Name: 基于蛋白质的水凝胶的力钳 Rheometry (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 了解基于蛋白质的水凝胶力钳流变学技术，利用PID系统精确控制受力，实现小样本体积的机械性能表征。该方法可测量数十亿蛋白质分子，为生物材料开发和组织力学研究提供重要工具。

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我们感谢来自研究增长计划（资助编号：101X340）、国家科学基金会重大研究仪器项目（资助编号：PHY-1626450）、密尔沃基大都会基金会（肖奖）以及威斯康星大学系统（应用研究资助）的经费支持。

1. 试剂溶液的配制
<ol>
	<li>使用 Tris 缓冲液 [20 mM 三（羟甲基）氨基甲烷和 150 mM NaCl，pH 7.4] 将目标蛋白溶解或稀释至所需浓度，制备起始蛋白溶液。 
	注意：能够通过交联形成水凝胶的最低蛋白浓度取决于所用蛋白，通常 &#62; 1 mM。</li>
	<li>将过硫酸铵（APS）和三（联吡啶）氯化钌（II）（[Ru(bpy)3]2+）粉末溶于 Tris 缓冲液中，分别配制 1 M APS 和 6.67 mM [Ru(bpy)3]2+ 储存液。</li>
</ol>
2. 基于蛋白质的水凝胶合成
<ol>
	<li>将带有压紧活塞的23 G针头安装到1 mL注射器上。</li>
	<li>使用剃刀切割一段10 cm长的聚四氟乙烯（PTFE）管（内径0.022 in，外径0.044 in）。将针头和注射器连接至PTFE管的一端。</li>
	<li>将管子的另一端插入硅烷溶液中，通过回抽注射器活塞使溶液充满管子，静置约30分钟。</li>
	<li>移除硅烷溶液，并用压缩空气干燥管子。 
	注意：确保所有硅烷溶液均已干燥，且管内无残留物。</li>
	<li>将蛋白质溶液与 APS 和 [Ru(bpy)3] 混合2+ 在1.5 mL离心管中使用恒定体积比[例如，15:1:1 或 15:0.5:0.5（v:v:v）。</li>
	<li>涡旋振荡光敏溶液直至完全混匀。</li>
	<li>以最大速度离心混合物（例如，14,000 × g）以去除溶液中的气泡。</li>
	<li>将处理过的PTFE管的开口端插入光敏混合物中，通过回拉注射器活塞将溶液吸入管内。</li>
	<li>将装有样品的试管置于距离100 W汞灯约10 cm处，以防止加热，并在室温下照射最多30分钟（图1B). 
	注意：在某些情况下，光照时间可短至30秒。此处荧光凝胶采用较短的凝胶化时间，以减少光漂白。</li>
	<li>将试管从针头取下，用剃刀片在靠近水凝胶末端的位置切割试管边缘。</li>
	<li>使用钝化的24 G针头将水凝胶挤入Tris溶液中（图1C). 
	注意：使用钝头针头以避免对水凝胶样品造成切口或损伤。</li>
	<li>目视检查凝胶是否存在挤出过程中或因气泡产生的缺陷，并弃去有缺陷的凝胶。</li>
</ol>
3. 基于蛋白质的水凝胶附着及力钳流变仪装置设置
<ol>
	<li>启动仪器控制程序。打开音圈电机。将线圈位置设置为接近量程末端的数值（例如，7.5 毫米。 
	注意：建议将音圈位置设于最大运动范围的末端，以最大化水凝胶的可能延伸程度。</li>
	<li>移动钩子 z方向，并在弯折处对齐 x方向（即拉伸坐标；参见 图2B）。记录千分尺螺丝的数值 x方向。</li>
	<li>将2根无菌缝合线剪成等长的线段（2 - 3 cm；参见 图3A 和 B).</li>
	<li>在每根绳股上打一个松散的双半结，并将两个绳圈套在连接至力传感器的挂钩上图3C 和 3D).</li>
	<li>用医用镊子将水凝胶样品转移至已装满Tris缓冲液的实验腔室中。</li>
	<li>将音圈和力传感器的挂钩置于接近溶液表面的位置，并使用以下装置在各个方向上对准挂钩 x/y/z-定位操作器。</li>
	<li>使用医用镊子，将蛋白水凝胶样品的两端分别悬挂在与音圈和力传感器相连的挂钩上图3C).</li>
	<li>用医用镊子夹住缝合线环的两端，同时拉动，在音圈钩上的水凝胶样品周围收紧一个缝合线环（图3D).</li>
	<li>重复步骤 3.8，针对连接至力传感器的环图3D). 
	注意：避免过度收紧缝线，以防对水凝胶样品造成结构损伤或横向切割。</li>
	<li>收紧每个钩子弯曲处的缝合线圈，以防止任何滑动；在步骤 3.2 中，将这些弯曲处作为参考点，以确定钩子之间的零间距。使用医用剪刀剪去缝合线多余的长度图3D).</li>
	<li>使用已连接的水凝胶进行移动 z-沿……的操纵器 z-轴朝向实验腔室，以将水凝胶浸入实验溶液中。</li>
	<li>将水凝胶样品对齐 y-z 使用操作器，使凝胶不受任何应力。</li>
	<li>将力传感器归零，并使用 x微米级阶段，直至凝胶开始受力。一旦发生这种情况，立即将微米螺旋略微回旋 x方向。</li>
	<li>记录音圈电机和传感器两个操纵器的位置，并利用这些数值与步骤3.2中测得的数值之间的差值，计算实验开始时系留钩之间的精确间距。</li>
	<li>将松弛曲线的范围设置为约1.5 - 2 mm，并测量凝胶的松弛度图4A). 
	注意：每次测量松量时，应尽量使松量阶段的起始点接近初始音圈位置，以便获得足够数量的数据点来拟合两个阶段图 4A）。可利用钩子之间的间距以及松弛曲线中两个区域交点的位置，以微米级分辨率确定凝胶长度（另见步骤5.1）。由于力传感器可能因实验条件变化而随时间发生漂移，松弛曲线中凝胶不受力的部分可反映这种可能的漂移。控制仪器的程序在向PID回路发送设定值指令时，会自动补偿此差异。图 4A 插图</li>
</ol>
4. 使用受控力-斜坡和恒力测量法对基于蛋白质的水凝胶进行表征
<ol>
	<li>力-程控实验
	<ol>
		<li>通过以所需的加载速率（例如，0.01 mN/s）增加力来进行一个力-程控循环，将起始力和终末力以及协议持续时间设置为倒置的 &#34;V&#34; 形式。然后在 0 mN（或低力）下保持凝胶至少 &#62; 200 秒，以允许蛋白质结构域重新折叠并使凝胶弹性恢复。</li>
		<li>保存曲线记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恒力实验
	<ol>
		<li>执行恒力协议：先施加一个低力（例如，0.1 mN）持续 30 秒，然后将力增加至一个恒定值（例如，1 mN）并维持一段确定的时间（例如，120 秒），随后将力迅速降至相同的低力值（例如，0.1 mN）并保持至少 &#62; 300 秒，以允许蛋白质结构域重新折叠并使凝胶弹性恢复。</li>
		<li>在第一次脉冲之后，调整 PID 参数以最大化反馈回路的响应速度（见 图 2D）。 
		注：对于较硬的凝胶以及较小的力变化，回路响应时间受限于力传感器的电子元件和线圈的响应时间，最短可达到 5 ms7。对于较软的凝胶和较大的力变化，响应时间则由水凝胶的弹性决定（图 2D）。</li>
		<li>保存曲线记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>利用测量得到的钩子间距和计算出的线圈位置，当凝胶开始受力时（见图4A插图中的 Δx），使用以下公式计算凝胶长度 L： 
	L = L0 + ∆x 
	其中，L0 是钩子之间的间距，通过实验前（步骤 3.14）千分尺螺丝的位置测量得到。 
	注意：对于蛋白浓度较低且未完全交联的凝胶，测量得到的长度在不同测试轨迹之间会发生变化。此外，在较长时间内，水凝胶内部的蛋白质可能发生老化效应25，导致凝胶整体伸长。</li>
	<li>将测得的伸长量归一化为凝胶长度，以获得应变。</li>
	<li>利用用于聚合的试管的内径计算横截面积，并将测得的力归一化为该横截面积。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种力钳流变学技术，用于研究小体积蛋白基水凝胶的生物力学响应。此外，提供了一种制备均匀圆柱形小体积蛋白水凝胶样品的方案。还给出了一种在不引起蛋白基水凝胶样品机械变形或损伤，以及避免凝胶在挂钩上滑脱的情况下，将具有不同弹性的多种蛋白基水凝胶进行打结的方法。模拟PID系统结合线性音圈电机和力传感器，可实现力 ramp 和恒力等受控力加载程序。最近，该技术已被用于研究在不同实验溶液中不同交联浓度的BSA基水凝胶的生物力学响应7。
在配制和使用蛋白质水凝胶时，一个重要的方面是测量结果的可重复性。如果凝胶的蛋白质浓度过低或交联不完全，在拉伸过程中会出现永久性塑性变形。7这些塑性变形会严重限制数据的解释，因为粘弹性效应将同时来源于结构域的展开以及凝胶内部的分子重排。一个简单的测试方法可用来判断是否存在这种情况&#160;完全交联的方法是将水凝胶浸入化学变性剂中，例如 6 M 盐酸胍1在此情况下，应力中不应存在任何粘弹性效应。与</em...

除了具有独特的物理特性外，基于蛋白质的水凝胶有望通过在一次“拉伸”中测量数十亿个分子，彻底改变力谱技术，从而实现对类似皮肤及其他组织中拥挤环境下的蛋白质进行研究。蛋白质结构域在水凝胶内部仍保持折叠状态，使其能够研究这些结构域对力学作用、结合伴侣以及化学条件的生物力学响应。此外，蛋白质结构域在水凝胶内的生物力学响应与单分子力谱技术中观察到的响应相似。例如，化学变性剂和氧化剂均会降低折叠态的稳定性，无论是在单个蛋白质结构域水平1,2,3，还是在宏观水平上4,5,6,7。同样，渗透保护剂可提高单个蛋白质的稳定性8,9，在相同受力条件下导致水凝胶的黏弹性响应降低&#160;7,10。
已采用多种方法来合成基于蛋白质的水凝胶，这些方法主要利用物理相互作用11,12 或共价交联4,13共价反应可实现固定的交联位点，这类水凝胶&#160;在去除机械或化学扰动后，可恢复至初始状态。一种成功的共价交联方法依赖于使用过硫酸铵（APS）作为氧化剂，并以钌（II）盐作为引发剂，在暴露的酪氨酸氨基酸之间形成共价碳-碳键。图1)14暴露于白光后，浓缩蛋白质溶液可转化为水凝胶。通过控制反应起始时间，可将蛋白质-APS混合物注入任意铸模中，例如聚四氟乙烯（PFTE）管图1B 和 1C），可使用极小体积的溶液15此外，使用白光触发交联反应可显著减少荧光蛋白的漂白，并能够制备含有荧光标记物的复合水凝胶。图1）。其他基于蛋白质的水凝胶形成方法则利用SpyTag-SpyCatcher共价相互作用进行交联16，胺交联 通过 戊二醛13，或生物素-链霉亲和素相互作用17.
动态力学分析（DMA）目前是一种广泛用于研究聚合物基水凝胶的技术13,18。尽管DMA可对生物材料施加恒定力的实验方案，但它要求材料的杨氏模量超过10 kPa，并且需要超过200 µL的大样本体积19。由于这些限制，蛋白质水凝胶通常过于柔软，难以用该技术进行研究。由于工程化多聚蛋白需要依赖活体系统生产，其合成比聚合物更困难，因此使用如此大的样本体积至多只能算是低效的4,15。此外，大多数生物组织的硬度均低于10 kPa。针对生物样本已开发出多种方法，特别是在肌肉弹性研究方面20,21。这些技术也可在反馈控制下施加恒定力，但其优化对象为直径较小（微米级）且受力时间极短（通常少于1 s）的样本。
基于蛋白质的水凝胶已通过改进的流变学技术成功研究。例如，将水凝胶铸造成环形结构，可利用拉伸流变仪测量其在拉伸过程中受力随延伸程度的变化4,22其他研究基于蛋白质的水凝胶流变特性的方法采用控制剪切应力流变仪。这些技术同样能够实现小样品量检测，并可耐受柔软材料。然而，这些方法无法模拟导致蛋白质展开的拉伸力 体内，而杨氏模量的计算基于复杂的理论，需要多种假设和校正23.
我们最近报道了一种新方法，该方法利用少量蛋白质，在管内进行聚合&#160;直径 &#60; 1 mm。我们首次实现该技术时采用的是长度钳制模式，即凝胶按照预设的程序进行拉伸15在此方法中，蛋白质在结构域解折叠过程中会持续经历伸长和受力的变化，导致数据分析变得繁琐。最近，我们报道了一种新的力钳流变术技术，该技术通过反馈回路可将小体积蛋白质水凝胶暴露于预设的力程序中。7 (图2）。模拟PID系统将力传感器测得的力与计算机发送的设定值进行比较，并通过移动音圈来调节凝胶的伸展程度，以最小化两个输入之间的差异。这种力的“钳制”现在使得能够开展新型实验，以测量蛋白质水凝胶的生物力学特性。
在力-斜坡模式下，固定的蛋白质水凝胶随时间经历持续增加和减少的力作用。PID 会根据蛋白质类型和水凝胶配方，以非线性方式调节拉伸程度，以补偿任何粘弹性形变。力斜坡模式的主要优势在于，它能够通过蛋白质结构域的去折叠与再折叠过程，量化诸如杨氏模量和能量耗散等标准参数。
在恒力模式下，施加的力以阶梯状方式变化。在此模式中，当力增加或减少时，凝胶分别发生弹性伸展和收缩，随后出现与时间相关的形变。这种在凝胶承受恒定力条件下发生的黏弹性形变，直接关联结构域的去折叠/重折叠过程。简而言之，这种伸展可被视为数十亿个单分子轨迹的平均结果，同时被一次性测量。恒力实验方案可用于研究蛋白质水凝胶在不同力和时间条件下的蠕变与应力松弛行为。对于基于牛血清白蛋白（BSA）的蛋白质水凝胶，我们近期研究表明，弹性与黏弹性伸展及回缩与所施加的应变之间存在线性依赖关系7。
本文详细介绍了使用由蛋白L（8个结构域24，表示为L8）和蛋白L-eGFP构建体（L-eGFP）混合制成的复合凝胶进行力钳流变仪操作的方法，该水凝胶具有荧光特性，便于演示。

<table><tbody><tr><td>SI-KG4A 力传感器</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SI-KG4A</td><td></td></tr><tr><td>线性音圈电机</td><td>Equipement Solutions</td><td>LFA2010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>三(联吡啶)氯化钌(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&amp;nbsp;6-0 尼龙缝合线 12根/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器（仅针筒），鲁尔锁扣式针头接口</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>硅烷化试剂 Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>微孔聚四氟乙烯管，内径 0.022&quot; × 外径 0.042&quot;，100 英尺/卷</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头，23 号</td><td>Healthcare Supply Pros</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Jensen Global JG24-1.5X 红色 IT 分液针头 - 24 号</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100 W 短弧汞灯</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>医用镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>医用剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制部件的计算机代码和 CAD 设计可根据要求向通讯作者索取。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于表征蛋白质基水凝胶的力钳流变术

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

本文介绍了一种力钳流变学方法，用于表征基于蛋白质的水凝胶的生物力学特性。该方法采用模拟比例-积分-微分（PID）系统，对固定在直线音圈电机与力传感器之间的圆柱形蛋白质水凝胶样品施加受控的力程序。在运行过程中，PID系统通过最小化测量力与设定力之间的差异，调节水凝胶样品的伸长，以跟踪预设的力程序。这种针对基于蛋白质的水凝胶的独特方法&#160;能够固定体积极小（&#60; 5 µL）且蛋白浓度不同的水凝胶样品。在力斜坡程序下（即施加的应力随时间线性增加和减少），该系统可用于研究与蛋白质（去）折叠相关的弹性与滞后行为，并测量标准的弹性与粘弹性参数。在恒力条件下（即力脉冲呈阶跃状），由力变化引起的弹性响应与来自蛋白质结构域去折叠和再折叠的粘弹性响应得以分离。由于该方法所需样品体积小，且可灵活施加多种机械扰动，力钳流变学技术特别适用于通过整体方法研究蛋白质在受力条件下的力学响应。

图1A展示了用于合成L-EGP/L8 水凝胶的光活性反应示意图。图1B显示了聚四氟乙烯（PTFE）管中水凝胶混合物在光活化前后的状态。图1C展示了在Tris溶液中挤出的L-eGFP-L8水凝胶。水凝胶样品无缺口等结构缺陷。应弃用具有明显损伤的水凝胶。
力钳式流变仪的装配图与分解图分别如图2A和2B所示。图2C展示了力钳式流变仪的示意图，其中水凝胶样品固定在连接线性音圈电机和力传感器的挂钩之间，并浸没在缓冲溶液中。模拟PID系统通过控制线性音圈电机的位置以跟踪设定的力值，从而调节水凝...

一种新型的力钳流变测量技术被用于研究固定在音圈电机和力传感器之间的低体积蛋白基水凝胶样品的力学性能。模拟比例-积分-微分（PID）系统可将所受力“钳制”在预设的实验方案范围内。

在此，我们介绍一种力钳流变测量法，用于表征基于蛋白质的水凝胶的生物力学特性。该方法采用一种模拟……

该技术的主要优势在于其采用了一种PID（比例-积分-微分）系统，可对蛋白质水凝胶样品施加受控的力作用程序，并且仅需使用少量样品。力钳制协议使得数据的解读更加直接明了，而低样品用量在处理那些难以大量制备、仅能获得微量的蛋白质时尤为关键。该技术的应用前景包括利用蛋白质特有的折叠-再折叠转变特性，来开发和表征具有持久弹性的新型生物材料。该方法可通过一次拉伸测量数十亿个蛋白质分子，并模拟生物组织特有的拥挤环境，从而解答组织和生物材料力学领域的问题。首先按照文本方案中的描述准备试剂溶液。要合成基于蛋白质的水凝胶，首先将一根23号针头固定在装有压紧活塞的1毫升注射器上。然后，使用剃刀切割一段10厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）管。将针头和注射器连接到PTFE管的一端。将管的另一端插入硅烷溶液中，并通过回拉注射器活塞使管内充满溶液。将试管静置约30分钟。然后，移除硅烷溶液，并用压缩空气干燥试管。接着，在1.5毫升离心管中，按照恒定的体积比混合蛋白溶液、APS和三（联吡啶）合钌(II)氯化物。将光敏溶液涡旋振荡至完全混合。然后以最高速度离心，以去除溶液中的任何气泡。在将水凝胶光敏混合物装入聚四氟乙烯管时可能产生气泡，从而导致样品损坏。为防止气泡产生，在加样过程中应保持聚四氟乙烯管末端浸没于溶液混合物中，并缓慢回抽注射器活塞。将经过处理的聚四氟乙烯管开口端插入光敏混合物中，通过回抽注射器活塞将溶液吸入管内。随后，将装有溶液的管子置于距离100瓦汞灯约10厘米处，以避免加热，并在室温下保持最多30分钟。将管子从针头取下，用剃刀片在靠近水凝胶末端的位置切去管子的边缘。然后使用钝化的24号针头将水凝胶挤入Tris溶液中。目视检查凝胶是否存在挤出过程中或因气泡导致的任何缺陷，并丢弃有缺陷的凝胶。启动仪器控制程序并打开音圈电机。然后，将线圈位置设置为接近量程末端的数值。在Z方向上移动挂钩，并在X方向上对弯折处进行对齐。然后，记录 X 方向千分尺螺丝的读数。现在，在缝合线末端打一个松散的双半结，使环的直径约为四毫米。接着，将环从线上剪下。重复操作形成第二个环。然后，将两个环套在连接至力传感器的挂钩上。用医用镊子将水凝胶样品转移至已充满Tris缓冲液的实验腔室中。将音圈和力传感器的挂钩置于接近溶液表面的位置，并使用 XYZ 定位操纵器在各个方向上对齐挂钩。使用医用镊子，将蛋白水凝胶样品的两端分别悬挂在连接至音圈和力传感器的挂钩上。常见的错误是在固定过程中缝合环过度收紧，导致水凝胶样品受力过大。这可能导致水凝胶样品产生缺口并被切断。用医用镊子夹住缝合线环的两端，同时拉动，小心地将一个缝合线环固定在音圈钩上的水凝胶样品周围。对连接到力传感器的线环重复此步骤。收紧每个钩子弯曲处的缝合线环，以防止任何滑动。利用这些弯曲处作为参考点，找到钩子之间的零间距位置。使用医用剪刀剪去缝合线多余的长度。使用Z轴操纵器沿Z轴方向移动连接的水凝胶，将其浸入实验腔室中的实验溶液中。利用操纵器在YZ方向上对准水凝胶样品，使凝胶不受任何应力。将力传感器归零，然后通过X轴微米级位移平台分离两个钩子，直至凝胶开始受力。发生这种情况后，将测微螺杆在 X 方向上略微回转。记录音圈电机和传感器两个操纵器的位置。然后，利用这些数值与先前测得的数值之间的差值，计算实验开始时系留钩之间的精确间距。通过以所需的加载速率增加力来执行力- ramp 循环，输入起始力和最终力值，以及该协议的持续时间，其力-时间曲线呈倒V形，随后施加约200秒的恒定低力，以使蛋白质结构域在下一个循环前重新折叠。通过施加30秒的低力来执行恒力协议；然后将力增加至某一恒定力并维持一段确定的时间，随后将力骤降至相同的低力值并持续超过300秒，以使蛋白质结构域重新折叠并恢复凝胶的弹性。最后，按照文本方案中所述进行数据分析。每次测量均以一条松弛曲线开始。通过拟合两条直线，确定传感器上的零力和凝胶的实际长度。真实凝胶长度通过拟合曲线的交点以及千分尺螺丝的位置计算得出。力钳流变系统可施加两种不同类型的协议。在力递增模式下，水凝胶样品所经历的力随时间变化的协议呈倒V形。在恒定力模式下，施加的应力呈阶跃式变化。在测量过程中，PID 系统通过改变线圈位置来调节水凝胶的伸长量，以跟随力协议中预设的目标值。应变通过将测得的伸长量除以水凝胶的实际长度来计算。应力则通过将施加的力除以水凝胶样品的横截面积来确定。力斜坡曲线最好以应力相对于应变的形式表示。杨氏模量可通过加载阶段的斜率测量值计算得到。滞后现象反映了蛋白质去折叠和再折叠过程中产生的能量耗散。恒定力迹线最好表示为时间的函数。可通过拟合双指数函数，利用应变的变化来测量展开和折叠速率。在尝试此操作时，需注意在加入蛋白质之前，应将管内残留的硅烷充分干燥；将蛋白质混合物离心以去除气泡；在将蛋白质混合物注入管内后检查是否存在气泡；挤出过程中如有机械损伤的水凝胶，应予以弃用。通常，初次使用该方法的研究人员在用外科缝合线将凝胶固定到挂钩上时，最初会遇到困难，容易对水凝胶样品造成损伤。此外，将凝胶从管中推出的过程也可能损坏水凝胶。该方法可实现对小体积水凝胶样品施加恒定力的实验方案。这些实验能够分离弹性与黏弹性行为，并以整体方法研究蛋白质的去折叠与折叠力学。该技术发展之后，材料科学领域的研究人员得以探索新型软性生物材料，例如基于工程化多聚蛋白的水凝胶，这类材料在用作组织工程支架、药物递送系统以及3D打印用生物墨水方面具有巨大潜力。该方法不仅有助于深入理解基于蛋白质的水凝胶的力学特性，还可应用于其他体系，例如测量肌纤维的等长响应或皮肤等组织的弹性。

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科研

JoVE Journal

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工程

基于蛋白质的水凝胶的力钳 Rheometry

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌...

定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

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RGD功能化水凝胶的合成及其在治疗应用中的工具作用

本文针对基于蛋白质的水凝胶中调控三维结构的不同方法，从材料特性角度进行了评估。将大孔网络功能化修饰以细胞黏附肽，并利用两种不同的模式细胞系评估其在细胞培养中的可行性。...

用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

我们演示了一种微流控装置的制备与使用方法，该装置可实现多粒子追踪微流变测量，用于研究反复相变对软物质流变特性的影响。...

结合微流控与微流变学技术测定软物质在多次相变过程中的流变特性

本文介绍了一种将细胞包封并培养在功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案，该水凝胶含有可被荧光基质金属蛋白酶（MMP）降解的肽段。通过标准的微孔板读数仪，可直接从水凝胶培养物中检测细胞的MMP活性及代谢活性。...

在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

本方案介绍了三种利用环境条件诱导肽自组装形成水凝胶的快速简便制备方法。此外，还描述了肽水凝胶的表征方法，证明在这些简单条件下可形成机械稳定的肽水凝胶。...

机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

有机光伏（OPV）材料在纳米尺度上本质上是不均匀的。OPV材料的纳米级不均匀性会影响光伏器件的性能。本文中，我们描述了一种用于定量测量OPV材料电学和力学性能的实验方案，空间分辨率优于100...

使用原子力显微镜对有机光伏材料进行同步定量电导率与力学性能测量

了解基于蛋白质的水凝胶力钳流变学技术，利用PID系统精确控制受力，实现小样本体积的机械性能表征。该方法可测量数十亿蛋白质分子，为生物材料开发和组织力学研究提供重要工具。

用于表征蛋白质基水凝胶的力钳流变术

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