一种高效筛分法从成年大鼠肾脏中分离完整肾小球

该方法有助于解答肾脏疾病领域中的关键问题，特别是在理解肾小球在正常和疾病状态下的功能方面。由于肾小球包含多种细胞类型且具有独特的结构，其生物学研究往往较为困难。

该技术的主要优势在于利用简单的方法和设备即可获得完整的肾小球，来源便捷。该技术对理解正常及病变肾脏中的滤过屏障具有重要意义。特别是，该技术有助于深入认识蛋白尿性慢性肾病，此类肾病中肾小球损伤会导致血清蛋白异常大量地分泌进入尿液。

通常，初次使用该技术的研究人员在最终样本中难以获得足够的产量和纯度。本实验操作将由本实验室的技术员 Brittney Rush 进行示范。首先，使用毛发剪刀去除已实施安乐死的大鼠腹部前侧的毛发。

使用70%乙醇清洁暴露的皮肤。然后用手术剪在皮肤上做一条正中切口。为暴露内脏器官，需通过肌肉层做一条正中切口。

找到肾脏并分离，放入含有30毫升置于冰上的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的无菌50毫升塑料离心管中。将该管置于冰上，转移至无菌细胞培养操作台。将肾脏转移至含有5毫升置于冰上的HBSS的无菌培养皿中。

使用剪刀和锐利的镊子去除并弃去肾周脂肪。为去除并弃去包绕肾脏的包膜，先做一个小的浅表切口，然后用锐利的镊子轻轻将其从肾脏上剥离。将肾脏置于第二个培养皿中的无菌纱布上，该培养皿内含5 mL HBSS，并通过正中矢状面切口将每个肾脏切成两半。

使用手术刀去除并弃去髓质，髓质可通过其较深的颜色和中心位置进行识别。将主要含有肾皮质的剩余组织块转移至第三个培养皿中，该培养皿内含有 5 mL HBSS。使用无菌剃刀片将组织切碎，直至组织块大小小于 1 mm 或形成糊状物。

使用 1% BSA PBS 润湿置于 500 毫升废液杯上方的 180 微米筛网的顶部和底部。此步骤至关重要，因为它可在筛网上形成蛋白质包被，减少肾小球的黏附，从而提高得率。将混合的皮质组织置于筛网的一小边缘处。

使用10毫升一次性注射器的带纹路推杆法兰，将组织碾压过筛，滤入置于冰上的底部容器中。定期用HBSS冲洗，尽量减少用量以避免样品稀释，并重复使用底部容器中收集的液体来冲洗筛网。完成筛分后，从容器底部取HBSS小心冲洗筛网底部，以收集任何松散附着的肾小球。

将底部培养皿中的所有液体分装至配备20号针头的10毫升注射器中。将液体至少通过针头反复推注三次至底部培养皿中。最后一次收集时，将含有肾小球的液体保留在注射器内，直至准备通过90微米筛网。

同时，用1% BSA PBS冲洗底部烧杯并将其排入废液杯中。用1% BSA PBS润湿90微米筛网的顶部和底部，然后将其放置在底部烧杯的上方。将注射器中的样品加至筛网的一侧边缘。

使用带有纹理的活塞边缘，像之前一样将组织压过筛网。用底部托盘中的溶液冲洗组织，并从筛网的一侧收集全部物质。筛分完成后，从托盘中取HBSS缓冲液，小心冲洗筛网底部，以收集可能松散附着的任何肾小球。

将底部托盘中的所有液体收集到一个50毫升的塑料锥形管中。使用1% BSA PBS将底部托盘冲洗至废液杯中。然后使用1% BSA PBS润湿75微米筛网的顶部和底部。

将筛子置于放置在冰上的底部容器上方。将样品加至筛子的一侧边缘，使液体易于流过。用至少20毫升含1% BSA的PBS冲洗筛子顶部，流入废液杯中，并小心清洗筛子底部。

为收集残留在75微米筛网上方的肾小球，将筛网倒置，用适量的HBSS冲洗，将肾小球收集至培养皿中。将过筛后的肾小球转移至一个50毫升塑料离心管中，并置于冰上。在4°C条件下以1800 × g离心5分钟，随后用移液器小心吸除上清液。

将沉淀重悬于10毫升冷的HBSS中。合并样品并重复离心。将肾小球重悬于5毫升HBSS中。

为了计数总肾小球数量，取10微升样品滴加到载玻片上，在显微镜下计数，并乘以500，得到总产量。分离出的结构应几乎全部为肾小球，不含肾小管结构。如果存在肾小管且可能影响后续实验应用，可将全部样品通过90微米筛网过滤，并从此步骤开始重复实验流程。

本方案在分离肾小球方面效率较高，最终悬浮液中肾小球密度高，纯度超过95%，且极少受到肾小管节段或其他细胞类型的污染。这些肾小球可用苏木精和伊红染色以观察其形态结构。此外，即使经过处理，肾小球在整个实验过程中仍能保持其原有结构。

它们保留了完整且具有活性的足细胞、系膜细胞和内皮细胞。分离的肾小球已暴露于化学损伤中，以模拟体内病理状态。具体而言，硫酸鱼精蛋白可破坏肾小球滤过屏障的电荷。

与健康的肾小球不同，经硫酸鱼精蛋白处理的肾小球显示出肾单位数量显著减少，以及WT1阳性细胞核数量明显下降。在透射电子显微镜下观察，健康的肾小球可见典型的足突结构；而经硫酸鱼精蛋白处理后，足突出现拉长或消失，提示足细胞受损。

为了确定分离出的肾小球中细胞的存活率，将活化的caspase-3作为细胞凋亡的标志物进行观察。在肾小球分离后0小时和1小时时，未检测到活化的caspase-3。在2小时和4小时时，少数细胞显示出凋亡迹象，并随着时间推移呈进行性增加。

凋亡细胞数量在24小时和48小时时最多。根据这些结果，我们建议分离出的肾小球在分离后应立即用于大多数实验。进行此操作时，务必快速且高效地完成。

从肾脏被分离的那一刻起，肾小球便开始退化。肾小球分离得越快，留给后续实验操作、分离与处理的时间就越充裕。分离后，可将获得的肾小球暴露于化学或生物试剂中，以诱导生理或病理状态。

并且可以对样本进行处理，用于蛋白质或RNA提取、组织学、免疫荧光以及电子显微镜分析。自20世纪50年代该技术发展以来，已帮助研究人员深入研究肾小球生物学。总体而言，本实验方案提供了一种评估正常和疾病状态下完整肾小球形态学及细胞特征的方法。

该方法有助于我们理解蛋白尿性慢性肾病，并促进未来治疗方法的开发。