通过激活载脂蛋白E缺陷小鼠的盐皮质激素受体诱导动脉粥样硬化斑块形成

该方法有助于解答小鼠早期动脉粥样硬化病理生理学中的关键问题。该技术的主要优势在于其高效性和快速性，能够迅速诱导成年小鼠形成动脉粥样硬化斑块。此方法的可视化演示至关重要，因为某些技术步骤仅通过文字说明难以掌握。

本实验操作将由我实验室的科研人员 Caterina Mammi 演示。戴上外科手套后，将微型泵填充管连接至1毫升注射器，并向管内加入125微升醛固酮溶液或溶剂对照溶液。将填充管从微型泵顶部的小孔插入，直至无法继续推进，然后缓慢将醛固酮溶液注入泵内。

当液滴从泵体中上升时停止填充，并小心移除填充管。将流量调节器插入微型泵体内，注意确保调节器紧密贴合泵体，并将已填充的泵置于含有无菌生理盐水的烧杯中，在37摄氏度下预启动最多24小时，然后再进行植入。植入泵时，使用剃刀去除手术部位的毛发，并用浸透70%异丙醇的无纺布材料对暴露的皮肤进行消毒。

接下来，通过皮肤做一个0.8至1厘米的切口，但不要切到下方组织，用镊子打开切口。另一只手使用套管针，将皮肤撑开，从切口处朝肩胛骨方向分离出一个皮下囊腔，然后将泵插入切口，使调节器头部朝向小鼠前方，轻柔地将泵完全推入囊腔，确保留有足够的皮肤以无张力、不牵拉的方式闭合伤口。泵植入后，用手术缝线缝合切口，并使用干净的棉签涂抹局部10%聚维酮碘软膏。

然后将小鼠置于加热板上，在密切监测下恢复，直至完全恢复卧姿。在适当的实验终点，通过左心室进行重力灌注，先使用10至15毫升冰冻DPBS灌注，随后使用40至50毫升10%中性缓冲液固定液灌注。10至20分钟后，将小鼠置于体视显微镜下，用镊子和剪刀去除多余的主动脉周围和心包周围脂肪组织。

用镊子夹住固定的心脏，尽可能靠近心脏处，沿主动脉弓走向垂直剪切，注意不要造成损伤。心脏与主动脉分离后，使用解剖刀沿一条直线横向切割，连接右心房和左心房的下缘，并将最佳切割温度包埋剂（OCT）填充至开放心脏的上部。将切除的组织置于冷冻切片塑料模具中，使主动脉轴线垂直于矩形模具的底面，并用新鲜的OCT覆盖组织。

用背光照射模具以确保组织方向正确，然后小心地将模具放置在干冰上的金属板上，当OCT变白后，用锡箔纸包裹整个模具，于-80摄氏度保存。当冷冻切片机温度达到-20摄氏度时，将冷冻的心脏组织块安装到样品架上，使心室面朝外，并将样品架插入切片机的样品定位头中。调整样品架的方向，使组织块的主动脉根部与刀刃垂直，然后切削组织块直至暴露出主动脉根部。

将连续切片收集到玻璃载片上，观察解剖学主动脉根部轮廓，直至三个主动脉瓣均出现。随后再收集6至8张厚度为10 µm的切片，或持续收集至其中一个主动脉瓣消失或不再完整为止。进行油红O中性脂肪染色时，将切片置于70 mL的37%甲醛中固定5分钟，随后用自来水充分洗涤。

孵育2至3分钟后，吸去多余的水分，将切片置于70毫升0.3%油红O溶液中染色10分钟。染色结束后，用自来水冲洗载玻片10分钟，随后在70毫升迈耶苏木精染液中复染细胞1分钟，接着用自来水冲洗1分钟，再浸入70毫升0.5%碳酸锂溶液中1分钟。最后再用自来水冲洗1分钟，用 aqueous 封片剂封片，以便进行光学显微镜成像。

经过四周的治疗后，载脂蛋白E基因敲除小鼠的脂质含量较对照组野生型动物显著增加。此外，盐皮质激素醛固酮的处理增加了基因敲除动物体内巨噬细胞的含量，这通过Mac-3染色得以证实，表明与溶剂处理的小鼠相比，这些动物的动脉粥样硬化斑块炎症程度更高。然而，醛固酮处理并不改变动脉粥样硬化斑块的胶原蛋白含量。

在进行该操作时，需要注意的是，该方法仅针对载脂蛋白小鼠进行了验证，这类小鼠在喂食致动脉粥样硬化染料后会自然倾向于发展出动脉粥样硬化。因此，该方法不能应用于其他动物模型。在完成该操作后，可进一步采用如油红O染色等其他方法，以表征主动脉其他区域的动脉粥样硬化情况，并量化总体动脉粥样硬化负荷。

该技术问世后，为动脉粥样硬化领域的研究人员探索动脉粥样硬化早期发生机制（如炎症反应和内皮功能障碍）提供了重要途径。请务必注意，操作异丙醇和福尔马林等挥发性化合物时可能存在极高危险性，因此在进行该实验操作时，应始终采取必要的防护措施，例如佩戴实验室安全面罩。