高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

[讲述者] 利用被《自然-方法》（Nature Methods）评为2024年度方法的空间蛋白质组学技术，可以在组织内精确定位免疫细胞并绘制细胞间的相互作用图谱，从而揭示与临床结局相关联的空间模式。构建复杂的抗体面板以及对具有高内源性荧光的组织进行成像，对于IBEX及其他荧光显微技术而言，在时间、资源和专业技术方面均构成重大挑战。通过使用IBEX技术，已在高危滤泡性淋巴瘤患者中鉴定出肿瘤特异性特征，并与人类细胞图谱（Human Cell Atlas）合作团队共同构建了人类胸腺的全面空间图谱。目前对于不同类型分枝杆菌肺部疾病中免疫细胞组成、空间相互作用以及细胞因子产生差异仍知之甚少。本方案填补了这一空白。本方案提供了一种低成本、可灵活调整的光照射方法，可显著降低宽谱组织自发荧光，尤其适用于难以处理的FFPE样本，同时保留抗体信号以用于空间分析。开始操作时，在完成抗原修复后，将载玻片连同组织浸入PBS中。从PBS中取出一张载玻片，使用无绒布小心擦去所有多余缓冲液，避免接触组织。用疏水笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。对剩余载玻片重复此过程后，让疏水屏障干燥10分钟。然后使用无绒布将组织切片上的PBS吸除，避免直接接触组织。接着在载玻片上加入200微升封闭缓冲液，并盖上湿盒盖子。将湿盒放入带有温度调控装置的非加热科学微波炉中，运行预先设定的程序，循环五次。在封闭孵育期间，使用钩子和含Fc阻断剂的封闭缓冲液配制第一轮一抗染色溶液。将抗体混合并轻轻混匀。微波程序完成后，取出并打开载玻片湿盒，用无绒布吸除封闭缓冲液，避免接触组织。随后在载玻片上加入200微升第一轮一抗染色溶液。将湿盒放回微波炉，再次执行一抗程序，持续约30分钟。一抗标记完成后，将载玻片垂直持握。清洗时，用移液器将1,000微升PBS滴加至组织上，使其自然流下。吸除多余PBS，并在湿盒中用1%多聚甲醛于室温固定10分钟。固定后，用1,000微升PBS彻底清洗载玻片三至五次，并在组织上保留一层PBS，直至进入光照射步骤。准备光照射箱时，需准备一个150瓦LED灯、一个40瓦RGBW泛光LED灯、一个容量为75.71升或更大的大型塑料容器、新鲜PBS和一个培养皿。将培养皿中加入1×PBS，确保完全浸没载玻片。在低温室中进行光照射操作，以最大限度减少灯具产生的热量。然后将载玻片放入培养皿中，确保其完全浸没于PBS中。接着将40瓦灯具直接置于培养皿正上方，光源朝下对准载玻片，并将灯具设置为红光模式。最后打开150瓦和40瓦灯具，并用塑料容器盖子完全覆盖整个装置。两小时后，将灯具切换至绿光模式，继续孵育16小时。在染料失活方案中，选择与表达水平较低的标记物配对的最亮荧光染料，以增强信号检测。光照射后，自发荧光显著降低，尤其在较长成像波长下效果更明显。在750纳米近红外通道中，使用直接偶联抗体替代靶向高表达结构标记物——α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin）的检测。通过未染色参考图像和SimpleITK算术运算进行计算背景信号扣除，并通过阈值设定增强真实信号。对IBEX染色切片进行全切片成像，揭示出具有坏死核心的肉芽肿及CD15阳性中性粒细胞。利用抗原85B抗体在肉芽肿坏死核心附近检测到结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）或非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria）。肉芽肿相关淋巴组织中含有CD20阳性B细胞、CD4阳性T细胞、少量CD8阳性T细胞，以及标记肺内所有免疫细胞的CD45。IBEX成像还实现了肺部解剖结构特征的可视化，包括支气管上皮细胞、动脉平滑肌和CD68阳性巨噬细胞。