Name: 研究年龄相关的基因组不稳定性使用 S。酵母年代的寿命模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解如何使用酿酒酵母时序寿命模型结合DNA突变检测方法研究年龄相关的基因组不稳定性。该技术通过定期采样和菌落形成单位分析评估细胞活力，并将突变频率标准化以揭示衰老过程中的DNA损伤变化。

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感谢 S. Jinks Robertson 和 E. Heidenreich 提供质粒和酵母菌株；感谢 P. Pham 和 M.F. Goodman 在跨损伤合成（TLS）实验方面的帮助。本工作部分由美国衰老研究联合会资助项目以及 NIH AG20642、AG025135 支持。

研究 S. cerevisiae 衰老过程使用了两种寿命模型：RLS 和 CLS。复制性（出芽）寿命（RLS）基于酵母母细胞进行有限次数分裂的观察结果3-6。本文将重点介绍时间性寿命（CLS），该模型基于非分裂酵母在液体培养基或平板上随时间推移的存活情况7-11。野生型酵母在合成葡萄糖完全培养基（SDC）中呈指数生长约10-12小时。当葡萄糖水平降低时，酵母从发酵代谢转变为呼吸代谢，这一过程称为双相生长转换（diauxic shift）。细胞在双相生长后期继续缓慢分裂，持续约48小时，随后进入G0期停滞。细胞的代谢速率在接种后第5-6天（接种日为第0天）仍保持较高水平。通过每隔两天取样测定时间性衰老细胞中能够退出G0期停滞并在富含营养的YPED平板上形成菌落的细胞百分比，可评估细胞随时间变化的存活率。
1. 液体培养中酵母的时序性寿命（CLS）
<ol>
	<li>挑取单个菌落接种于1 ml合成完全葡萄糖培养基（SDC，表1）中，30°C、220 rpm振荡培养过夜。每种菌株应独立接种三个来自不同菌落的接种物，以提供生物学重复。</li>
	<li>将过夜培养物按OD=0.05–0.1（约1:100稀释）转接至新鲜SDC培养基（通常为10 ml）中，30°C、220 rpm振荡培养。此时间点定义为时间性衰老实验的第0天。培养液体积与摇瓶容量之比应保持1:5（如10 ml培养液使用50 ml摇瓶，或对于较长时间或大规模实验使用25 ml培养液配125 ml摇瓶），以确保充分通气。</li>
	<li>从第3天开始，从摇瓶中取出两份10 μl样品，用灭菌水稀释10,000倍，取10 μl稀释后的培养物（即104-10）涂布于YEPD平板（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂），30°C培养48–72小时后计数菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>第3天的CFU计数定义为100%存活率。后续各天的衰老培养物稀释倍数应相应调整，以确保CFU测定中获得约20–100个菌落（例如104-10、104-30、103-10等）。对于DBY746遗传背景的野生型细胞，其时序性寿命（CLS）在第11天左右达到1%存活率。</li>
</ol>
变异 原位 活力测定包括：
<ul>
	<li>通过限制葡萄糖实现热量限制（CR）。将过夜培养物稀释至葡萄糖受限的SC培养基中（例如使用0.5%或0.05%葡萄糖，而非标准的2%葡萄糖），通常会导致第3天的群体饱和密度降低，但平均寿命和最大寿命（10%存活率）显著延长12。</li>
	<li>对于极端热量限制/饥饿处理，将第3天的静止期培养物（通常为10 ml，如上文步骤3所述）用高压灭菌水洗涤（将细胞重悬于等体积水中，2500 rpm离心5分钟，重复3次）。在水中孵育细胞可模拟酵母在自然环境中可能遇到的饥饿状态。此后每两天，应将衰老培养物用高压灭菌水洗涤，并重悬于等体积水中，以去除裂解死亡细胞所释放的营养物质。按照上述方法取样进行活力测定。该饥饿条件可使野生型DBY746菌株的平均CLS几乎延长一倍12。</li>
</ul>
2. 原位 活力检测
在液体培养中，少量存活细胞可能重新进入细胞周期，利用培养基中残留的营养物质或由裂解死亡细胞释放的营养物质进行生长，该表型称为再生长/喘息现象13我们开发了一种基于平板的活力检测系统，利用DBY746菌株（trp1）的营养缺陷型特性，以避免细胞再生或濒死复苏问题，同时可检测持续暴露或缺乏不同外界营养物质或刺激因素对酵母复制寿命（CLS）的影响。11。这一点 原位 活力检测同样模拟了复制性寿命模型，使细胞在整个寿命分析期间持续暴露于充足的营养环境中。
<ol>
	<li>挑取单克隆接种于1 ml合成完全葡萄糖培养基（SDC）中，于30°C、220 rpm振荡条件下过夜培养。每种菌株应至少制备三个来自独立克隆的接种物，以提供生物学重复。</li>
	<li>使培养物生长至约108个细胞/ml（OD600≈10），用灭菌水将培养物稀释至每10 μl含100–200个细胞（通常为104倍稀释）和每10 μl含1,000个细胞（103倍稀释）。</li>
	<li>取两份10–30 μl稀释后的培养物，分别点种于一块色氨酸缺失SDC平板上。每种菌株准备8至20块平板，并根据点种密度进行标记（例如，104倍稀释，点样10 μl或104-10、104-30、103-10、103-30等），以确保平板上可计数的菌落数在10–100之间，为衰老过程中活力下降预留空间。</li>
	<li>将平板组置于30°C持续培养，直至寿命分析结束。</li>
	<li>在点种当天及之后每隔2天，取出一块平板，逐滴加入0.5 ml色氨酸溶液（2 mg/ml），使有活力的细胞得以生长。将平板继续在30°C培养额外48–72小时。在添加色氨酸当天计数菌落形成单位（CFU）以评估细胞活力。点种当天的CFU记为100%存活率。</li>
</ol>
变异 原位 活力测定包括：
<ul>
	<li>在琼脂平板上对细胞进行老化处理（极端饥饿条件）。在后续天数中加入 1 ml 2x YPED 以替代色氨酸，以促进生长并进行菌落形成单位（CFU）计数14。</li>
	<li>在含有色氨酸缺失的完全合成培养基的平板上对细胞进行老化处理，培养基中添加不同碳源，例如不同浓度的葡萄糖（通过限制葡萄糖实现热量限制），或乙醇、甘油、乙酸等其他碳源14。加入 1 ml 葡萄糖/色氨酸溶液（20% 葡萄糖和 1 mg/ml 色氨酸），以促进生长并进行 CFU 计数。</li>
	<li>其他营养成分的调控，例如氮源的调控。</li>
</ul>
3. 时序性衰老过程中的DNA损伤与突变频率
刀豆氨酸抗性（Canr）与 can1 基因测序 
可通过测定时间老化培养物中刀豆氨酸抗性（Canr）的频率来评估自发突变频率。编码质膜精氨酸透性酶的 CAN1 (YEL063) 基因发生突变后，会使细胞对精氨酸类似物 L-刀豆氨酸产生抗性。在不同时间点收集的 Canr 菌落还可保存用于提取基因组 DNA，并对 CAN1 基因进行后续测序，从而获得突变谱数据（使用 Mutation Surveyor，SoftGenetics）。
碱基替换（Trp+ 回复突变）
含有 trp1-289 的菌株在 TRP1 编码序列中存在琥珀突变（C403T）。通过测定 trp1-289 回变为 Trp+ 的频率15，可估算酵母时序性衰老过程中的碱基替换率。
移码突变
Lys- 菌株 EH150（MATa, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o）携带一个 lys2ΔBglII 突变，该突变通过在 LYS2 基因中插入 4 个核苷酸以构建 BglII 限制性内切酶位点而获得。由此导致的开放阅读框 +4 位移引起赖氨酸营养缺陷型，该表型可通过小片段插入/缺失突变得以回复16-17。
染色体大片段重排（GCRs）
为了检测染色体的大规模重排（GCRs），我们构建了一种突变菌株，其中编码功能高度冗余的己糖转运蛋白的HXT13（YEL069）基因被一个URA3表达盒所中断18。HXT13位于第V号染色体上CAN1基因端粒侧7.5 kb处。CAN1和URA3基因的突变分别使细胞对L-刀豆氨酸和5-氟乳清酸（5FOA）产生抗性。鉴于同时在这两个基因中发生点突变的频率极低，对Canr 5FOAr表型频率的分析可用来估算导致这两个基因同时丢失的染色体大片段重排事件的发生率。
同源与同祖重组
为了在时间性衰老过程中监测同源（100%）和异源同源（91%）重组的水平，我们构建了含有线性化质粒（HIS3::intron-IR-URA3）的突变体，这些质粒在HIS3位点携带100%同源的反向重复序列（IRs）（pSR406）或91%异源同源的反向重复序列（IRs）（pSR407）19。反向重复序列之间的重组可使有功能的His3蛋白得以表达。
<ol>
	<li>在进行常规活力检测（如上所述）的同时，从衰老培养物中取出适量细胞，
	<ol>
		<li>检测Canr突变时，取约2×107个细胞（第3天培养物200 μl）；</li>
		<li>检测Trp+回复突变时，取约108个细胞（第3天培养物500–1000 μl）；</li>
		<li>检测Lys+移码突变时，取约108个细胞（第3天培养物500–1000 μl）；</li>
		<li>检测GCRs时，取2–3×108个细胞（第3天培养物2–3 ml）；</li>
		<li>检测同源与异源重组时，取约5×107个细胞（第3天培养物200–500 μl）；</li>
	</ol>
	根据细胞总活力下降程度及在时间性衰老过程中突变频率的上升情况调整涂板量（表2）。若菌株具有超突变表型（如DNA修复缺陷菌株），应相应减少取样量。</li>
	<li>使用台式离心机离心收集细胞（6000 rpm，5分钟）。</li>
	<li>将细胞重悬于1 ml经高压灭菌的水中，再次离心收集细胞。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于100 μl水中，涂布细胞，
	<ol>
		<li>检测Canr突变时，涂于缺乏精氨酸的完全合成培养基平板（SDC-Arg，添加60 μg/ml硫酸L-刀豆氨酸）；</li>
		<li>检测Trp+回复突变时，涂于缺乏色氨酸的平板（SDC-Trp）；</li>
		<li>检测Lys+移码突变时，涂于缺乏赖氨酸的平板（SDC-Lys）；</li>
		<li>检测GCRs时，涂于缺乏精氨酸的平板（SDC-Arg），并添加5FOA（1 mg/ml）和硫酸L-刀豆氨酸（60 μg/ml）；</li>
		<li>检测同源与异源重组时，涂于缺乏组氨酸并添加半乳糖（2%）的平板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在30°C培养3–4天后计数CFU。突变频率以活细胞数量为基准进行归一化处理。</li>
</ol>
与……相辅相成的 原位 活力测定，年龄依赖性Trp+ 回复，Lys+ 移码突变，重组，或 Canr 也可在培养皿上培养的老化细胞中进行研究。
<ol>
	<li>将细胞（约108个细胞/板）接种至Trp-、Lys-、His-缺失或含L-刀豆氨酸的合成完全培养基平板上（如上所述）。</li>
	<li>每隔两天（或在感兴趣的特定时间点），计数新出现的菌落。</li>
	<li>通过将新出现的菌落数量标准化至当天的活细胞总数，估算突变频率。</li>
</ol>
4. 跨损伤合成（TLS）
年龄依赖性突变频率的增加可能涉及大分子损伤的累积、细胞保护与修复能力的下降，以及衰老过程中DNA修复错误的增加（例如依赖Polζ的跨损伤合成，TLS）。例如，长寿的 sch9Δ突变体表现出升高的表达水平 SOD2，以及易错DNA修复酶表达降低 Rev120. 本文介绍了一种结合损伤DNA模板与全核提取物的实验方法，用于评估跨损伤合成（TLS） 体外.
<ol>
	<li>按照 Wang 所述方法制备核提取物 等.21使用BCA法（Pierce）测定蛋白质浓度。</li>
	<li>向含有 TLS 缓冲液（20 mM HEPES，7 mM MgCl₂）的 50 μl（终体积）反应体系中加入 0、5、10 或 20 μg 的核提取物2，1 mM DTT，25 mM NaCl，pH 7.8），200 μM dNTPs 和 100 nM 5'-32P标记的12-mer引物（5'-CGA TGG TAC GGA-3'）与含有目标DNA损伤的48-mer模板退火（5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3'，其中X为损伤位点，如无碱基位点、8-oxo-G等）。</li>
	<li>在30°C下孵育混合物30分钟，加入2.5 μl EDTA（20 mM）和2 μl蛋白酶K（10 mg/mL）以终止反应。</li>
	<li>使用酚抽提和乙醇沉淀法纯化DNA。</li>
	<li>将DNA重悬于50 μl上样缓冲液（98%甲酰胺，20 mM EDTA，含染料）中。</li>
	<li>在19%聚丙烯酰胺凝胶上分离跨损伤合成产物。</li>
	<li>使用磷屏成像技术对 TLS 进行定量分析（图1).</li>
</ol>
5. 代表性结果
在标准的液体CLS分析中，我们通常将第3天的CFU计数作为100%存活率。后续各天的存活百分比可用于拟合计算平均寿命（50%存活率）和最大寿命（10%存活率）。12寿命结果来自 原位 活力检测的结果通常与液体CLS检测结果一致，但平均寿命有所缩短，部分原因在于细胞持续暴露于营养物质中。葡萄糖的存在会抑制细胞保护活性，这一点通过应激反应转录因子（如Msn2/4和Gis1）的转录激活能力降低得到证实。12.
突变频率随年龄的变化因菌株背景、遗传操作、培养条件和年龄而存在显著差异。表2展示了野生型菌株（DBY746）中获得的典型结果。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				组分</th>
			<th>
				g/L</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫酸铵</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氮源基础（-AS/-AA）</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>腺嘌呤</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-精氨酸</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-天冬氨酸</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酸</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-组氨酸</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-异亮氨酸</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-亮氨酸</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-赖氨酸</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-甲硫氨酸</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苯丙氨酸</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-丝氨酸</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苏氨酸</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-色氨酸</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-酪氨酸</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-缬氨酸</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尿嘧啶</td>
			<td>80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 合成完全葡萄糖培养基 SDC（用 NaOH 调节至 pH 6.0）。添加4倍过量的组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，以补偿 DBY746 菌株的营养缺陷型需求。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				 </th>
			<th>
				第3天（均值 ± 标准误）</th>
			<th>
				老化期间最高值</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canr</td>
			<td>1.76 ± 0.12 x10-6</td>
			<td>6-8 x10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trp+ 回复突变</td>
			<td>6.60 ± 1.70 x10-8</td>
			<td>1.60 x10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys+ 移码突变</td>
			<td>3.00 ± 0.78 x10-8</td>
			<td>0.70 x10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCRs</td>
			<td>0.62 ± 0.10 x10-8</td>
			<td>0.30 x10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>同源重组</td>
			<td>5.55 ± 2.74 x10-6</td>
			<td>27.00 x10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>异源同重组</td>
			<td>0.12 ± 0.04 x10-6</td>
			<td>0.48 x10-6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2。野生型细胞（DBY746）在时间性衰老过程中的典型突变频率。
<img alt="DNA电泳分析、无碱基损伤影响、遗传比较、条带模式结果" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 跨越损伤合成（TLS）20的结果。将3日龄静止期的野生型（DBY746）和sch9Δ突变体细胞的核提取物分别与未受损或含有无碱基位点的DNA模板在30°C下孵育30分钟。TLS产物由实线（使用未受损模板）或虚线（使用受损模板）指示。sch9Δ突变体的核提取物中未观察到任何跨越损伤合成活性。游离引物由空心箭头指示。

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

液体老化培养物有时会表现出再生长/喘息表型13，这会使复制性寿命（CLS）分析变得复杂。当超过90–99%的细胞群体失去活力时，通常会发生再生长。该表型常与细胞内氧化应激增加和/或保护能力下降相关。例如，在缺乏细胞质超氧化物歧化酶的细胞中，该表型出现频率增加一倍以上；而在长寿突变体（如 sch9Δ 或 ras2Δ）或超氧化物歧化酶过表达的突变体中，该表型则显著减少22。在实际操作中，我们将再生长定义为在时序性老化过程中的高死亡率阶段，连续三次取样时细胞活力出现上升或稳定的现象。
不同DNA突变的发生频率随年龄变化，其变化程度显著依赖于菌株背景、遗传操作、培养条件以及再生/喘息现象和极低的存活率。在进行大规模寿命分析之前，应预先在平均存活期和最大存活期等时间点，采用不同涂布密度进行突变检测的预实验，以确定突变频率的范围。在寿命或突变频率研究中，应始终平行设置野生型菌株，以便校正实验间的变异。研究中应包含多个生物学重复；同时应进行液体培养和原位（in situ）存活率/突变检测，以相互验证实验结果。
与其专注于某一种特定类型的DNA突变，不如结合多种检测方法对与年龄相关的基因组不稳定性进行综合分析，这有助于揭示导致年龄依赖性基因组不稳定的特定DNA损伤类型及DNA损伤修复系统。例如，在野生型酵母中观察到，相较于其他类型的DNA突变，大片段染色体重排（GCRs）显著增加，提示在酵母的时序性衰老过程中，双链断裂水平升高和/或非同源末端连接（NHEJ）功能受损（表2）。对野生型衰老酵母中can1突变谱（CAN1基因测序）的分析表明，时序性衰老过程中氧化性DNA损伤增加，并伴随易错DNA修复；而在长寿的sch9Δ突变体中，则观察到氧化性DNA损伤减少，且易错的跨损伤合成显著降低20。
此处描述的方法可进一步扩展用于研究与年龄相关的基因组不稳定性。例如，可采用Allen et al.23所述的密度梯度法，从酵母静止期培养物中分离静止态和非静止态细胞。结合本文所述的突变检测方法，我们已报道，大部分与年龄相关的突变来源于静止态细胞，而非分裂中、受损或凋亡的细胞20,24。

使用 s. cerevisiae 时序寿命模型研究年龄依赖性基因组不稳定性

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

利用 Saccharomyces cerevisiae 衰老模型的研究已揭示了在高等真核生物中部分保守的寿命调控通路1-2。酵母衰老模型的简洁性与强大功能也可用于研究衰老过程中DNA损伤与基因组维持，以及它们在衰老相关疾病中的作用。本文介绍了一种结合酵母时序性寿命与简单的DNA损伤和突变检测方法的系统，用于研究年龄依赖性的DNA突变，包括碱基替换、移码突变、大规模染色体重排以及同源/异源重组，同时评估核DNA修复活性。本文所述方法将有助于鉴定调控基因组不稳定性以及哺乳动物中年龄依赖性DNA突变和癌症发生机制的相关基因/通路。

本文介绍了一组DNA突变检测方法，这些方法可与酵母时序性寿命模型相结合，用于研究在衰老过程中调控或导致基因组DNA不稳定的基因/通路。

使用 S. cerevisiae 时序寿命模型研究年龄依赖性基因组不稳定性

利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）衰老模型开展的研究已揭示出部分在更高等真核生物中保守的寿命调控通路1-2。

本实验的总体目标是通过将酵母的时序性寿命测定与一系列简单的DNA损伤和突变检测方法相结合，研究年龄依赖性的基因组不稳定性。首先，每两天取样一次时序性衰老培养物，并通过菌落形成单位（CFU）测定细胞活力。接下来，取衰老培养物样品，将细胞涂布于特定突变筛选培养基上，以检测DNA突变情况。最终，可通过将突变检测结果归一化至细胞活力，获得酵母时序性衰老过程中DNA突变变化的结果。该方法有助于回答衰老研究领域中的关键问题，例如衰老与基因组不稳定性之间关联的机制。为检测酵母时序性寿命（CLS），首先将单个酵母菌落接种至1毫升合成完全葡萄糖（SDC）培养基中，在30摄氏度下振荡培养过夜。次日，将过夜培养物按OD600为0.05至0.1的比例稀释至10毫升新鲜SDC培养基中，在30摄氏度下振荡培养三天。第三天，当细胞处于稳定期时，用去离子水将每种Eloqua稀释10,000倍，然后从锥形瓶中取出两个10微升等分试样，将每个稀释培养物的10微升分别涂布于A-Y-E-P-D平板上。将平板在30摄氏度下培养，直至菌落出现。第三天培养物所形成的菌落数量或菌落形成单位被视为100%存活率。在后续几天内继续从老化培养物中取样进行涂布。相应调整稀释倍数，以确保菌落形成单位（CFU）测定中约有20至100个菌落。当培养物的存活率降至1%以下时停止取样，通常在第11至13天之间；也可在平板上老化培养的细胞中研究细胞存活率。开始该实验时，挑取单菌落接种于1毫升合成完全葡萄糖培养基中，在30摄氏度下振荡培养过夜。当菌液浓度达到约每毫升10的8次方个细胞时，用高压灭菌水将菌液稀释至每10微升含100至200个细胞，以及每10微升含1000个细胞。针对每种菌株，准备8至20块色氨酸缺陷型SDC平板，并根据涂布密度做好标记。为确保在预期衰老过程中细胞活力下降的情况下仍能计数到10至100个菌落，每个培养皿上接种两份稀释后的培养物，每份体积为10至30微升。在接种当天将培养皿置于30°C条件下培养，并在整个寿命分析期间每两天取出一个培养皿，逐滴加入0.5毫升色氨酸溶液，使有活力的细胞得以生长。随后将该培养皿在30°C下继续培养48至72小时。48 至 72 小时后，对色氨酸添加当天的细胞进行菌落形成单位（CFU）计数，以检测在时间性衰老过程中 DNA 损伤和突变频率。在酵母复制性寿命（CLS）测定中，若干具有特殊特征的菌株与野生型菌株平行培养。可通过测量时间衰老培养物中刀豆素抗性频率来评估自发突变频率。编码血浆精氨酸透性酶的can1基因发生突变会使细胞对精氨酸类似物L-刀豆素产生抗性，因而具有刀豆素抗性的细胞可在添加了L-刀豆素硫酸盐的精氨酸缺失合成完全培养基平板上生长。通过检测携带trp1基因琥珀突变菌株中色氨酸阳性回复突变的频率，结合测序分析，可估算酵母时间衰老过程中碱基替换的速率。在色氨酸缺陷型培养基平板上，正向回复突变细胞能够生长。裂解阴性菌株EH150在开放阅读框中携带一个+4碱基移码突变，导致其无法合成赖氨酸，因而表现为赖氨酸营养缺陷型；该表型可通过小片段插入或缺失突变而发生回复。回复突变子将在赖氨酸缺陷型培养基平板上进行筛选，以检测大规模染色体重排（GCR）事件。使用一种突变菌株，其中位于五号染色体上 can1 基因端粒端 7.5 千碱基处的 HXT13 基因被 URA3 插入片段破坏。can1 和 URA3 基因的突变分别使细胞对 L-Canavanine 和 5-氟乳清酸产生抗性。由于这两个基因同时发生点突变的频率较低，因此通过分析对 L-Canavanine 和 5-氟乳清酸双重抗性的频率，可估算基因组不稳定性（GCR）水平，以监测同源和非同源重组的发生程度。在时序性衰老过程中，会产生携带 100% 同源反向重复序列或 91% 同源反向重复序列的突变体。IRS 在 his 三位点的重组使得 IRS 能够表达有功能的 his 三位点蛋白。因此，发生重组的细胞将在添加了半乳糖的缺乏组氨酸的培养板上生长。在第三天，当细胞处于静止期时，将从每种衰老培养物中取出适量的细胞。由于所有检测均采用相同的步骤，因此仅处理一个样本。本视频中，通过台式离心机离心使细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升经高压灭菌的水中。再次移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 µL 水中，将细胞涂布于相应的平板上，以筛选所需回复突变子。将平板在 30 °C 下培养，3 至 4 天后计数 CFU，突变频率将根据存活细胞数量进行标准化。该图展示了典型的时间顺序寿命测定实验中的代表性结果，其中野生型细胞的时间顺序存活率与 S. cerevisiae Δtor1 Δras2 突变体进行了比较。在缺乏 TOR1、SCH9 或 RAS2 的液体培养突变体中，其复制性寿命延长。此外，SCH9 和 RAS2 的缺陷在不同碳源存在条件下对延长寿命和复制存活具有累加效应。下一张图展示了采用 NC2 活性检测法的结果。第一天，将SDC野生型培养物稀释后接种于无碳源的SC三缺培养板上。补充有葡萄糖、乙醇或甘油的SC三缺培养板在30摄氏度下培养，每两天取出一套培养板，加入适当的营养物质以促进生长和菌落形成。突变频率随年龄的变化很大程度上取决于菌株、背景、遗传操作、培养方式、条件以及年龄。本表格展示了在野生型菌株中获得的典型结果。下一图像展示了跨损伤合成的代表性结果。与年龄相关的突变频率增加可能涉及使用细胞核提取物和不同DNA模板时错误的DNA修复机制的变化。我们可以评估在时间老化细胞中的跨损伤合成（TLS）。分析了来自培养三天的静止期、野生型以及SCH9Δ突变细胞的细胞核提取物。使用未受损模板的TLS产物以实线表示，使用受损模板的TLS产物以虚线表示。在长寿的s CH九号delta突变体的细胞核提取物中未观察到跨损伤合成，游离引物以空心箭头表示。观看本视频后，您应充分掌握如何在酵母中进行时序性寿命测定和DNA突变分析。

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科研

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Biology

生物学

研究年龄相关的基因组不稳定性使用 S。酵母年代的寿命模型

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