酿酒酵母间歇培养中的指数生长动力学分析呼吸和发酵代谢

这种方法可以帮助回答生物技术和生物医学领域的关键问题，例如沃堡效应和蟹树效应背后的分子基础是什么。该技术的主要优点是，它允许高通量研究某些物质在呼吸和发酵代谢中的作用。首先接种含有三毫升冷却、无菌 2%酵母提取物肽葡萄糖或 YPD 肉汤的 15 毫升圆锥形管，其中 250 微升的 S.cerevisiae 酵母细胞保存在负 20 摄氏度的甘油中。

在30摄氏度和200转/小时的轨道摇床中孵育酵母。条纹到 60 毫升， 2% Ypd 阿加填充的彼得里菜第二天早上。在30摄氏度下培养菜，直到观察到孤立的菌落。

然后在含有10毫升冷却、无菌2%YPD肉汤的新锥形管中接种单个隔离菌落，在30摄氏度下进行夜间培养，并摇动。对于微孔板生长曲线设置，在无菌的 10-10 孔微孔的每孔中加入 145 微升适当的实验培养介质，并接种每孔的 5 微升过夜培养。然后在30摄氏度的微孔板读卡器中孵育多孔板，在200 rpm下持续搅拌48小时，每30或60分钟测量600纳米的光学密度。

对于摇动锥形烧瓶生长曲线设置，接种含有 4.8 毫升适当无菌培养基的 20 毫升圆锥形烧瓶，用 200 微升的预接种培养基，光学密度为 600 纳米，光密度为 2，在 30 摄氏度和 250 rpm 时孵育。每分钟 250 转的搅拌对于实现低浓度碳源的合适生长至关重要，因为我们已经观察到，在呼吸条件中，酵母生长在较低的搅拌速度下减少。为了在24小时内每两小时以600纳米测量光学密度，在900微升蒸馏水中稀释100微升的摇锥形烧瓶，用一毫升分光度计将光度计混合，然后通过移液器轻轻混合。

对于数据处理，在适当的统计包软件中，创建新的项目文件，打开新的表和图形菜单，然后选择 XY。在示例数据菜单下，选择从空数据表和点以及连接线图开始。在子列中为复制或错误值保留未选择的 X 节。在 Y 部分中，选择在并排子列中输入 10 个复制值，并绘制均值和误差 SD。然后单击”创建”。

输入在 X 列中获取 OD 测量的时间以及从 Y 列中的区域性获取的 OD 值。要确定将 Y 列数据转换为对数的指数增长阶段，请单击”分析”并选择变换分析。使用 Y 等于日志 Y 选择 Y 值并打开结果库。

选择变换数据表，单击分析，并选择线性回归分析，通过选择表中的值和抑制控件和 E.In 数据表库，选择数据一个表并单击分析，排除不遵循线性趋势的光学密度值。选择要分析的非线性回归曲线拟合分析和数据集，然后单击”确定”。然后对数据应用适合的最少正方形，使插值部分未选中，然后单击”确定”。接下来，打开一个新的项目文件，并在新的表和图形菜单中，选择列选项，从空数据表和所需的图形开始。设置图形以绘制具有标准偏差的平均值，然后单击”创建”。

从结果库中的非线性拟合结果表中复制均值或增量时间值，然后将数据粘贴到列中。最后，点击分析并选择列分析菜单中感兴趣的分析，比较不同营养条件的动力学参数。生长动能阈值因强度而异，必须根据我们在分析中使用的条件进行评估。

表现出发酵表型的培养物具有小滞后阶段和高增长率的指数相。主要通过氧化磷酸化获得能量的培养物在指数阶段表现出较长的滞后阶段，生长速度缓慢。使用指数增长方程计算增长曲线的特定增长率和倍增时间，可以设置呼吸和发酵生长值的阈值。

例如，在这些具有代表性的实验中，不同白藜芦醇浓度对S.cerevisiae BY4742细胞的影响揭示了细胞能量状态对不同葡萄糖浓度的反应的改变。在这里，补充10%葡萄糖表明，低浓度的铵有利于发酵代谢，这些培养物的延长指数生长阶段就证明了这一点，而较高的浓度则诱发回发酵代谢，在指数阶段的延长滞后阶段和生长速度较慢就证明了这一点。最后，在相同条件下生长的这两种不同酵母菌株之间，可以观察到发酵加倍时间值的显著差异，这突出了验证所分析的每个菌株的倍增时间阈值的必要性。

在尝试此过程时，重要的是要记住，此协议仅用于筛选表型。对呼吸和发酵的具体影响必须分别通过耗氧测定或发酵副产品的积累来确认。