生成途径，并探究髓系分化特定阶段所涉及的分子机制。如需进行分子分析，还可对这些前体细胞亚群进行分选。 体外 和 体内 分化评估 等等。
本方案使用年轻（6至8周龄）的C57BL/6J小鼠开发，适用于雄性和雌性小鼠。我们尚未对老年小鼠中的前体细胞亚群进行表征。我们不认为标志物会随年龄发生变化，但各亚群的相对比例可能有所不同。我们尚未在其他小鼠品系中评估前体细胞亚群。
我们改进的设门策略的首次应用是揭示转录因子干扰素调节因子8（IRF8）调控髓系细胞命运选择的机制2...

单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞（DCs）是来源于造血前体细胞的髓系细胞，主要在骨髓中通过一种称为髓系生成（myelopoiesis）的过程产生。共同髓系前体细胞（CMPs）具有产生髓系细胞以及巨核细胞和红细胞的潜能，但不能产生淋巴细胞。粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）来源于CMPs，能够产生粒细胞和单核细胞，但已失去生成巨核细胞和红细胞的潜能。单核细胞、经典树突状细胞和浆细胞样树突状细胞（cDCs/pDCs）被认为也起源于一种称为单核细胞-树突状细胞前体细胞（MDPs）的共同前体细胞，而MDPs由CMPs产生。随着谱系潜能的逐步受限，最终形成谱系定向的前体细胞：粒细胞前体细胞、单核细胞前体细胞和树突状细胞前体细胞（图1）。
Weissman 及其同事报道，小鼠骨髓中 CMPs 存在于 Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo 细胞群，而 GMPs 则位于 LKS- CD34+ FcγRhi 细胞群1。然而，这些“CMP”和“GMP”细胞群具有高度异质性。例如，“GMP”细胞群还包含已定向分化的粒细胞前体细胞和单核细胞前体细胞1,2。MDPs 被独立报道为表达 CX3CR1+ Flt3+ CD115+ 的前体细胞，同时亦表达 CD34 和 FcγR3,4。MDPs 可分化为能产生 cDC 和 pDC 的共同树突状细胞前体细胞（CDPs），研究表明 CDPs 表达较低水平的 c-Kit（CD117），且不属于 LKS- 细胞群5。
过去人们认为单核细胞通过单一途径产生（CMP-GMP-MDP-单核细胞）。与此模型一致，由GMPs产生的单核细胞定向前体细胞（称为单核细胞前体，MPs）2 和由MDPs产生的前体细胞（称为共同单核细胞前体，cMoPs）6，基于共有的表面标志物表达，被认为是同一类细胞。然而，我们最近的研究表明，单核细胞可分别由GMPs和MDPs独立产生，并可通过单细胞RNA测序区分MPs与cMoPs7。
我们近期改进了Weissman的“CMP”和“GMP”分选策略，用于鉴定C57BL/6J小鼠骨髓中的6个亚群，这些亚群包含不同类型的寡能性及谱系定向的髓系前体细胞。我们首次报道，通过Ly6C和CD115染色可从“GMP”组分（LKS- CD34+ FcγRhi 门控；图1）中分离出寡能性的GMPs，以及粒细胞前体细胞（GPs）、单核细胞前体细胞（包括MPs和cMoPs，目前尚无法将二者分离）2。随后我们证明，MDPs主要存在于“CMP”组分（LKS- CD34+ FcγRlo 门控）中，该组分还包含Flt3+ CD115lo 和 Flt3- 亚群7（图1）。在过继转移实验中，CMP-Flt3+ CD115lo 组分可生成GMPs和MDPs。而CMP-Flt3- 亚群所含的前体细胞似乎介于CMP-Flt3+ CD115lo 细胞与GMPs之间。与MDPs不同的是，CMP-Flt3+ CD115lo 和 CMP-Flt3- 两个组分还具有生成巨核细胞和红细胞的潜能。
但需要注意的是，目前尚不清楚“CMP”组分是否包含真正具有寡能性的祖细胞例如， CMP-Flt3 中的单个细胞+ CD115lo 具有中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、巨核细胞和红细胞潜能的细胞群），或 alternatively，由谱系潜能更受限的前体细胞混合物组成。集落形成实验（甲基纤维素培养）显示，“CMP”及 CMP-Flt3 中存在具有粒细胞（中性粒细胞）、红细胞、单核细胞和巨核细胞潜能的细胞（GEMM 细胞）+ CD115lo 和 CMP-Flt3- 组分1,7但无法评估其树突状细胞潜能。相比之下，集落形成实验表明，“GMP”组分中存在寡能性粒单前体细胞（GMPs）（具有中性粒细胞和单核细胞分化潜能的前体细胞）1,2，这一观点得到了近期单细胞转录组学分析的支持8目前尚不清楚这些寡能性粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）是否也能产生其他类型的粒细胞（嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞）。
基于这些研究，我们现在展示了如何利用7种表面标志物（c-Kit、Sca-1、CD34、FcγR、Flt3、Ly6C和CD115）来鉴定并分离这6种具有寡能分化潜能及谱系定向的髓系前体细胞亚群。本文所述方案可应用于 体外 培养实验（甲基纤维素或液体培养） 体内 小鼠的过继转移实验，以及分子分析（批量和单细胞RNA测序、Western印迹） 等等。).
该方案包括三个阶段：1）制备骨髓细胞的单细胞悬液，2）通过磁珠激活细胞分选法富集造血祖细胞，3）利用流式细胞术（根据需要选择分析仪或分选仪）鉴定并分离祖细胞亚群。第一步是从安乐死小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞，该步骤与其他已有描述的方案类似。9接下来，使用针对红细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面标志物的抗体混合物，对样本中的干细胞和祖细胞进行富集。 等。 以耗竭分化细胞。此步骤并非强制，但强烈建议执行，以优化前体细胞亚群的检测效果，并减少前体细胞鉴定所需的抗体用量以及流式细胞术所需时间。以下谱系耗竭方案采用磁激活细胞分选（MACS），使用小鼠谱系细胞耗竭试剂盒（包含针对 CD5、CD45R（B220）、CD11b、Gr-1（Ly6G/C）、7-4 和 Ter-119 的生物素标记抗体，以及抗生物素微珠）和自动化磁性分选仪。最后一步是通过流式细胞术对前体细胞亚群进行鉴定（如需要，可进行分选）。下述抗体组合方案（另见 表1设计用于配备4种激光器（405 nm、488 nm、561 nm、640 nm）的流式细胞仪（分析型或分选型）。
<img alt="显示 CMP、GMP 和 MDP 通路的造血过程示意图，展示细胞分化路径。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞的前体细胞及其分化通路。 图示为近期修订的髓系造血模型7，叠加了Weissman定义的“CMP”（蓝色）和“GMP”（绿色）分选门控1。本图改编自Yáñez et al. 20177。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>小鼠：野生型 C57BL/6J (CD45.2)</td><td>杰克逊实验室</td><td>货号#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>小鼠谱系细胞耗竭试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD34（克隆 RAM34）FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>货号#553733</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD16/CD32（Fc&amp;gamma;R；克隆93）APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>货号#101327</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly6A/E（Sca-1；克隆 108113）PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>货号#108114</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD117（c-Kit；克隆 2B8）Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>货号#105820</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly6C（克隆 HK1.4）PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>货号#128012</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD115（克隆 AFS98）PE</td><td>BioLegend</td><td>货号#135506</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD135（Flt3；克隆 A2F10.1）APC</td><td>BD 生物科学</td><td>货号#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright 绝对计数微球</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS 分离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>使用 &quot;耗竭&quot; 程序</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td>5 激光器，15 种颜色</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III 细胞分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td>5 个激光器，13 种颜色</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>用于对 .fcs 文件进行进一步分析</td></tr></tbody></table>

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

能够产生中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs）的髓系祖细胞可在小鼠骨髓中被识别并分离，用于血液学和免疫学分析。例如，对髓系祖细胞群体的细胞与分子特性的研究可揭示白血病转化的潜在机制，或阐明免疫系统如何响应病原体暴露。以往报道的用于识别髓系祖细胞的流式细胞术策略已在多个领域推动了重要进展，但其所鉴定的细胞组分具有高度异质性。最常用的设门策略所定义的骨髓细胞组分虽富集了目标细胞群体，但仍包含大量&#34;污染性&#34;祖细胞。我们近期的研究已很大程度上解析了这种异质性，本文所呈现的方案可从先前定义的两个骨髓组分中分离出6个寡能性和谱系定向的髓系祖细胞亚群。该方案包括三个阶段：1）骨髓细胞的分离；2）通过磁珠激活细胞分选技术（MACS）对造血祖细胞进行富集（即通过MACS去除谱系阳性细胞）；3）利用流式细胞术鉴定髓系祖细胞亚群（如需要，可进一步进行荧光激活细胞分选，FACS）。该方法可用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用中的祖细胞定量与分离，并已为中性粒细胞、单核细胞及树突状细胞分化相关通路与机制的研究提供了新的见解。

采用上述方案，可从一只C57BL/6J小鼠（6至8周龄，雄性或雌性）的双侧股骨和胫骨（共两条腿）中获得约1亿个细胞（包括红细胞，或约5千万个有核细胞）。通过MACS法去除Lin+细胞，每只小鼠可分离得到100万至200万个Lin-细胞。
6 种髓系前体细胞亚群各自约占 Lin- 细胞的 1%–4%。去除非谱系细胞（Lineage depletion）可有效去除分化细胞并富集前体细胞，但 Lin- 组分中除 c-Kit+ 前体细胞外，还含有大量 c-Kit- 细胞（图 3A）。经 FACS 分选后的前体细胞得率可能因分选仪设置不同（例如，最大得率 versus 最佳纯度）而有所差异，但通常每种亚群可获得 10,000–40,000 个细胞（<str...

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内 过继转移实验，以及RNA/蛋白质分析。

可产生中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs）的髓系祖细胞可在小鼠骨髓中被识别并分离，用于……

该方法可能对研究骨髓细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）生成与功能的血液学和免疫学研究人员有所帮助。该技术的主要优势在于，与以往策略相比，它能够更精确地鉴定骨髓祖细胞亚群。为了通过磁性激活细胞分选（MACS）富集骨髓中的祖细胞，需将细胞离心后形成沉淀，并将沉淀重悬于每1×10⁷个骨髓细胞40 µL的MACS染色缓冲液中。为了去除已分化的谱系阳性细胞，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 µL 生物素标记的抗体混合液，用移液器混匀，于 4°C 孵育 10 分钟。孵育结束后，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 30 µL 染色缓冲液并混匀，随后每 1 × 10⁷ 个细胞加入 20 µL 抗生物素磁珠。在 4°C 孵育 15 分钟后，每 1 × 10⁷ 个细胞用 1 mL 染色缓冲液洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 500 µL 新鲜染色缓冲液中，最多可处理 1 × 10⁸ 个细胞。接下来，根据制造商的说明设置自动磁力分离器，并将标记细胞的离心管放入分离器中。启动阴性筛选程序，收集含有祖细胞富集的谱系阴性细胞的阴性组分。通过离心沉淀谱系阴性细胞，并将沉淀（现呈白色）按每只小鼠2毫升的量重悬于染色缓冲液中，用于计数。为了通过流式细胞术分选分离髓系祖细胞，将1 × 10⁵个阴性谱系细胞分别加入八个对照用微量离心管中，用于电压选择和颜色补偿；将剩余的细胞样品加入第九个微量离心管中，用于与七种目标表面标志物抗体同时孵育，以鉴定并分选祖细胞。通过离心使细胞成团，将各对照管中的细胞沉淀重悬于100 µL FACS染色缓冲液中，实验样品管中的细胞沉淀则按每5 × 10⁶个细胞加入100 µL染色缓冲液的比例重悬。接下来，在Fcγ受体单染管和样品管中加入抗-CD16/CD32抗体。轻轻涡旋混匀，并在4°C下孵育样品10分钟。孵育结束后，将其他抗体分别加入相应的单染对照管和样品管中，轻轻涡旋混匀后，在4°C下孵育15分钟。孵育结束后，向对照管中加入900 µL染色缓冲液，向样品管中每1×10⁷个细胞加入1 mL染色缓冲液，随后进行离心。将对照组沉淀物每管用 200 微升新鲜染色缓冲液重悬，实验组沉淀物按每 2.5 × 10⁷ 个细胞用 500 微升染色缓冲液重悬，并将标记后的细胞转移至相应的 5 毫升 FACS 管中。随后根据标准操作程序设置流式细胞仪，使用未染色和单染对照样品调节电压和荧光补偿。为鉴定并分选髓系祖细胞，将实验组细胞样品上机，绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图，设门以排除碎片和死亡细胞。创建活细胞的前向散射高度对前向散射宽度图，并设门以排除双联体。对前向散射单细胞重复此过程，创建侧向散射高度对侧向散射宽度图，并设门以排除双联体。创建Sca-1对c-Kit图，并设门以选择c-Kit阳性而Sca-1阴性的前体细胞。然后创建 CD-34 与 FC γ 受体的散点图，并设门以选择混合型共同髓系祖细胞和混合型粒细胞-单核细胞祖细胞群体。准确设门圈选混合型共同髓系祖细胞及混合型粒细胞-单核细胞祖细胞群体至关重要。使用伪彩色密度图或等高线图有助于更精确地设门。利用混合的共同髓系祖细胞门控中的细胞，绘制 CD115 与 Flt3 的散点图并设门，以分选出共同髓系祖细胞中 Flt3 阳性 CD115 低表达细胞、共同髓系祖细胞中 Flt3 阴性 CD115 低表达细胞，以及 Flt3 阳性 CD115 高表达的单核细胞-树突状细胞前体细胞。利用混合的粒细胞-单核细胞祖细胞门控中的细胞，绘制 Ly6C 与 FC γ 受体的散点图并设门，以分选出 Ly6C 阴性细胞和 Ly6C 阳性细胞。随后，针对每一种分选后的混合粒细胞-单核细胞祖细胞亚群，分别绘制 CD115 与 Flt3 的散点图，并设门分选 Ly6C 阴性 Flt3 阴性 CD115 低表达的粒细胞-单核细胞祖细胞、Ly6C 阳性 Flt3 阴性 CD115 低表达的粒细胞祖细胞，以及 Ly6C 阳性 Flt3 阴性 CD115 高表达的单核细胞祖细胞。Max谱系耗竭法在去除分化细胞以及富集c-Kit阳性前体细胞方面具有较高效率。谱系阴性组分中仍含有少量c-Kit阴性细胞，但这些细胞将在后续的流式细胞术设门步骤中被清除。经过FACS分选后，前体细胞的得率可能因分选仪设置不同而有所差异，但通常每只小鼠每个组分可获得1×10⁴至4×10⁴个细胞，分选后各组分纯度应高于95%。良好的染色对于细胞群体的清晰分离至关重要。可能需要对抗体进行滴定或选择不同的荧光染料，以确保最佳的分离效果。本方案可用于鉴定祖细胞，以评估样本间骨髓组成的差异，分离祖细胞用于分子分析，或评估其生成髓系细胞的能力。

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠骨髓 Oligopotent 和世系髓样祖细胞的鉴定与分离

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

本文介绍了一种优化的、高度可重复的人骨髓（hBM）中胚层祖细胞（MPCs）分离方案。通过流式细胞术和巢蛋白（nestin）表达对MPCs进行了表征。这些细胞能够产生呈指数生长的类似间充质干细胞（MSC）的细胞培养物，同时保留其血管生成潜能。...

从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPCs）

尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。...

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

本文介绍了从小鼠长骨中分离和分化骨髓基质细胞及造血干细胞的方法。提供了两种不同的实验方案，可获得适用于扩增并分化为成骨细胞、脂肪细胞和破骨细胞的不同细胞群体。...

小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

本文介绍了培养小鼠髓系前体细胞32D/G-CSF-R细胞系、进行病毒感染以及开展增殖和分化检测的详细实验方案。该细胞系适用于研究髓系细胞发育，以及目的基因在髓系细胞生长和中性粒细胞分化中的作用。...

小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

学习使用磁激活细胞分选和荧光激活细胞分选技术，从小鼠骨髓中鉴定和分离六种髓系祖细胞亚群。该方法适用于体外培养、RNA和蛋白质分析等多种下游应用，有助于血液学和免疫学研究。

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

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