研究年龄相关的基因组不稳定性使用 S。酵母年代的寿命模型

该程序的总体目标是通过将实际寿命与一组简单的 DNA 损伤和突变测定相结合来研究酵母中年龄依赖性基因组不稳定性。这是通过首先每两天对按时间顺序的老化培养物进行采样，并通过菌落形成单位或 CFU 形成检查活力来实现的。该程序的下一步是通过对衰老培养物进行采样并将细胞接种在突变特异性选择培养基上来检查 DNA 突变。

最终，通过将突变测定结果标准化为活力，可以获得显示酵母实际年龄老化过程中 DNA 突变变化的结果。这种方法可以帮助回答衰老领域的关键问题，例如将衰老与咏叹调中基因组不稳定性联系起来的机制 要测定酵母的实际寿命或 CLS，首先将单个酵母菌落接种到一毫升合成完全葡萄糖或 SDC 培养基中，并在第二天在 30 摄氏度下振荡孵育过夜。将过夜培养物稀释到 10 毫升新鲜 SDC 培养基中，至 OD 600 为 0.05 至 0.1，在 30 摄氏度下振荡孵育三天。

第 3 天，当细胞处于固定相时，用高压灭菌器水将每个 Eloqua 稀释 10， 000 倍，然后从培养瓶中取出两个 10 微升的等分试样，并将 10 微升每种稀释的培养物接种在 A-Y-E-P-D 板上。在 30 摄氏度下孵育板，直到出现菌落。从第 3 天培养开始出现的菌落数量或菌落形成单位的数量被认为是 100% 存活率。

在随后的几天里，继续从老化培养物中取出等分试样进行铺板。相应地调整稀释因子，以确保 CFU 测定中大约有 20 到 100 个菌落。当培养物的活力降低到 1% 以下时，通常在第 11 天和第 13 天之间停止采样，也可以在平板上老化的细胞中研究细胞活力。

首先，将单个菌落接种到 1 毫升合成完全葡萄糖培养基中，并在 30 摄氏度下振荡孵育过夜。当培养物生长到每毫升约 10 到 8 个细胞时，用高压灭菌水将培养物稀释至每 10 微升 100 至 200 个细胞和每 10 微升 1000 个细胞。对于每种菌株，准备一组 8 到 20 个色氨酸辍学 SDC 板，根据电镀密度标记。

为了确保可以计数 10 到 100 个菌落，预期衰老过程中活力会降低，将两等分试样 10 至 30 μL 稀释培养物放在每个板上。在铺板当天和随后每两天的寿命分析期间，将板组在 30 摄氏度下孵育，取出一个板并滴加 0.5 毫升色氨酸以使活细胞生长。将板在 30 摄氏度下再孵育 48 至 72 小时。

48 到 72 小时后。计算色氨酸版当天的活力的 CFU，以检测按时间顺序衰老的四种 DNA 损伤和突变频率。许多具有特殊特征的奇异菌株与用于酵母 CLS 测定的野生型菌株平行生长。

测量按时间顺序衰老的培养物中大麻 Vanning 抗性的频率来评估自发突变频率。编码血浆精氨酸通透酶的 can one 基因突变使细胞对精氨酸类似物 L Canavan Canavan 抗性细胞将在补充有硫酸 L Canavan 的合成完全培养基板上生长，在含有行程中琥珀突变的菌株中测量行程阳性逆转频率。一个包被序列允许估计酵母按实际时间老化过程中的碱基替换率。

阳性逆转细胞将在色氨酸缺失板上生长。裂解阴性菌株 EH one 50 在开放阅读框中具有加 4 偏移，这导致赖氨酸的 ox 萎缩，这可以通过小的插入或缺失突变来逆转。将在赖氨酸缺失板上选择还原子以检测大体染色体重排或 gcr。

使用突变菌株，其中 HX T 13 位于 5 号染色体上 7.5 kb 端粒到 can 1 被 U 三个盒突变破坏，Can one 和 U 3 基因分别使细胞对 L Canavan 和 5 氟乳清酸产生抗性。由于两个基因中发生的点突变的频率都很低，因此对 El Canavan 和五氟乳清酸的耐药频率的分析提供了 gcr 的估计值，以监测同源和同源重组的水平。在按时间顺序衰老的过程中，会产生携带 100% 同源反向重复序列或 91% 同源的突变体。

IRS 在 his 三个位点的重组 IRS 允许功能性 his 三个蛋白的表达。因此，发生重组的细胞将在补充有半乳糖的组氨酸缺失板上生长。第 3 天，当细胞处于固定期时，将从每个老化培养物中去除适量的细胞。

由于所有分析都使用相同的程序，因此将只处理一个样品。在本视频中，通过在台式离心机中旋转来沉淀细胞。去除上清液，将细胞重悬于一毫升高压灭菌器水沉淀中。

同样，去除上清液并将细胞沉淀重悬于适当平板上的 100 微升水板细胞中，以选择所需的还原。在 30 摄氏度下孵育板，计数 CFU 三到四天后，突变频率标准化为活细胞的数量。当野生型细胞的时间存活率与 S CH、9 delta、TOR 1 delta 和 RAs 2 delta 突变体的存活率进行比较时，该图显示了典型时间寿命测定的代表性结果。

在液体培养物中，缺乏 TOR 1 s、CH 9 或 RAs 2 的突变体显示出更长的实际寿命。此外，在存在各种碳源的情况下，s CH 9 和 RAs 2 的缺陷显示出对促进长寿、按时间顺序生存的累加效应。使用 NC two 活力检测

第一天，稀释 SDC 野生型培养物并接种到无碳源的 SC 脱辍板上。补充有葡萄糖乙醇或甘油卵酸盐板的 SC Tripp 脱辍板每 2 天在 30 摄氏度下孵育一次。从每组中取出一个板，并添加适当的营养物质以促进生长和集落形成。

年龄依赖性突变频率因品系、背景、基因作、培养、条件和年龄而异。下表显示了在野生型菌株中获得的典型结果。反式病变合成的代表性结果显示在下一张图片中。

年龄依赖性突变频率的增加可能涉及使用核提取物和各种 DNA 模板的错误 DNA 修复的变化。我们可以在按时间顺序老化的细胞中评估翻译合成或 TLS。分析来自 3 日龄固定相、野生型和 SCH 9 δ 突变细胞的核提取物。

模板未残损的 TLS 商品用实线表示，模板残损的 TLS 商品用虚线表示。在长寿命 s CH 的核提取物中没有观察到反式损伤合成，9 个 δ 突变体游离引物由空箭头表示。看完这个视频，你应该对如何在酵母中进行实际寿命和 DNA 突变分析有一个很好的了解。