Name: 一种从成年大鼠肾脏中分离完整型肾小球的有效筛分方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习使用筛分法从成年大鼠肾脏中高效分离完整型肾小球，纯度超过95%。该方法为研究肾脏疾病机制和蛋白尿性慢性肾病提供了可靠的实验工具。

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本工作得到了美国心脏协会基金 FTF 16990086、美国国立卫生研究院 P30 DK079307、美国肾脏病学会 Gottschalk 奖、匹兹堡大学医学中心竞争性医学研究基金奖以及匹兹堡大学医师学术基金会奖的支持。我们感谢 Gerard Apodaca 在肾小球组织学分析保存方面的技术建议，感谢 Mara Sullivan 和 Ming Sun 在电子显微镜方面的协助，以及 Yingjian Li 和 Youhua Liu 在本实验方案中的技术指导。我们还感谢 Cynthia St. Hilaire 提供 CD31 抗体。

本文所述所有方法均已获得匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 大鼠肾小球的分离
<ol>
	<li>准备无菌1%分离缓冲液时，将5 g牛血清白蛋白（BSA）加入600 mL烧杯中。
	<ol>
		<li>向烧杯中加入500 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），并用磁力搅拌棒搅拌，直至所有BSA完全溶解。</li>
		<li>在细胞培养罩中对1% BSA/PBS缓冲液进行无菌过滤。 
		&#8203;注意：无菌的1% BSA/PBS缓冲液可在4 °C保存最多一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取2至4只体重为150至200 g的Sprague-Dawley大鼠。
	<ol>
		<li>处死大鼠 通过 使用一个密闭舱室进行二氧化碳吸入，以每分钟10%-30%舱室体积的流速通入100%二氧化碳。在将动物移出二氧化碳环境前，应观察其呼吸停止及眼球颜色变浅等征象。</li>
		<li>用70%乙醇擦拭小鼠腹部前侧皮肤，并根据需要使用毛发修剪器去除毛发。使用手术剪或手术刀沿腹中线切开皮肤。再沿中线切开肌层，暴露内脏器官。为实施安乐死，可进一步向上延长切口，穿过膈肌和胸骨或肋骨 cage。</li>
		<li>分离并取出双侧肾脏，置于含有30 mL冰上预冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）的无菌50 mL塑料离心管中。 
		注意：可在同一容器中对多只大鼠实施安乐死，并将所有肾脏置于同一锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肾脏置于冰上，并运送至无菌细胞培养操作台。将肾脏转移至含有5 mL HBSS的无菌培养皿中（保持冰上操作），用剪刀和精细镊子去除并弃去肾周脂肪。若仍存在，可通过做一小的表层切口，再用精细镊子轻轻将包绕肾脏的包膜剥离并弃去。 
	注意：肾组织分离过程中应始终置于冰上，并全程保持无菌操作。可在培养皿中放置一片无菌纱布，以提供粗糙表面固定肾脏，便于操作。
	<ol>
		<li>沿矢状面将肾脏纵向切成两半，用手术刀在另一个含有5 mL HBSS的培养皿中去除并弃去颜色较深的髓质。</li>
		<li>将剩余主要为肾皮质的组织转移至第三个含有5 mL HBSS的培养皿中，用无菌剃刀片切碎，直至组织块小于1 mm或形成糊状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1% BSA/PBS润湿置于500 mL废液杯上方的180 µm筛网的顶部和底部。此步骤至关重要，因其可在筛网上形成蛋白包被，减少肾小球的黏附，从而提高得率。</li>
	<li>将切碎的皮层组织置于筛网的一小侧边缘，使用10 mL注射器的带纹路推杆凸缘（即与橡胶密封圈相对的一侧）将组织碾压过筛，落入置于冰上的底部容器中。定期用HBSS冲洗，但尽量减少用量以避免样品稀释。 
	注意：缓冲液体积总量不得超过 30 mL，因此此处最多只能再使用 25 mL。将剪碎的组织仅置于筛网的一侧边缘，目的是通过限制组织与筛网的接触面积，减少肾小球在筛网上的黏附。
	<ol>
		<li>为实现此目的，可重复利用收集在底部托盘中的液体冲洗筛网。筛滤完成后，从托盘底部用1% BSA/PBS缓冲液再次小心冲洗筛网底部一次，以收集可能轻微附着的肾小球。</li>
		<li>将底部托盘中的所有液体收集到数个装有20号针头的10 mL注射器中，并至少再通过针头反复吹打2次。最后一次收集时，将含有肾小球的液体保留在注射器中，待准备通过90 µm筛网时再行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将液体保存于注射器中的同时，用1% BSA/PBS冲洗底部托盘并流入废液杯中，同时用1% BSA/PBS润湿90 µm筛网的顶部和底部。将筛网置于冰上的底部托盘表面。
	<ol>
		<li>将注射器中的样品施加到筛子的一边，并用另一支注射器的筒座如上所述将样品压过筛网。用底部托盘中的溶液冲洗，使所有物质聚集在筛子的一侧边缘。</li>
		<li>筛分完成后，参照步骤1.5.1，小心冲洗筛网底部。将接液盘中的全部液体收集至一个50 mL塑料锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1% BSA/PBS冲洗下层托盘，并将废液收集于废液杯中；用1% BSA/PBS润湿75 µm筛网的顶部和底部。将筛网置于冰上的下层托盘表面。
	<ol>
		<li>将样品加至筛网的一侧边缘。液体应能顺利通过。用至少20 mL的1% BSA/PBS从上方冲洗，滤液流入废液杯中。同时小心冲洗筛网底部。肾小球将保留在该75 µm筛网的上方。</li>
		<li>用HBSS通过倒置滤网冲洗，将肾小球收集至培养皿中。此步骤中可根据需要使用足量的HBSS。将收集物转移至一个或多个50 mL塑料离心管中，置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1800 × g 离心 5 分钟，用移液器小心去除上清液，并将沉淀重悬于 10 mL 冷的 HBSS 中。若在 1.7.2 步骤中收集了多个锥形管样品，则合并样品。重复离心步骤。</li>
	<li>将肾小球重悬于5 mL HBSS中，直至准备进行下一步操作。</li>
	<li>如有需要，可对肾小球总数进行计数。取10 µL样本，用移液器吸取后滴加至载玻片上，于显微镜下观察，计数视野中的肾小球数量，再乘以500，即得总产量。 
	注意：纯度可通过计数视野中可见的肾小管数量，除以肾小球和肾小管结构的总数来确定。应有 &#62; 视野中95%的肾小球。
	<ol>
		<li>如果存在明显的肾小管污染，请重复步骤1.6.1及后续步骤，并确保在完成步骤1.7.1时充分洗涤。此步骤最易发生肾小管污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肾小球损伤
<ol>
	<li>将肾小球收集到一个15 mL塑料锥形管中，在200 × g条件下离心。根据总产量用适量的HBSS重悬，使每孔约含9,000个肾小球。将450 µL样品加入24孔板的每个孔中，或根据后续实验需求选择其他合适的孔板格式。 
	注意：通过移液器反复吹打混匀肾小球悬液可确保溶液均匀。肾小球具有很强的黏性且密度较大，容易相互黏附，并迅速沉降至溶液底部及管壁。</li>
	<li>配制6 mg/mL的鱼精蛋白硫酸盐（PS）溶液时，首先将1 g PS溶解于10 mL加热至40 °C的去离子水（dH₂O）中，置于15 mL塑料锥形管内，充分涡旋混匀。取30 µL该溶液加入470 µL去离子水中。 
	注意：此操作可获得6 mg/mL的溶液；当按如下方法向孔中加入50 µL时，终浓度为0.6 mg/mL。
	<ol>
		<li>对一组孔中的每个孔平行加入50 µL鱼精蛋白硫酸盐溶液（即1:10稀释），另一组孔则加入50 µL HBSS作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将板在37 °C孵育4小时。</li>
	<li>将各孔内容物转移至微量离心管中，在4 °C、4000 × g条件下离心10–15秒，随后用1 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>吸除最后一次洗涤液，加入300 µL PBS重悬。将样品均分为三份，分别用于蛋白质提取、透射电子显微镜（TEM）观察和免疫荧光染色（IF）。</li>
</ol>
3. 准备肾小球以进行分析
<ol>
	<li>将三个等分试样的内容物离心（4000 × g，4 °C，10–15 秒），吸除残留缓冲液，随后通过透射电镜（TEM）、免疫荧光（IF）或蛋白质分离进行样品分析。</li>
	<li>透射电镜（TEM）样品制备
	<ol>
		<li>用 150 µL 冷的含 2.5% 戊二醛的 0.01 M PBS 固定肾小球沉淀物。使用巴斯德吸管小心移除固定液，注意不要破坏沉淀物，然后用 PBS 漂洗，并在含 1% 铁氰化钾的 1% 四氧化锇中进行后固定。</li>
		<li>通过梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%）和环氧丙烷进行脱水，随后包埋于环氧树脂包埋介质中。</li>
		<li>在超薄切片机上切取半薄切片（300 nm），用含 1% 硼酸钠的 0.5% 甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下观察。</li>
		<li>切取超薄切片（65 nm），用醋酸铀和 Reynold's 柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光（IF）样品制备
	<ol>
		<li>向样品中加入 150 µL 含 12% 明胶的 PBS 溶液，立即置于干冰上形成沉淀物。将沉淀物在微量离心管中浸泡于 500 µL 含 2% 多聚甲醛的 1× PBS 溶液中，4 °C 过夜。</li>
		<li>将沉淀物放入底模中，在干冰上加入最佳切割温度（OCT）包埋剂进行包埋。在恒冷切片机上切取 5–10 µm 切片，随后进行免疫荧光/免疫组织化学染色或常规组织学染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于蛋白质分离
	<ol>
		<li>向离心后的肾小球沉淀物中加入 150 µL RIPA 裂解缓冲液和 1.5 µL 蛋白酶抑制剂，使用玻璃匀浆器进行匀浆处理。</li>
		<li>进行蛋白质定量及免疫印迹或其他蛋白质分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这是一种利用廉价且可重复使用的设备，通过简单方案从大鼠肾脏中高效回收肾小球的方法。与所有实验操作一样，该方法在应用上也存在一定的局限性。首先，尽管我们获得的纯度超过&#62; 95%，但由于该方案依赖筛分原理，且起始材料本身存在杂质，因此无法完全排除所有污染物，培养物中仍会存在少量红细胞和偶见的肾小管片段。我们认为这些微量污染物在绝大多数应用中不会构成问题。第二，该筛分方案依赖于使用大鼠肾脏，其中肾小球的尺寸明显大于小鼠。若需获取小鼠肾小球，已有采用商用磁珠（例如，Dynabeads）的技术发表22。第三，已有研究表明，从分离的肾小球中检测到的某些特定mRNA（如纤溶酶原激活物抑制因子-1和I型胶原）几乎完全来源于肾小囊（Bowman's capsule），而非肾小球内细胞23。如果尝试从这些肾小球中进行mRNA提取，可能导致错误的结论。需要指出的是，在我们实验条件下，大多数肾小球已脱去肾小囊，因此应不会受到肾小囊成分的显著影响。第四，在培养条件下，细胞死亡相对较快地开始发生。
我们发现，凋亡程序在培养2小时时即被激活，表现为裂解型caspase-3的出现。这与先前的报道基本一致，已有研究通过DNA片段化、TUNEL染色和组织学分析证实，凋亡在分离后1–2小时内即开始发生24。然而，也应注意早期观察结果表明，分离并过筛的肾小球在培养至少3小时后仍可检测到代谢活性，提示在此时间点细胞仍具有较高的存活率16。尽管如此，基于我们的实验结果，我们认为为了获得最佳效果，应立即使用分离的肾小球进行后续实验。我们建议所有实验均应在72小时内完成，因为我们观察到超过该时间点后，整个肾小球结构开始出现退化。
相较于仅使用2个肾脏，起始时使用4-8个肾脏更容易获得较高的产量，因为部分肾小球会因粘附在各种筛网上而丢失；但一旦筛网表面完全被覆盖，便不会再有额外的损失。基于同样原因，在使用前需将筛网浸泡于BSA/PBS缓冲液中，以减少肾小球在干燥筛网上的粘附，并应尽量将组织接触限制在筛网的一个边缘。我们建议至少使用6个肾脏（3只大鼠）以获得合理的产量。
一些研究者已从分离的肾小球中获得了原代足细胞培养物，这些细胞在培养过程中倾向于从肾小球中迁移出来17。我们注意到，部分分离的肾小球会黏附于培养皿的塑料表面，并在较晚的时间点（分离后72小时）开始有细胞从肾小球结构中迁移出来。对这些细胞的研究超出了本分离方案的范围，且目前尚存争议：这些细胞究竟是足细胞、壁层上皮细胞，还是两者兼有15,25。值得注意的是，Mundel et al. 报道指出，从筛分获得的肾小球中收获的铺路石样细胞可在特定培养条件下被诱导分化为成熟足细胞26。关于细胞身份的某些混淆可能取决于分离的肾小球在筛分过程中是否保留包囊（包括含有壁层上皮细胞的鲍曼囊）或已被去囊。在我们的操作中，使用180、90和75 µm的连续筛网尺寸，导致大多数肾小球被去囊。
大多数蛋白尿性慢性肾病是由于肾小球通透性增加所致。一些研究者已采用分离的肾小球进行研究 离体 通透性实验。在一种方法中，通过改变周围介质的渗透压后肾小球体积的变化来估算通透性27最近，已有研究建立了一种方法，可通过定量分离出的肾小球中荧光探针的渗漏来测量通透性，并可在暴露于肾小球疾病实验模型的啮齿类动物中进行该检测。28.
我们注意到，在透射电镜制样过程中，有时会观察到足细胞足突从基底膜上脱离。我们认为这种情况在培养过程中并未发生，更可能是透射电镜样品制备过程中的假象。值得注意的是，即使出现此类现象，仍可清楚判断足突形态是&#34;正常&#34;还是已经足突融合。
总体而言，本方案提供了一种评估损伤后形态学和细胞变化的方法。我们预计，该技术可作为分离的足细胞培养的辅助技术，尤其适用于研究与细胞外基质或其他原代细胞类型相互作用的情况。该方法有望加深对蛋白尿性慢性肾病（CKD）的理解，从而提高未来针对这种致残性疾病开发治疗手段的能力。

肾小球是一团高度特化的毛细血管簇，负责循环血浆的滤过。它构成了肾单位的起始部分，而肾单位是肾脏的基本功能单位。肾小球的功能由三种结构共同决定：具有独特窗孔结构的毛细血管内皮、足细胞的裂孔隔膜以及位于两者之间的基底膜。这三层结构形成了一种半透性屏障，可选择性地允许物质进入滤液。通常情况下，水、离子及其他小分子可顺利通过，而较大分子则保留在血浆中。足细胞是一种特化的上皮细胞，它们在基底膜上延展，并以细胞质突起（称为足突）包绕毛细血管。相邻足细胞的足突相互交错嵌合，其间由裂孔隔膜连接，后者由nephrin、podocin、P-cadherin和ZO-1等蛋白质组成。1横切面上，这些足突在基底膜上呈均匀排列。在病变的肾小球中，足突变得明显异常或 &#34;消失的&#34; 导致血浆成分异常渗漏至滤过液中。因此，肾小球损伤通常表现为滤液中出现异常高水平的蛋白质（例如， 蛋白尿）和/或红细胞（例如， 血尿）出现在尿液中。此外，受损的足细胞会失去nephrin及其调控因子Wilms肿瘤1蛋白（WT1）的表达，而WT1是一种维持细胞分化状态的关键蛋白2,3肾小球是糖尿病肾病及其他肾小球肾炎（如微小病变性肾病、膜性肾病和局灶节段性肾小球硬化）损伤的主要靶点。这些疾病是进行性肾功能衰竭及终末期肾病发生的重要原因，后者是一种依赖透析或肾移植才能维持生命的疾病。因此，研究肾小球对于深入理解慢性肾脏病（CKD）的病理机制具有重要意义。
细胞培养系统对于研究肾小球生物学至关重要。由于足细胞在形成裂孔隔膜中起核心作用，且某些特定的蛋白尿疾病与裂孔隔膜蛋白的突变有关，因此大量研究合理地聚焦于分离状态的足细胞。这促使研究人员建立了可用于体外（in vitro）研究的原代足细胞系。这些细胞可在多种条件下培养，甚至可生长在可渗透性支持膜上以评估通透性4。然而，增殖细胞的分离过程往往筛选出已去分化的细胞&#160;，这些细胞丢失了部分足细胞标志物。为此，研究人员开发了条件性永生化足细胞，其来源于携带SV40大T抗原温度敏感型突变基因的转基因小鼠品系（例如 immortomouse），这类细胞既可在培养中增殖，又可在适当条件下诱导分化，表达全套足细胞标志物5。这些原代培养方法在理解足细胞生物学方面发挥了关键作用4,6,7。
然而，仅包含单一细胞类型的培养体系缺乏细胞间相互作用的关系 体内 以及支撑结构和基质，这些细胞的单层培养并不能完全模拟肾小球的三维结构。永生化足细胞的培养也可能繁琐且具有挑战性8，且需要拥有immortomouse或由已建立的研究者提供的起始细胞分装样本才能开始。此外，肾小球不仅包含足细胞，还包括毛细血管内皮细胞、基底膜以及为该结构提供支持的系膜细胞。因此，开发一种 离体 为所有研究者提供了一种可用于研究完整肾小球的方法，该方法可保留肾小球的天然结构及其构成正常肾小球的所有细胞。
1958年，Cook和Pickering首次描述了从兔肾中分离肾小球的方法。在观察到脂肪栓塞会滞留在肾小球后，他们推测相同大小的颗粒可用于特异性分离这些结构。事实上，将氧化铁颗粒灌注到肾脏后，这些颗粒会被肾小球捕获。通过对肾脏进行机械解离和筛分，再利用磁性分离法，即可完整且高纯度地分离出肾小球9。1971年，Misra证明可以省去氧化铁灌注步骤，直接通过筛分切碎的人、狗、兔或大鼠肾组织实现肾小球的分离10。此后，该技术根据研究者的目标进行了多种改进，但基本原理不变，最终均获得了可用于进一步研究或建立原代细胞培养的纯化肾小球样品11,12,13,14,15,16,17。
本文介绍一种从大鼠肾脏中分离完整且具有活性的肾小球的实验方案。整个流程仅需数小时即可完成。尽管肾小球不会增殖，但通过增加作为起始材料的肾脏数量，即可支持任意规模的实验设计。虽然已有发表的利用磁珠分离肾小球的方案，但这些方法需要静脉注射磁珠，成本较高，并且可能影响生物学特性，因为磁珠要么在培养过程中被肾小球滞留，要么需要通过离心进行肾小球的&#34;裂解&#34;并去除磁珠19。与小鼠肾小球相比，大鼠肾小球体积更大（两个月龄大鼠的肾小球直径接近100 µm18），因此使用简单的过筛技术即可更轻松地将其与其他肾脏结构分离。
作为其有效性的证据，我们对肾小球进行了表征，以展示其中不同类型的细胞。此外，还可将它们暴露于已知可损伤肾小球的试剂中 体内 我们展示了硫酸鱼精蛋白（PS）对这些培养物的不良影响。PS 是一种多聚阳离子，可中和肾小球毛细血管壁上的阴离子位点20这种中和作用对肾小球滤过屏障具有显著影响，因而会增加蛋白尿并导致足细胞足突融合。可通过免疫印迹检测nephrin和WT1等关键蛋白，以评估这些肾小球的整体健康状况。此外，还可利用光镜、免疫荧光显微镜和透射电镜对其结构进行评估。
总体而言，该方案对大多数研究人员而言均可行（仅需获得实验动物和一些简单设备即可）。由于形态学特征保持完好，研究人员能够分析肾小球，并观察肾小球内其他重要细胞类型及基质保存状况对功能和疾病进展的影响，而这是足细胞培养所不具备的优势。

<table><tbody><tr><td>溶液、化学品与实验动物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Envigo</td><td>207M</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>BP1605100</td><td></td></tr><tr><td>含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>MP Bio</td><td>ICN15197105</td><td></td></tr><tr><td>卡诺夫斯基固定液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMD</td><td>EM-PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Scigen</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>RIPA缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI78442</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin 抗体</td><td>Fitzgerald</td><td>2OR-NP002</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab89901-10ul</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR-&amp;beta; 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>#3169S</td><td></td></tr><tr><td>CD31 抗体</td><td>LSBio</td><td>LS-C348736</td><td></td></tr><tr><td>cleaved caspase-3 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9661S</td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812（Luft）环氧树脂</td><td>Polysciences</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛盘</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39999ON</td><td></td></tr><tr><td>180微米筛网</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39996ON</td><td></td></tr><tr><td>90微米筛网</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39990ON</td><td></td></tr><tr><td>75微米筛网</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39991ON</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>600 mL烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picofuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>50550226</td><td></td></tr><tr><td>20 号针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichart Ultracut</td><td></td><td></td><td>超薄切片机</td></tr></tbody></table>

一种高效筛分法从成年大鼠肾脏中分离完整肾小球

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

维持肾小球结构和功能的完整性对于预防肾小球肾炎至关重要。肾小球肾炎是一类以蛋白尿为特征的肾脏疾病，最终可能导致慢性肾病和终末期肾病。肾小球是一种复杂的结构，负责从体内滤过血浆。在疾病状态下，其结构完整性遭到破坏，导致血浆成分异常漏入尿液中。因此，建立一种在体外培养中分离和观察肾小球的方法，对研究此类疾病具有重要意义。本实验方案描述了一种高效获取成年大鼠肾脏中完整肾小球的方法，同时保留其结构和形态学特征。该方法可从每只肾脏获得高产量的肾小球，且其他肾单位节段的污染极少。利用这些肾小球，可通过与多种化学毒素共孵育来模拟损伤状态，例如硫酸鱼精蛋白可诱导动物模型中足细胞足突融合及蛋白尿。损伤程度可通过透射电子显微镜、免疫荧光染色和蛋白质印迹法进行评估。此外，还可检测这些培养物中nephrin和Wilms肿瘤1（WT1）的表达水平。由于该方案操作简便且具有良好的灵活性，所分离的肾小球可根据研究需求以所述方式或其他适宜方式加以利用，从而更深入地研究疾病状态下肾小球的健康状况与结构变化。

从安乐死到肾小球分离的整个方案可在短短2小时内完成，具有高通量和高效率的特点。若从8个大鼠肾脏开始操作，通过合理运用该技术，每个肾脏可获得6,000 - 10,000个肾小球。最终悬浮液中肾小球密度高，整体纯度 &gt; 95%，表明来自肾小管节段或其他细胞类型的污染极少（图1A, B）。此外，OCT包埋的肾小球可用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色 &amp; E）染色以观察形态（图1C）。这些肾小球在整个实验流程中均能保持其结构完整，即使经过处理后亦如此。我们证明，分离得到的肾小球含有结构完整且具有活性的足细胞（图2A），系膜细胞（图2B）以及内皮细胞（图2C).
分离后，可将肾小球暴露于已知的化学损伤中以模拟 体内 病理学。在此模型中，选择硫酸鱼精蛋白（PS）是因为其能够破坏肾小球滤过屏障的电荷，最终导致足细胞足突融合。经PS处理的肾小球中，nephrin（红色）显著减少，且WT1阳性（绿色）的细胞核数量增多 通过 免疫荧光图3A，B）。肾小球也可用于透射电子显微镜制样（图3C）。对照样本显示足细胞形态正常且具有足突结构，而PS处理的肾小球则出现足突融合现象（图3D），这是足细胞功能障碍的标志，在 体内 使用PS构建的模型21。这也对应于通过免疫印迹检测到的nephrin减少（图3E，F).
为评估细胞活力，采用活化型caspase-3作为凋亡的标志物。通过免疫荧光检测发现，活化型caspase-3在细胞分离后2小时开始在少数细胞中出现（图4）。表达该蛋白酶的细胞数量随时间逐渐增加，在24小时和48小时达到最高水平。这表明凋亡在培养早期即已发生，因此为获得最佳结果，建议在细胞分离后尽快开展后续实验操作。
<img alt="组织学：显微镜下的肝脏组织；细胞结构分析；显微图像；可见标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1大鼠肾小球培养物分离后的典型形态。 (A肾小球培养的明场图像。尽管我们在此显微照片中选择了一个仅含一条肾小管的视野（箭头所示），但通常获得的培养结果 &gt; 95% 纯度。比例尺等于 100 µm. (B单个肾小球的放大图像。C) 单个肾小球的苏木精和伊红染色。B 和 C 中的比例尺等于 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示肾小球中nephrin、WT1、PDGFR-β、CD-31表达的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2。分离的肾小球中保留了组成性细胞类型。 通过共聚焦免疫荧光显微镜检测nephrin（红色，足细胞）及细胞特异性标志物，以鉴定足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞。(A) nephrin与WT1（绿色，足细胞）的共染色。(B) nephrin与PDGFR-β（绿色，系膜细胞，箭头所示）。(C) nephrin与CD31（绿色，内皮细胞，横切面血管由箭头标示）。所有图中比例尺 = 25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜与透射电镜观察nephrin WT1，对照组与硫酸鱼精蛋白处理组；nephrin蛋白印迹分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 可诱导足细胞损伤 体外 使用分离的大鼠肾小球。 (A) 未处理肾小球培养物中nephrin和WT1的共聚焦免疫荧光显微镜图像。可见线性nephrin染色（红色）以及WT1阳性细胞核（绿色），这通常是健康足细胞存在的典型表现。B经鱼精蛋白硫酸盐处理后，nephrin 表达减少且呈非线性分布，WT1 缺失，提示足细胞损伤。C透射电子显微镜（TEM）图像，显示典型的正常肾小球结构，包括足细胞突起、基底膜和有孔的内皮细胞。标尺=500 nm。D) 经鱼精蛋白硫酸盐处理后，足细胞足突伸长或消失（箭头所示），提示足细胞损伤。E) 西部印迹法检测足细胞蛋白nephrin，显示硫酸鱼精蛋白处理后nephrin表达降低。F) 西部印迹实验的肌动蛋白上样对照结果如图所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="48小时内裂解型Caspase-3与Nephrin的荧光显微图像；细胞凋亡进程分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4．分离肾小球中细胞活力的评估。 进行了裂解型caspase-3（绿色）的共聚焦免疫荧光显微镜检测。同时对nephrin进行共染色，以便于定位肾小球。在肾小球分离后0 h和1 h时，未观察到裂解型caspase-3阳性信号；但在2 h时，少数细胞中已可检测到荧光信号。随着分离后时间的延长，阳性细胞数量逐渐增多。在24 h和48 h时观察到最多数量的caspase-3阳性细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案的主要目的是高效分离出具有活性的原代肾小球细胞，且污染物最少，可用于多种后续实验应用。分离得到的肾小球保留了其组成细胞类型之间的结构关系，并可进行培养 离体 短暂地。

维持肾小球结构与功能对于预防肾小球肾炎至关重要，肾小球肾炎是一类以……为特征的肾脏疾病。

该方法有助于解答肾脏疾病领域中的关键问题，特别是在理解肾小球在正常和疾病状态下的功能方面。由于肾小球包含多种细胞类型且具有独特的结构，其生物学研究往往较为困难。该技术的主要优势在于利用简单的方法和设备即可获得完整的肾小球，来源便捷。该技术对理解正常及病变肾脏中的滤过屏障具有重要意义。特别是，该技术有助于深入认识蛋白尿性慢性肾病，此类肾病中肾小球损伤会导致血清蛋白异常大量地分泌进入尿液。通常，初次使用该技术的研究人员在最终样本中难以获得足够的产量和纯度。本实验操作将由本实验室的技术员 Brittney Rush 进行示范。首先，使用毛发剪刀去除已实施安乐死的大鼠腹部前侧的毛发。使用70%乙醇清洁暴露的皮肤。然后用手术剪在皮肤上做一条正中切口。为暴露内脏器官，需通过肌肉层做一条正中切口。找到肾脏并分离，放入含有30毫升置于冰上的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的无菌50毫升塑料离心管中。将该管置于冰上，转移至无菌细胞培养操作台。将肾脏转移至含有5毫升置于冰上的HBSS的无菌培养皿中。使用剪刀和锐利的镊子去除并弃去肾周脂肪。为去除并弃去包绕肾脏的包膜，先做一个小的浅表切口，然后用锐利的镊子轻轻将其从肾脏上剥离。将肾脏置于第二个培养皿中的无菌纱布上，该培养皿内含5 mL HBSS，并通过正中矢状面切口将每个肾脏切成两半。使用手术刀去除并弃去髓质，髓质可通过其较深的颜色和中心位置进行识别。将主要含有肾皮质的剩余组织块转移至第三个培养皿中，该培养皿内含有 5 mL HBSS。使用无菌剃刀片将组织切碎，直至组织块大小小于 1 mm 或形成糊状物。使用 1% BSA PBS 润湿置于 500 毫升废液杯上方的 180 微米筛网的顶部和底部。此步骤至关重要，因为它可在筛网上形成蛋白质包被，减少肾小球的黏附，从而提高得率。将混合的皮质组织置于筛网的一小边缘处。使用10毫升一次性注射器的带纹路推杆法兰，将组织碾压过筛，滤入置于冰上的底部容器中。定期用HBSS冲洗，尽量减少用量以避免样品稀释，并重复使用底部容器中收集的液体来冲洗筛网。完成筛分后，从容器底部取HBSS小心冲洗筛网底部，以收集任何松散附着的肾小球。将底部培养皿中的所有液体分装至配备20号针头的10毫升注射器中。将液体至少通过针头反复推注三次至底部培养皿中。最后一次收集时，将含有肾小球的液体保留在注射器内，直至准备通过90微米筛网。同时，用1% BSA PBS冲洗底部烧杯并将其排入废液杯中。用1% BSA PBS润湿90微米筛网的顶部和底部，然后将其放置在底部烧杯的上方。将注射器中的样品加至筛网的一侧边缘。使用带有纹理的活塞边缘，像之前一样将组织压过筛网。用底部托盘中的溶液冲洗组织，并从筛网的一侧收集全部物质。筛分完成后，从托盘中取HBSS缓冲液，小心冲洗筛网底部，以收集可能松散附着的任何肾小球。将底部托盘中的所有液体收集到一个50毫升的塑料锥形管中。使用1% BSA PBS将底部托盘冲洗至废液杯中。然后使用1% BSA PBS润湿75微米筛网的顶部和底部。将筛子置于放置在冰上的底部容器上方。将样品加至筛子的一侧边缘，使液体易于流过。用至少20毫升含1% BSA的PBS冲洗筛子顶部，流入废液杯中，并小心清洗筛子底部。为收集残留在75微米筛网上方的肾小球，将筛网倒置，用适量的HBSS冲洗，将肾小球收集至培养皿中。将过筛后的肾小球转移至一个50毫升塑料离心管中，并置于冰上。在4°C条件下以1800 × g离心5分钟，随后用移液器小心吸除上清液。将沉淀重悬于10毫升冷的HBSS中。合并样品并重复离心。将肾小球重悬于5毫升HBSS中。为了计数总肾小球数量，取10微升样品滴加到载玻片上，在显微镜下计数，并乘以500，得到总产量。分离出的结构应几乎全部为肾小球，不含肾小管结构。如果存在肾小管且可能影响后续实验应用，可将全部样品通过90微米筛网过滤，并从此步骤开始重复实验流程。本方案在分离肾小球方面效率较高，最终悬浮液中肾小球密度高，纯度超过95%，且极少受到肾小管节段或其他细胞类型的污染。这些肾小球可用苏木精和伊红染色以观察其形态结构。此外，即使经过处理，肾小球在整个实验过程中仍能保持其原有结构。它们保留了完整且具有活性的足细胞、系膜细胞和内皮细胞。分离的肾小球已暴露于化学损伤中，以模拟体内病理状态。具体而言，硫酸鱼精蛋白可破坏肾小球滤过屏障的电荷。与健康的肾小球不同，经硫酸鱼精蛋白处理的肾小球显示出肾单位数量显著减少，以及WT1阳性细胞核数量明显下降。在透射电子显微镜下观察，健康的肾小球可见典型的足突结构；而经硫酸鱼精蛋白处理后，足突出现拉长或消失，提示足细胞受损。为了确定分离出的肾小球中细胞的存活率，将活化的caspase-3作为细胞凋亡的标志物进行观察。在肾小球分离后0小时和1小时时，未检测到活化的caspase-3。在2小时和4小时时，少数细胞显示出凋亡迹象，并随着时间推移呈进行性增加。凋亡细胞数量在24小时和48小时时最多。根据这些结果，我们建议分离出的肾小球在分离后应立即用于大多数实验。进行此操作时，务必快速且高效地完成。从肾脏被分离的那一刻起，肾小球便开始退化。肾小球分离得越快，留给后续实验操作、分离与处理的时间就越充裕。分离后，可将获得的肾小球暴露于化学或生物试剂中，以诱导生理或病理状态。并且可以对样本进行处理，用于蛋白质或RNA提取、组织学、免疫荧光以及电子显微镜分析。自20世纪50年代该技术发展以来，已帮助研究人员深入研究肾小球生物学。总体而言，本实验方案提供了一种评估正常和疾病状态下完整肾小球形态学及细胞特征的方法。该方法有助于我们理解蛋白尿性慢性肾病，并促进未来治疗方法的开发。

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本文描述了从表达热敏型猿猴病毒40和光激活线粒体PhAMexcised的转基因小鼠肾脏中分离条件性永生化肾小球内皮细胞的方法。我们介绍了使用微珠从完整肾脏中分离肾小球、消化步骤，以及CD31阳性肾小球内皮细胞（GECs）的接种和培养过程。...

分离带有荧光线粒体的条件性永生小鼠肾小球内皮细胞

本研究提供了一套易于使用、完整且简便的方法，用于标记和分析经CUBIC透明化处理的小鼠肾脏中的肾小球。利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜（LSFM）或常见的共聚焦显微镜，结合Imaris等软件，可轻松、可靠地获取肾小球数量和体积等数据。...

一种高效快速的小鼠肾小球标记与分析方法

本研究建立了一种优化的小鼠系膜细胞（MCs）分离方案及其 离体...

优化小鼠肾小球系膜细胞的分离与纯化

学习使用筛分法从成年大鼠肾脏中高效分离完整型肾小球，纯度超过95%。该方法为研究肾脏疾病机制和蛋白尿性慢性肾病提供了可靠的实验工具。

一种高效筛分法从成年大鼠肾脏中分离完整肾小球

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