迭代漂白的优化工作流程扩展了高度自发荧光临床样品的多重成像

[旁白]使用被评为 Nature Methods 的 2024 年度方法的空间蛋白质组学，可以在组织内绘制免疫细胞的精确位置以及细胞间相互作用。这揭示了与临床结果相关的空间模式。构建具有高内源性荧光的复杂抗体组合和成像组织给 IBEX 和其他荧光显微镜技术带来了巨大的时间、资源和专业知识挑战。使用 IBEX，在高危滤泡性淋巴瘤患者和 Human Cell Atlas 同事中确定了肿瘤特异性特征。创建了人类胸腺的综合空间图。人们对不同分枝杆菌肺部病理学的免疫细胞组成、空间相互作用和细胞因子产生差异知之甚少。该协议弥合了这一差距。该协议提供了一种低成本、适应性强的光照射方法，可显着减少广谱组织自发荧光，特别是在困难的FFPE样品中，同时保留用于空间分析的抗体信号。首先，在完成抗原修复后，将载玻片与组织一起浸入PBS中。从 PBS 中取出一张载玻片，并使用无绒湿巾小心地擦干所有多余的缓冲液，不要接触组织。用疏水笔在载玻片上的组织部分周围画一个边框。对剩余的载玻片重复该过程后，让疏水屏障干燥 10 分钟。然后，使用无绒湿巾，从组织切片上吸走PBS，而不直接接触组织。现在在载玻片上加入 200 微升封闭缓冲液并关闭水分室。将腔室放入具有温度调节机制的非加热科学微波炉中，并运行先前建立的程序五个循环。在封闭孵育过程中，用钩子制备一抗染色溶液1和含有Fc封闭的封闭缓冲液。混合抗体并轻轻混合鸡尾酒。微波循环完成后，取出并打开载玻片室，并在不接触组织的情况下从载玻片上吸出阻断缓冲液。接下来，向载玻片中加入 200 微升一抗染色溶液 1。将腔室放回微波炉并再次执行一抗程序约 30 分钟。一抗标记完成后，垂直握住载玻片。要清洗载玻片，请将 1,000 微升 PBS 移液到组织上，使其流出。吸去多余的PBS，并在室温下在湿度室中用1%多聚甲醛固定载玻片10分钟。固定后，用1,000微升PBS彻底洗涤载玻片三到五次，并在组织上留下一层PBS，直到光照射步骤。准备光照射盒时，准备一盏 150 瓦 LED 灯、一盏 40 瓦 RGBW 泛光 LED 灯、一个容量为 75.71 升或以上的大塑料容器、新鲜的 PBS 和培养皿。现在用 1x PBS 填充培养皿以完全浸没载玻片。在冷藏室中进行光照射程序，以尽量减少灯的热量。然后将载玻片放入培养皿中，确保其完全浸没在PBS中。接下来，将 40 瓦灯直接放在培养皿上方，光源朝下朝向幻灯片，并将灯设置为红灯模式。最后，打开 150 瓦和 40 瓦灯，并用塑料容器盖盖住整个装置。两小时后，将灯切换为绿灯并孵育16小时。鉴定出与染料灭活方案兼容的最亮荧光团，并与低表达标记物配对以增强信号检测。光照射后，自发荧光在较长的成像波长下显着降低。靶向高表达结构标记物α-平滑肌肌动蛋白和泛细胞角蛋白的直接偶联抗体，在750纳米的近红外通道中被替换。 使用未染色的参考图像和 SimpleITK 算术对背景信号进行计算减去，并通过阈值增强真实信号。IBEX 染色切片的全玻片成像显示具有坏死核心的肉芽肿和 CD15 阳性中性粒细胞。使用抗抗原85B抗体在肉芽肿坏死核心附近检测结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌。肉芽肿相关淋巴组织含有CD20阳性B细胞、CD4阳性T细胞、少数CD8阳性T细胞和肺部所有免疫细胞的CD45标记。IBEX 成像还能够可视化肺部解剖特征，包括支气管上皮细胞、动脉平滑肌和 CD68 阳性巨噬细胞。