一种从成年大鼠肾脏中分离完整型肾小球的有效筛分方法

该协议的主要重点是有效地分离可行的初级肾小球培养物, 将污染物降至最低, 用于各种下游应用。分离的肾小球保留了组分细胞类型之间的结构关系, 可以在体内培养很短的时间。

这种方法有助于回答肾脏疾病领域的关键问题。特别是在对正常和患病状态下球蛋白的理解方面。由于细胞类型的多样性及其独特的结构，球状生物学可能难以研究。

该技术的主要优点是使用简单的方法和设备提供现成的完整球状来源。这项技术对我们了解正常和患病肾脏的过滤屏障有影响。特别是，它可以揭示我们对蛋白质尿慢性肾脏疾病的理解，其中肾球损伤导致血清蛋白异常高分泌到尿液中。

一般来说，这种技术的新个体在最终样品中很难获得足够的产量和纯度。演示这个程序的将是布兰妮·拉什，一个来自我实验室的技术人员。首先，使用剪发器从安乐死大鼠的前部腹部去除头发。

使用70%乙醇清洁裸露的皮肤。然后，使用手术剪刀，在皮肤上做一个中线切口。要暴露内脏，通过肌肉层做一个中线切口。

找到并分离肾脏，放入消毒50毫升塑料锥形管中，将30毫升的汉克缓冲盐溶液或HSS放在冰上。将冰上管转移到无菌细胞培养罩中。将肾脏转移到一个无菌的培养皿中，里面装着五毫升的HSSS放在冰上。

使用剪刀和锋利的钳子去除和丢弃脂肥。要取出并丢弃肾脏周围的胶囊，做一个小的肤浅切口，然后用锋利的钳子轻轻地将其从肾脏中拉开。将肾脏放在第二个培养皿中，用五毫升的HSS将肾脏放在无菌纱布上，并通过中下垂部分将每个肾脏分成两半。

使用手术刀去除和丢弃可由其较深的颜色和中心位置识别的梅杜拉。将其余含有主要肾脏皮层的碎片转移到含有五毫升HSS的第三个培养皿中。使用无菌剃须刀刀片切碎它们，直到碎片小于一毫米的大小或直到形成糊状物。

使用 1%BSA PBS 在 500 毫升废杯上弄湿 180 微米筛的顶部和底部。这一步是至关重要的，因为它涂上蛋白质的筛子，并减少球蛋白的粘附，这将提高产量。将混合皮层放在筛子的小边上。

使用 10 毫升一次性注射器的纹理柱塞法兰，通过筛子将组织放入放在冰上的底部锅中。使用HSSS定期冲洗，尽可能避免样品稀释，并重复使用底部锅中收集的液体冲洗筛子。完成筛分后，小心地用浴盆底部用HSS清洗筛底，以捕获任何松散粘附的球状。

将底部平底锅中的所有液体分成 10 毫升注射器，并配有 20 个量表针。将液体通过针头至少三次进入底盘。对于最后一个集合，保持注射器中含有液体的球状，直到准备好通过90微米筛。

同时，用 1%BSA PBS 冲洗底部锅并放入废烧杯中清洗底盘。使用 1%BSA PBS 将 90 微米筛的顶部和底部弄湿，然后放在底盘的顶部。将注射器中的样品涂抹到筛子的一边。

使用纹理柱塞法兰，像之前一样，通过筛子将组织吸走。使用底部平底锅中的溶液清洗组织，从筛子的一个边缘收集所有东西。筛子完成后，用浴盆底部的 HBSS 缓冲液小心地清洗筛子底部，以捕获任何可能松散粘附的球状。

将底部平底锅中的所有液体收集到 50 毫升塑料锥形管中。使用 1%BSA PBS 将底锅洗入废烧杯中。然后使用 1%BSA PBS 将 75 微米筛的顶部和底部弄湿。

将筛子放在放在冰上的下锅顶部。将样品涂抹在筛子的一条边上，液体很容易流过。用至少 20 毫升 1%BSA PBS 冲洗筛的顶部，放入废烧杯中，并仔细清洗筛子底部。

要收集留在75微米筛顶上的球状体，请倒置用尽可能多的HSSS冲洗，以收集培养皿中的球状体。将筛分的球状球收集到冰上50毫升的塑料锥形管中。在 1800 次 G 下离心 5 分钟，在 4 摄氏度下，使用移液器小心地取出上流液。

将颗粒重新悬浮在 10 毫升的冷 HBSS 中。组合样品并重复离心。在五毫升的HSS中重新悬浮球菌。

要计算总球状，请将样品滴 10 微升放在玻璃幻灯片上，在显微镜下计数 500，以获得总产量。孤立的结构应该由几乎所有没有管状结构的球状结构组成。如果管状水存在，并且会影响您的下游应用，可以通过将整个样品应用于 90 微米筛并自该点开始重复协议来去除它们。

此处描述的协议在隔离球菌方面是有效的，最终的悬浮液被密集的球状物中挤满，纯度大于 95%，并且管状片段或其他细胞类型的污染最小。这些球状可以沾染赤氧林和 eosin 污渍，以查看其形态。此外，即使在处理之后，它们也在整个协议中保持其结构。

它们保留完整和可行的豆瓣细胞、中桑细胞和内皮细胞。分离的球状体已经暴露在化学损伤中，以模拟体内病理学。特别是硫酸蛋白胺，它扰乱了球状过滤屏障的电荷。

与健康的球菌相反，硫酸蛋白胺治疗的球菌，肾黄素显著减少，WT1的一些核阳性。当用透射电子显微镜看时，健康的球菌显示了典型的足部过程。在硫酸蛋白胺处理后，足部过程被拉长或埃法化，表明豆瓣细胞损伤。

为了确定分离的球状细胞的生存能力，将裂开的木塞三作为凋亡标记物观察。在隔离球菌后一小时，没有裂开的三号木塞。一些细胞在两个和四个小时内出现凋亡的迹象，并随着时间的推移而逐渐增加。

在24小时和48小时注意到的凋亡细胞数量最大。基于这些结果，我们建议在大多数实验中，在隔离后立即使用分离球菌。执行此过程时，快速高效地工作非常重要。

从肾脏被分离的那一刻起，肾菌开始恶化。你越快地隔离球状物，你不得不摆姿势、隔离、操纵的时间就越快。分离后，分离的球状可暴露在化学或生物制剂中，以刺激生理或病理状况。

标本可以是蛋白质或RNA分离、组织学或免疫荧光和电子显微镜的过程。自20世纪50年代发展以来，这项技术帮助研究人员研究球状生物学。总的来说，该协议提供了一种评估正常和患病状态下完整球状形态和细胞特征的方法。

这种方法可以帮助我们了解蛋白尿慢性肾脏疾病，并有助于未来疗法的发展。