ODELAY:用于酵母生长多参数定量的大规模方法

ODELAY 的总体目标是以高通量方式测量生长成菌落的单个细胞的生长表型。该方法可以帮助回答微生物学、遗传学和系统生物学中的关键问题，例如遗传扰动和药物相互作用对任何菌落形成微生物的生长表型的影响。ODELAY 的主要优点是它使研究人员能够直接观察和量化大量个体之间的种群异质性。

在组装琼脂模具之前，用 70% 乙醇清洁丙烯酸模具，并使用强制空气干燥它们。有三个底部部分和两个直立部分。要开始组装琼脂模具，请取出三个底部部分并组装它们，以便两个相同的部分夹在第三部分之间。

使用两个小活页夹夹住每侧的基件。将立柱放入模具中，确保激光曲线正确定位。将清洁并干燥的载玻片放在模具上并将其固定到位，同时将第二张载玻片放在另一侧。

用较大的活页夹夹住组件。用较大的活页夹夹住两张载玻片，确保每个上部活页夹都与与亚克力重叠的载玻片接触。在用熔融琼脂填充组装好的模具之前，沿模具内侧移液约 70 微升熔融琼脂培养基，确保边缘密封。

沿着模具边缘缓慢移液，填充模具，不要将气泡困在内部。填充模具后，让它在大约 23 摄氏度的环境温度下冷却 40-60 分钟。下一步是模具分离。

首先取下底部的活页夹。然后取下由三个夹层组成的模具底部。通过压缩载玻片来握住载玻片，然后小心地取下活页夹。

将模具放在工作台面的边缘，使模具带有蓝点的一侧朝上。将两个拇指放在亚克力下方，将食指放在顶部，朝向模具的内边缘，然后用拇指缓慢而小心地向上推，就像围绕模具的下边缘旋转模具垫片一样。施加恒定但缓慢增加的压力。

断裂和气泡应沿着顶部玻璃覆盖模具垫片的一条线出现。看到初始断裂线后，继续用两个拇指向上推并施加恒定压力。琼脂应该开始从玻璃上脱落。

继续向上旋转模具。由于玻璃是完全自由的，因此抓住它并将其从模具中完全取出。然后用类似的动作取出另一个模具件，在不移动琼脂的情况下将模具件抬起。

将玻片放入无菌吸头盒中，底部加入一些无菌高纯水。关闭盒子并在 4 摄氏度下存放过夜，以备第二天使用。按照文本方案中的说明，通过在 96 孔板中制备菌株来开始此过程。

使用读板器测量每种培养物在 600 纳米处的光密度。接下来，使用自动稀释方案将板中的培养物稀释至约 0.1 纳米的 600 纳米光密度。设置稀释程序后，按照台面布局所示，将板、试管和吸头加载到液体处理机器人的台面上。

单击播放按钮以运行稀释程序。选择正确数量的 50 μL 吸头和正确数量的 300 μL 吸头。稀释完成后，从机器人中取出稀释板，并在 30 摄氏度下培养板，保持湿度，以防止板干燥 5 到 6 小时。

在培养板孵育完成前大约一到两个小时，打开显微镜的孵育室，让它们在 30 摄氏度下平衡。使用相同的自动稀释方案，将培养物第二次稀释至 600 纳米的光密度为 0.01 至 0.02。用金属冷冻密封件盖住稀释板，并在冰浴中超声处理 30 秒，使板漂浮在冰水中。

将四个 96 孔平底板标记为 1、2、3 和 4。按照此模式将 150 μL 每种超声处理的培养物从稀释板转移到平底板中。将 A1 至 D6 孔放入板 1 的 C4 至 F9 孔中。

将 A7 至 D12 孔放入板 2 的 C4 至 F9 孔中。将 E1 至 H6 孔放入板 3 的 C4 至 F9 孔中。将 E7 至 H12 孔放入板 4 的 C4 至 F9 孔中。

要开始此过程，请将琼脂糖载玻片正确放入载玻片室中。接下来，将 96 孔平底板按象限顺序放在桌子上。图版一、二、三和四从左到右。

将吸头放在四个空的吸头盒中，以便每个吸头盒的内 24 个孔被吸头占据。在第五个框中，将吸头放在位置 C10 中，将吸头的末端剪掉在位置 A1、A12、H1 和 H12 中。这四个切断尖端将为尖端板夹提供稳定性。

将第一个吸头打孔器放入机器人控制点样程序的起始位置，在琼脂糖上打一个孔，以便稍后用于对齐原点坐标。将 Plate One 放在液体处理机器人上，以找到第一象限。取下盖子并继续点样程序。

检查以确保所有点都存在。将用过的尖端倒入生物危害容器中，并将新的尖端放在机器人上。等待约 30 秒，让斑点干燥至直径约 1 毫米，然后继续该程序。

将 1 号板换成 2 号板，并继续点样程序。当所有四个象限都已被发现并且斑点干燥时，请装回载玻片室盖并将设备翻转过来。将载玻片放在载玻片室的顶部。

首先将载玻片室加载到显微镜中。通过运行定制设计的脚本来执行延时显微镜检查。单击快门打开透射光快门，然后单击对焦按钮启动高相机速率。

单击"Go Origin"并移动载物台以找到在琼脂中打孔的原点标记，然后稍微向右移动以专注于区域 E7 中点样的细胞。移回原点冲孔，并将其在视野中居中。按 Set"按钮将原点设置为此值。移动到位置 H18 并使用最靠近该位置的六角螺钉进行对焦。

然后移动到位置 L7 并使用最靠近该位置的六角螺钉进行对焦。最后移动到位置 E7 并使用最靠近该位置的六角螺钉进行对焦。检查点 E12、H12 和 L12 的中央和边缘的焦距 如果 z 值所指示的对焦 z 值大于正负自动对焦范围，请调整自动对焦范围。

按下 Reset"按钮，然后按 ODELAY。选择用于保存数据的目录。显微镜将在 48 小时内收集数据或直到程序关闭。

这些具有代表性的延时图像显示酵母细胞在固体培养基上生长的时间分别为点样后零小时、三小时、六小时和 9 小时。这里显示的是处理延时图像后比较两种酵母菌株的代表性数据集。相对均匀的倍增时间反映了精心制备的琼脂糖载玻片，但是由于自动对焦设置不是最佳的，滞后时间差异很大。

这里显示了一个更一致的数据集，其中所有倍增时间似乎都很好地重叠，并且滞后时间似乎是一致的。一旦掌握了 ODELAY 的设置，如果执行得当，可以在三到四个小时内完成。可重复的 ODELAY 测量的最关键步骤是始终如一地制备介质，并避免在分离载玻片时使介质发生机械变形。

ODELAY 是一种非常敏感的检测方法。例如，它可以在室温下观察温度敏感酵母菌株的生长缺陷，而常用的基于斑点的分析需要在 37 摄氏度下培养酵母以揭示生长缺陷。虽然 ODELAY 已在酵母中开发，但该方法适用于包括病原体在内的任何菌落形成生物体，以探索广泛的环境和遗传条件以了解微生物的行为。

观看此视频后，您应该对如何执行 ODELAY 来测量在固体培养基上形成菌落的单细胞微生物的生长表型有很好的了解。不要忘记，与微生物一起工作可能是危险的，应始终采取预防措施，例如佩戴适合所研究生物体的个人防护设备。