迭代漂白的优化工作流程扩展了高度自发荧光临床样品的多重成像
July 11th, 2025
使用手动 IBEX 方法实施低成本、多功能的光照射技术，可以对具有显着天然自发荧光的人体组织进行最佳成像。该协议详细介绍了如何使用倒置显微镜、广泛可用的试剂以及用于图像对齐和处理的开源软件从存档的临床样本中获得多路复用的全玻片图像。
[旁白]使用被评为 Nature Methods 的 2024 年度方法的空间蛋白质组学，可以在组织内绘制免疫细胞的精确位置以及细胞间相互作用。这揭示了与临床结果相关的空间模式。构建具有高内源性荧光的复杂抗体组合和成像组织给 IBEX 和其他荧光显微镜技术带来了巨大的时间、资源和专业知识挑战。使用 IBEX，在高危滤泡性淋巴瘤患者和 Human Cell Atlas 同事中确定了肿瘤特异性特征。创建了人类胸腺的综合空间图。人们对不同分枝杆菌肺部病理学的免疫细胞组成、空间相互作用和细胞因子产生差异知之甚少。该协议弥合了这一差距。该协议提供了一种低成本、适应性强的光照射方法，可显着减少广谱组织自发荧光，特别是在困难的FFPE样品中，同时保留用于空间分析的抗体信号。首先，在完成抗原修复后，将载玻片与组织一起浸入PBS中。从 PBS 中取出一张载玻片，并使用无绒湿巾小心地擦干所有多余的缓冲液，不要接触组织。用疏水笔在载玻片上的组织部分周围画一个边框。对剩余的载玻片重复该过程后，让疏水屏障干燥 10 分钟。然后，使用无绒湿巾，从组织切片上吸走PBS，而不直接接触组织。现在在载玻片上加入 200 微升封闭缓冲液并关闭水分室。将腔室放入具有温度调节机制的非加热科学微波炉中，并运行先前建立的程序五个循环。在封闭孵育过程中，用钩子制备一抗染色溶液1和含有Fc封闭的封闭缓冲液。混合抗体并轻轻混合鸡尾酒。微波循环完成后，取出并打开载玻片室，并在不接触组织的情况下从载玻片上吸出阻断缓冲液。接下来，向载玻片中加入 200 微升一抗染色溶液 1。将腔室放回微波炉并再次执行一抗程序约 30 分钟。一抗标记完成后，垂直握住载玻片。要清洗载玻片，请将 1,000 微升 PBS 移液到组织上，使其流出。吸去多余的PBS，并在室温下在湿度室中用1%多聚甲醛固定载玻片10分钟。固定后，用1,000微升PBS彻底洗涤载玻片三到五次，并在组织上留下一层PBS，直到光照射步骤。准备光照射盒时，准备一盏 150 瓦 LED 灯、一盏 40 瓦 RGBW 泛光 LED 灯、一个容量为 75.71 升或以上的大塑料容器、新鲜的 PBS 和培养皿。现在用 1x PBS 填充培养皿以完全浸没载玻片。在冷藏室中进行光照射程序，以尽量减少灯的热量。然后将载玻片放入培养皿中，确保其完全浸没在PBS中。接下来，将 40 瓦灯直接放在培养皿上方，光源朝下朝向幻灯片，并将灯设置为红灯模式。最后，打开 150 瓦和 40 瓦灯，并用塑料容器盖盖住整个装置。两小时后，将灯切换为绿灯并孵育16小时。鉴定出与染料灭活方案兼容的最亮荧光团，并与低表达标记物配对以增强信号检测。光照射后，自发荧光在较长的成像波长下显着降低。靶向高表达结构标记物α-平滑肌肌动蛋白和泛细胞角蛋白的直接偶联抗体，在750纳米的近红外通道中被替换。 使用未染色的参考图像和 SimpleITK 算术对背景信号进行计算减去，并通过阈值增强真实信号。IBEX 染色切片的全玻片成像显示具有坏死核心的肉芽肿和 CD15 阳性中性粒细胞。使用抗抗原85B抗体在肉芽肿坏死核心附近检测结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌。肉芽肿相关淋巴组织含有CD20阳性B细胞、CD4阳性T细胞、少数CD8阳性T细胞和肺部所有免疫细胞的CD45标记。IBEX 成像还能够可视化肺部解剖特征，包括支气管上皮细胞、动脉平滑肌和 CD68 阳性巨噬细胞。
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概述
本文介绍了一种低成本的光照技术，该技术增强了具有天然自体荧光的人体组织的成像。该协议允许使用广泛可获得的试剂和开源软件，对存档的临床样本进行多重化、全片成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 荧光显微镜
背景
- 空间蛋白质组学能够绘制组织内的免疫细胞及其相互作用的地图。
- 在构建抗体组和成像具有高内源荧光的组织方面存在挑战。
- IBEX技术识别高风险淋巴瘤患者的肿瘤特异性特征。
- 对分枝杆菌肺病理中的免疫细胞组成知之甚少。
研究目的
- 提供一种减少组织自体荧光同时保留抗体信号的协议。
- 促进复杂组织样本中免疫细胞的空间分析。
- 弥合各种病理中免疫细胞相互作用的知识空白。
使用的方法
- 抗原回收后，将含有组织的载玻片浸入PBS中。
- 制备并应用阻断缓冲液和一抗溶液。
- 使用特定的LED灯进行光照，以减少自体荧光。
- 进行全片成像以可视化免疫细胞相互作用和组织特征。
主要结果
- 经过光照后，自体荧光显著减少。
- 肺组织中的肉芽肿和免疫细胞类型得以可视化。
- 特定抗体在坏死核心附近检测到结核分枝杆菌。
- IBEX成像揭示了肺组织的详细解剖特征。
结论
- 该协议在最小化自体荧光的同时增强了复杂组织的成像。
- 它为研究各种疾病中的免疫细胞相互作用提供了宝贵的工具。
- 这种方法可以适应广泛的临床应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
