Name: 迭代漂白的优化工作流程扩展了高度自发荧光临床样品的多重成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习迭代漂白光辐照技术，用于减少人体组织自发荧光并保留抗体信号，实现多重全切片成像。该方法可清晰显示肉芽肿、免疫细胞及结核分枝杆菌的空间分布。

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本工作由美国国家过敏与传染病研究所（DIR/NIAID）、国家癌症研究所（NCI）和国家心肺血液研究所（NHLBI）的院内研究计划资助。图1 使用 BioRender 软件在 NIH 机构许可协议下制作。

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A.J.R. 就职于 Leica Microsystems, Inc. 其他作者声明无竞争利益。

肺结核的临床肺部病理特征为坏死性肉芽肿性炎症。非结核分枝杆菌（NTM）肺部病理主要发生在两类不同的患者群体中，并呈现两种独立的病理模式：在免疫功能正常的个体中，表现为以肉芽肿性炎症、细支气管闭塞和空洞形成为特征的孤立性肺损伤；在免疫功能低下个体中，则表现为累及肺部及其他器官的弥漫性结节性疾病13,14,15,16。在比较这三种不同类型的分枝杆菌肺部病理时，目前对局部炎症中免疫细胞组成的异同、细胞间相互作用的空间背景，以及损伤部位促炎性与调节性细胞因子产生的特征仍知之甚少。我们对罕见的人类历史存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织尸检及手术切除样本应用了IBEX技术，该技术使我们能够在组织空间内对多种肺部病理形式进行表征5。
将IBEX方案应用于这些人类肺组织切片时遇到了诸多挑战...

结核病（TB）是导致死亡的主要原因之一，每年约有130万人死于结核感染1。尽管非结核分枝杆菌（NTM）引起的肺部感染致死性不及结核病，但近年来由NTM引发的肺部感染及其相关疾病显著增加2。在组织层面，肺部Mycobacterium tuberculosis（Mtb）感染所引发的宿主免疫反应已被广泛研究，其中包括肉芽肿的形成，即淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等组成的异质性聚集结构3。虽然肉芽肿性炎症同样是宿主对NTM感染免疫反应的基本特征，但参与该反应的免疫细胞群体及其空间分布特征仍缺乏深入研究。深入理解免疫病理过程与组织修复过程中组织成分的差异，对于开发治疗手段（例如宿主导向疗法）和预防策略（如疫苗）至关重要。
在本研究中，我们的团队获得了来自结核分枝杆菌（Mtb）或非结核分枝杆菌（NTM）感染患者肺部切除术或尸检过程中采集的稀有存档临床样本。这些样本大多已超过10年，以甲醛固定、石蜡包埋（FFPE）形式保存，因此仅可用于组织学检测。为了克服传统免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）成像在标记数量上的限制，我们采用了迭代漂白扩展多重性&#160;（IBEX）方法，这是一种开源的高通量多重成像技术4,5。由于人肺FFPE样本具有较高的内源性荧光，将IBEX方法拓展应用于此类样本需要进行大量优化，而内源性荧光是多重抗体成像中已被广泛报道的技术障碍6。
本文提供了利用光照射法降低肺组织FFPE切片自发荧光的详细操作流程7,8。重要的是，此处描述的方法使用了一种价格低廉且广泛可得的光照箱，该装置可推广应用于其他具有高自发荧光的样本制备。除了在成像前降低自发荧光外，本文还提供了抗体面板设计的指导建议，包括将低丰度标记物与高亮度荧光染料配对、评估光照射对抗体标记的影响，以及在自发荧光较强的通道中使用二抗进行信号放大。通常情况下，我们每例组织切片处理5张玻片，每张面积介于37至114 mm2之间。最后，我们展示了如何使用宽场成像仪器获取全切片图像。综上所述，本方案描述了将IBEX技术应用于存档临床样本的具体方法，并进一步提供了针对高自发荧光样本成像过程中常见问题的故障排除指导。

<table><tbody><tr><td>0.3% Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>封闭缓冲液配制溶液</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>封闭缓冲液配制溶液</td></tr><tr><td>1% Human BD Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>封闭缓冲液所需 Fc 封闭剂</td></tr><tr><td>150 W LED lamp</td><td>Amazon</td><td>B07VH3CVSF</td><td>组织光辐照用 LED 光源</td></tr><tr><td>1x PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>封闭缓冲液及洗涤步骤用溶液</td></tr><tr><td>20 Gallon Storage Container</td><td>Amazon</td><td>B001B1C4G0</td><td>光辐照过程用容器</td></tr><tr><td>40 W RGBW flood LED lamp&amp;nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B08QFPJSMD</td><td>组织光辐照用 RGB 光源</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Alpha-smooth muscle actin DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td><td>Abcam</td><td>ab64212</td><td>亲和素与生物素封闭溶液</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>固定溶液</td></tr><tr><td>BOND Dewax Solution</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>脱蜡溶液</td></tr><tr><td>BOND Epitope Retrieval Solution 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>柠檬酸盐缓冲液（pH 6）抗原修复溶液（ER1）</td></tr><tr><td>BOND Epitope Retrieval Solution 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>EDTA 缓冲液（pH 9）抗原修复溶液（ER2）</td></tr><tr><td>BOND Research Detection System</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>自动化科研染色试剂</td></tr><tr><td>BOND RX Research Stainer</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>自动化科研染色平台</td></tr><tr><td>BOND Wash Solution</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>347420/AB_400298</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>CD45 Phycoerythrin (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>EasyDip Staining System</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300KIT</td><td>玻片染色系统</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>IBEX 成像用核染色剂。见表1。</td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instruments</td><td></td><td>免费文件转换软件</td></tr><tr><td>ImarisViewer software x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instruments</td><td></td><td>免费图像处理软件</td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>疏水屏障笔</td></tr><tr><td>Lithium Borohydride (1 gram)</td><td>STREM Chemicals</td><td>93-0397</td><td>染料失活用化学品，建议购买小份量（1 克）</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF2846</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>IBEX 成像抗体。见表1。</td></tr><tr><td>PELCO BioWave Pro Microwave System</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>非加热型科研微波系统</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>科研微波系统全自动温控装置</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Open source software</td><td></td><td>图像配准与通道处理软件</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>IBEX 成像标记试剂。见表1。</td></tr><tr><td>Widefield Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Microsystems THUNDER 成像系统，配备 LED8 光源及 LAS X 软件（3.7.1.21655）。荧光成像时使用定制四通道滤光片及外置滤光轮（PN: 11536075），并加装两个单通道滤光片（PN: 8118215），实现每轮成像采集七个染料通道。滤光片激发、二向色镜及发射波长如下：（1）四通道滤光立方体：二向色镜波长为 391/32、479/33、554/24、638/31，无激发或发射滤光片；（2）外置滤光轮位置1：434/32，位置2：520/40，位置3：585/20，位置4：720/60，位置5：透射；（3）单通道1&amp;mdash;激发585/22，二向色镜594，发射625/30；（4）单通道2&amp;mdash;激发635/20，二向色镜647，发射667/30。</td></tr><tr><td>Zeiss Optical Lens Cleaner</td><td>Amazon</td><td>B00GPVQVCO</td><td>显微镜物镜清洁剂</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019</td><td>多克隆兔IgG，第1轮</td></tr><tr><td>Alpha-smooth muscle actin DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1，第1轮</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB8165G</td><td>多克隆山羊IgG，第1轮</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>C8/144B，第1轮</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>KP1，第1轮</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32814</td><td>多克隆驴IgG，第1轮</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787</td><td>多克隆驴IgG，第1轮</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32794</td><td>多克隆驴IgG，第1轮</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>核标记，第1轮</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>347420</td><td>MMA，第2轮</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>L26，第2轮</td></tr><tr><td>CD45 Phycoerythrin (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26，第2轮</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020</td><td>多克隆驴IgG，第2轮</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF2846</td><td>多克隆山羊IgG，第2轮</td></tr><tr><td>Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3，第2轮</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>N/A，第2轮</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>第2轮</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;封闭缓冲液（第1轮）&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>体积比0.3%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>体积比1%</td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>体积比1%</td></tr><tr><td>1x PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>体积比97.7%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗染色溶液 #1（第1轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（第1轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗染色溶液 #2（第1轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（第1轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>CD4&amp;nbsp;AF488</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗染色溶液 #1（第1轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（第1轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗染色溶液 #3（第1轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（第1轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;无BSA封闭缓冲液（第2轮）&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>体积比0.3%</td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>体积比1%</td></tr><tr><td>1x PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>体积比98.7%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗染色溶液 #4（第2轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无BSA封闭缓冲液（第2轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-Cytokeratin AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗染色溶液 #2（第2轮）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无BSA封闭缓冲液（第2轮）</td><td>见上文</td><td></td><td>加入抗体后补足体积</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgM AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strepavidin AF594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

由非结核分枝杆菌（NTM）引起的肺部疾病在全球范围内的发病率正不断上升。尽管NTM所致肺部疾病常表现为支气管扩张、肺部结节和空洞性病变，但针对这些不同肺损伤模式的宿主免疫反应在原位尚未得到充分表征。in situ。本研究旨在通过深入分析NTM肺病患者肺组织中免疫细胞群体的表型特征，以评估NTM所致病理的潜在机制，并与肉芽肿性炎症的金标准——结核性（TB）肺病进行比较。
对播散性非结核分枝杆菌（NTM）、肺部 NTM 或肺结核（TB）疾病患者的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肺组织块进行切片，并采用改良的迭代漂白扩展多重性（IBEX）成像方法进行染色。首先需要优化 IBEX 方法，以解决肺组织切片中显著的内源性荧光问题，该问题源于肺组织固有的高密度胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞，且因 FFPE 保存方式及 FFPE 组织块的存放时间而加剧。在本方案中，我们详细描述了一种光照射处理程序和改良的抗原修复方法，可降低临床存档样本的自发荧光。
此外，我们提供了关于抗体面板设计的指导，包括常见的挑战，如交叉反应性、光照射后表位丢失、相邻荧光染料之间的光谱重叠，以及某些靶标的信噪比较低等问题。为了高效地对整个肺组织切片进行成像，载玻片使用宽场显微镜成像，并利用开源软件进行后期处理以提高图像质量。该工作流程共同解决了关键需求，记录了如何利用广泛可得的仪器和试剂，从难以处理的样本中获得高多重、高分辨率的全片图像。除了临床样本的定量成像外，这些技术还可应用于多种样本类型，以克服内源性和外源性荧光来源的干扰。

设计基于多重抗体的成像面板需要耗费大量时间、精力和资源12。当针对本研究中所述的高自发荧光组织的存档FFPE样本设计面板时，这些挑战尤为突出（图1）。为克服这些挑战，我们首先筛选出与我们的染料失活方案兼容的最亮荧光染料（表1）。例如，据报告，Alexa Fluor Plus二抗在免疫荧光检测中的信噪比比其Alexa Fluor对应物高出4倍（来源：AF Plus产品数据表）。其次，我们将高亮度荧光染料与低表达标记物配对，并在可能的情况下，通过一抗与二抗或链霉亲和素-生物素系统进行间接免疫标记以增强信号（表1）。第三，自发荧光在光照射后会降低（图3A），且在较长波长下成像时也会减弱（图3B）。基于此，我们将直接偶联抗体用于检测高表达的结构标记物——α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和广谱细胞角蛋白（PanCK），并将其置于近红外通道（750 nm）；...

将低成本、多功能的光照射技术与手动IBEX方法相结合，可实现对具有显著本底自发荧光的人体组织进行优化成像。本方案详细介绍了如何利用倒置显微镜、广泛可得的试剂以及开源软件，对存档的临床样本获取多重标记的全片图像，并进行图像配准与处理。

由非结核分枝杆菌（NTM）引起的肺部疾病在全球范围内的发病率正不断上升。尽管NTM所致肺部疾病常表现为支气管扩张、肺结节和空洞性病变，但针对这些不同肺损伤模式相关的宿主免疫反应，目前尚缺乏原位的充分表征。本研究旨在通过深度表型分析NTM肺病患者肺组织中的免疫细胞群体，并与结核性（TB）肺病这一肉芽肿性炎症的金标准进行比较，以评估NTM所致病理损伤的潜在机制。我们采用改良的迭代漂白扩展多重成像法（Iterative Bleaching Extends multi-pleXity, IBEX）对播散性NTM、肺部NTM或肺结核（TB）患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织块进行切片与染色。由于肺组织富含胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞，其内源性自发荧光较强，且经FFPE处理及石蜡块长期储存后进一步加剧，因此在应用IBEX方法前需进行优化。在本方案中，我们详细描述了一种光照射处理程序及改良的抗原修复方法，可有效降低临床存档样本的自发荧光。此外，我们还提供了抗体组合设计的指导建议，涵盖常见挑战，如交叉反应性、光照射后表位丢失、相邻荧光染料间的光谱重叠，以及某些靶标的信噪比较低等问题。为实现对整张肺组织切片的高效成像，我们使用宽场显微镜对切片进行扫描，并利用开源软件进行图像后处理以提升图像质量。综上，该工作流程通过广泛可及的仪器与试剂，系统记录了如何从具有挑战性的样本中获取高重、高分辨率的全片图像，满足了该领域的一项关键需求。除临床样本的定量成像外，这些技术还可推广应用于多种样本类型，以克服内源性和外源性荧光干扰。

[讲述者] 利用被《自然-方法》（Nature Methods）评为2024年度方法的空间蛋白质组学技术，可以在组织内精确定位免疫细胞并绘制细胞间的相互作用图谱，从而揭示与临床结局相关联的空间模式。构建复杂的抗体面板以及对具有高内源性荧光的组织进行成像，对于IBEX及其他荧光显微技术而言，在时间、资源和专业技术方面均构成重大挑战。通过使用IBEX技术，已在高危滤泡性淋巴瘤患者中鉴定出肿瘤特异性特征，并与人类细胞图谱（Human Cell Atlas）合作团队共同构建了人类胸腺的全面空间图谱。目前对于不同类型分枝杆菌肺部疾病中免疫细胞组成、空间相互作用以及细胞因子产生差异仍知之甚少。本方案填补了这一空白。本方案提供了一种低成本、可灵活调整的光照射方法，可显著降低宽谱组织自发荧光，尤其适用于难以处理的FFPE样本，同时保留抗体信号以用于空间分析。开始操作时，在完成抗原修复后，将载玻片连同组织浸入PBS中。从PBS中取出一张载玻片，使用无绒布小心擦去所有多余缓冲液，避免接触组织。用疏水笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。对剩余载玻片重复此过程后，让疏水屏障干燥10分钟。然后使用无绒布将组织切片上的PBS吸除，避免直接接触组织。接着在载玻片上加入200微升封闭缓冲液，并盖上湿盒盖子。将湿盒放入带有温度调控装置的非加热科学微波炉中，运行预先设定的程序，循环五次。在封闭孵育期间，使用钩子和含Fc阻断剂的封闭缓冲液配制第一轮一抗染色溶液。将抗体混合并轻轻混匀。微波程序完成后，取出并打开载玻片湿盒，用无绒布吸除封闭缓冲液，避免接触组织。随后在载玻片上加入200微升第一轮一抗染色溶液。将湿盒放回微波炉，再次执行一抗程序，持续约30分钟。一抗标记完成后，将载玻片垂直持握。清洗时，用移液器将1,000微升PBS滴加至组织上，使其自然流下。吸除多余PBS，并在湿盒中用1%多聚甲醛于室温固定10分钟。固定后，用1,000微升PBS彻底清洗载玻片三至五次，并在组织上保留一层PBS，直至进入光照射步骤。准备光照射箱时，需准备一个150瓦LED灯、一个40瓦RGBW泛光LED灯、一个容量为75.71升或更大的大型塑料容器、新鲜PBS和一个培养皿。将培养皿中加入1×PBS，确保完全浸没载玻片。在低温室中进行光照射操作，以最大限度减少灯具产生的热量。然后将载玻片放入培养皿中，确保其完全浸没于PBS中。接着将40瓦灯具直接置于培养皿正上方，光源朝下对准载玻片，并将灯具设置为红光模式。最后打开150瓦和40瓦灯具，并用塑料容器盖子完全覆盖整个装置。两小时后，将灯具切换至绿光模式，继续孵育16小时。在染料失活方案中，选择与表达水平较低的标记物配对的最亮荧光染料，以增强信号检测。光照射后，自发荧光显著降低，尤其在较长成像波长下效果更明显。在750纳米近红外通道中，使用直接偶联抗体替代靶向高表达结构标记物——α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin）的检测。通过未染色参考图像和SimpleITK算术运算进行计算背景信号扣除，并通过阈值设定增强真实信号。对IBEX染色切片进行全切片成像，揭示出具有坏死核心的肉芽肿及CD15阳性中性粒细胞。利用抗原85B抗体在肉芽肿坏死核心附近检测到结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）或非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria）。肉芽肿相关淋巴组织中含有CD20阳性B细胞、CD4阳性T细胞、少量CD8阳性T细胞，以及标记肺内所有免疫细胞的CD45。IBEX成像还实现了肺部解剖结构特征的可视化，包括支气管上皮细胞、动脉平滑肌和CD68阳性巨噬细胞。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

迭代漂白的优化工作流程扩展了高度自发荧光临床样品的多重成像

生物样本的背景自发荧光常常使基于荧光的成像技术复杂化，尤其是在老年个体的终末分化组织中尤为明显。本方案描述了如何利用市售的发光二极管光源，在免疫染色前对样本进行光漂白，从而有效去除这些样本中的自发荧光。...

简单去除福尔马林固定人脑组织中背景荧光以进行免疫荧光显微镜检测

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。...

优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

多重循环免疫组织化学技术能够 原位...

多重循环荧光免疫组织化学

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。...

用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

迭代漂白扩展多重性（IBEX）技术与商用核苷酸标记试剂盒（Click-iT...

高通量成像与分析工作流程用于评估组织样本中皮肤细胞表型及增殖状态

本文介绍了迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法的应用，该方法利用市售的自动化组织染色仪，并针对基于酪酰胺信号放大技术的试剂在使用过程中的优化因素进行了探讨。...

迭代漂白结合染色自动化技术扩展核心设施中的多重检测能力

本文介绍了一种用于表征腹膜转移灶三维结构的多重免疫荧光染色方案。...

采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。...

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

学习迭代漂白光辐照技术，用于减少人体组织自发荧光并保留抗体信号，实现多重全切片成像。该方法可清晰显示肉芽肿、免疫细胞及结核分枝杆菌的空间分布。

高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

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