基于蛋白质的水凝胶的力钳 Rheometry

该技术的主要优点是它利用 PID，PID 是一种比例积分微分系统，可将受控力方案应用于蛋白质水凝胶样品，并且它利用小样品量。力夹的方案允许对数据进行直接解释，而在处理难以生产且仅少量可用的蛋白质时，低体积至关重要。这项技术的影响延伸到开发和表征具有持久弹性的新型生物识别材料，利用蛋白质的向下折叠、再折叠过渡特性。

这种方法可以通过一次测量数十亿个蛋白质分子并模拟生物组织特有的拥挤环境来回答组织和生物材料力学中的问题。按照文本方案中的说明，从试剂溶液制备开始此过程。要合成基于蛋白质的水凝胶，首先将 23 号针头固定在带有压制柱塞的 1 毫升注射器上。

然后，使用剃须刀片切割一根 10 厘米长的聚四氟乙烯 （PTFE） 管。将针头和注射器连接到 PTFE 管的一端。将试管的第二端插入硅烷溶液中，然后缩回注射器柱塞填充试管。

将试管放置约 30 分钟。然后，去除硅烷溶液并用压缩空气干燥试管。现在，将蛋白质溶液与 APS 和 Tris（联吡啶）钌 （II） 氯化物在 1.5 毫升试管中以恒定体积比混合。

涡旋光活性溶液，直至完全混合。然后，以最大速度离心混合物以去除溶液中的任何气泡。将水凝胶光活性混合物加载到 Teflon 管中时会形成气泡，从而导致样品损坏。

为防止气泡形成，在加载过程中将 Teflon 管端保持在溶液混合物中，并缓慢缩回注射器柱塞。将处理过的 PTFE 管的开口端插入光活性混合物中，然后缩回注射器柱塞将溶液吸入管中。现在，将装有的管子放在距离 10 瓦汞灯约 10 厘米的地方，以防止加热，并在室温下放置长达 30 分钟。

从针头上取下管子，用剃须刀片切开靠近水凝胶末端的管子边缘。然后，使用钝的 24 号针头将水凝胶挤出到 Tris 溶液中。目视检查凝胶是否有挤出过程中可能形成的或由于气泡而形成的任何缺陷，并丢弃任何有缺陷的凝胶。

启动乐器控制程序并打开音圈电机。然后，将线圈位置设置为接近范围末尾的值。沿 Z 方向移动弯钩，并在 X 方向的弯曲处对齐它们。

然后，记录 X 方向的千分尺螺钉的值。现在，在缝合线的末端打一个松散的双反手结，使环的直径约为 4 毫米。然后，从股线上剪下环。

重复以形成第二个循环。然后，将两个环放在连接到力传感器的挂钩上。用 Tris 缓冲液填充实验室，并使用医用镊子将水凝胶样品转移到填充的腔室中。

将音圈和力传感器钩子靠近溶液表面，并在各个方向上将钩子与 XYZ 定位纵器对齐。使用医用镊子，将蛋白质水凝胶样品的两侧挂在连接到音圈和力传感器的挂钩上。一个典型的错误是在连接过程中水凝胶样品周围的缝合环过度拧紧。

这可能会导致水凝胶样品形成缺口和切割。用医用镊子握住缝合环的两端并同时拉动它们，小心地收紧音圈钩上水凝胶样品周围的一个缝合环。对连接到力传感器的回路重复此步骤。

拧紧每个钩子弯曲处的缝合环，以防止任何打滑。使用这些弯曲作为参考点，以找到弯钩之间的零间距。使用医用剪刀剪断多余的缝合线。

使用 Z纵器沿 Z 轴将附着的水凝胶移向实验室，以将水凝胶浸入实验溶液中。使用纵器在 YZ 中对齐水凝胶样品，使凝胶不受任何压力。将力传感器归零，并使用 X 千分尺载物台将两个钩子分开，直到凝胶开始受到力。

发生这种情况后，将千分尺螺钉沿 X 方向稍微向后转动。记录音圈电机和传感器的两个纵器的位置。然后，使用这些值与之前测量的值之间的差值来计算实验开始时系绳钩之间的精确间隔。

要通过以所需的加载速率增加力来执行力-斜坡循环，请输入起始和最终力值，以及协议的持续时间，该持续时间显示为翻转的 V，然后是大约 200 秒的恒定低力，以允许蛋白质结构域在下一个循环之前重新折叠。通过施加低力 30 秒来执行恒定力协议。然后，在规定的时间内将力增加到恒定力，然后将力淬火到相同的低值超过 300 秒，以使蛋白质结构域重新折叠并恢复凝胶弹性。

最后，按照文本协议中的说明进行数据分析。每次测量都以松弛曲线开始。通过拟合两条线，可以确定传感器上的零力和真正的凝胶长度。

真正的凝胶长度是根据配合的交点和千分尺螺钉的位置计算得出的。力夹流变仪系统可以应用两种不同类型的方案。在力斜坡模式下，水凝胶样品会经历随时间变化的力变化方案，类似于倒置 V.In 恒定力模式，施加的应力以阶梯状模式变化。

在测量过程中，PID 系统通过改变线圈位置以遵循力协议中的预定义设定点来调整水凝胶延伸。然后通过将测得的延伸率除以真实凝胶长度来计算应变。应力是通过将施加的力除以水凝胶样品的横截面积来确定的。

Force Ramp 轨迹最好表示为应力与应变。杨氏模量可以根据加载阶段的斜率测量来计算。滞后给出了来自蛋白质去折叠和再折叠的能量耗散。

恒定力轨迹最好表示为时间的函数。应变的变化可用于通过拟合双指数来测量展开和再折叠速率。在尝试此过程时，请务必记住在添加蛋白质之前干燥管中的任何硅烷，离心蛋白质混合物以去除气泡，将蛋白质混合物注入管内后检查气泡，并在从管中挤出后丢弃任何机械损坏的水凝胶。

通常，刚接触这种方法的人一开始会遇到使用手术缝合线将凝胶连接到钩子上而不对水凝胶样品造成损坏的困难。从管中挤出凝胶也会损坏水凝胶。该方法可在小体积水凝胶样品上应用恒力方案。

这些实验允许弹性和粘弹性行为的解耦，以及以体方法研究蛋白质去折叠和折叠力学。开发后，该技术使材料科学领域的研究人员能够探索新的软生物材料，例如基于工程多蛋白的水凝胶，这些水凝胶具有用作组织工程支架、药物输送系统和 3D 打印生物墨水的极好潜力。这种方法不仅可以深入了解基于蛋白质的水凝胶的力学，还可以应用于其他系统，例如测量肌肉纤维的等长响应或皮肤等组织的弹性。