Name: 样品室光片荧光显微镜中多个昆虫胚胎的同步实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习使用光片荧光显微镜对多个昆虫胚胎进行同步实时成像的方法。本研究利用蛛网支架堆叠果蝇胚胎，有效减少环境差异并提高成像通量，为发育生物学比较研究提供可靠技术支持。

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我们感谢Ernst H. K. Stelzer提供使用其资源的机会，以及他对本手稿提出的宝贵意见；感谢Anita Anderl在赤拟谷盗（Tribolium）活体成像方面的支持；感谢Sven Plath提供的技术支持；同时感谢Ilan Davis、Nicole Grieder和Gerold Schubiger通过Bloomington Stock Center共享他们的转基因果蝇（Drosophila）品系。

1. 准备工作
<ol>
	<li>根据科学问题选择适合的光片显微镜（LSFM）照明物镜/检测物镜/相机组合，并设置显微镜。视场大小等于相机芯片尺寸除以检测物镜的放大倍数。应选择照明物镜，使整个视场被一个近似平面的光片覆盖34。三种推荐组合见表1。</li>
	<li>制备琼脂糖分装样品和回收培养皿时，将2 g低熔点琼脂糖加入200 mL经高压灭菌的自来水，于微波炉中以600–800 W加热，直至所有琼脂糖颗粒完全溶解。将若干份1 mL琼脂糖溶液分装至1.5 mL或2 mL离心管中，再将若干90 mm Ø培养皿倒入3–5 mm高的琼脂糖。将凝固后的分装样品和培养皿于4 °C保存。</li>
	<li>对于Drosophila：为准备新鲜培养管，煮制适量自制或市售的Drosophila培养基，将5–15 mL转移至宽口培养管中，并于4 °C保存。为制备产卵培养皿，将1 g低熔点琼脂糖加入50 mL高压灭菌自来水中，于微波炉中以600–800 W加热至琼脂糖完全溶解。待溶液冷却至45 °C后，加入50 mL果汁（推荐苹果汁或红葡萄汁），充分混匀。将混合液倒入35 mm Ø培养皿中，凝固后于4 °C保存。</li>
	<li>对于Tribolium：为制备生长培养基，将全麦面粉和失活干酵母分别过710 µm孔径筛网，然后在过筛后的面粉中添加5%（w/w）过筛酵母。为制备产卵培养基，将细麦粉和失活干酵母分别过250 µm孔径筛网，然后在过筛后的面粉中添加5%（w/w）过筛酵母。</li>
</ol>
2. 使用荧光微球对基于样品腔的光片荧光显微镜进行校准
注意：校准的目的是对齐照明和检测物镜的焦点（图2A），因为这是获得清晰图像的前提。LSFM 应定期校准，至少每3至4周一次。
<ol>
	<li>将琼脂糖分装样品置于80 °C干式加热器/混匀仪中重新熔化，随后冷却至35 °C。</li>
	<li>将50 µL琼脂糖转移至1.5 mL反应管中，加入0.5 µL荧光微球溶液，以1,400 rpm振荡混匀1分钟。</li>
	<li>将10 µL琼脂糖/荧光微球溶液混合物填充至蛛网支架的槽孔中，然后尽可能吸除琼脂糖，仅保留一层薄薄的琼脂糖膜。静置30–60秒使其凝固。</li>
	<li>用高压灭菌的自来水填充样品室。缓慢将蛛网支架插入样品室，并移动带槽孔的微位移平台，使其位于检测透镜前方。</li>
	<li>将蛛网支架通过旋转台旋转至相对于照明（x）轴和检测（z）轴呈45°的位置。在透射光通道中不应看到蛛网支架。</li>
	<li>切换至相应的荧光通道，并调整激光功率和曝光时间，使荧光微球提供适当的信号。</li>
	<li>指定一个视场范围，确保完全覆盖当前呈横向取向的琼脂糖薄膜。通过计算最大可能的z轴间距来确定z轴步长。&#160;相应照明物镜/检测物镜组合的可能轴向分辨率34或者，可将横向分辨率的4倍作为粗略估算值。</li>
	<li>记录荧光微球的三维测试z轴堆栈，并将x、y和z方向的最大投影与校准图进行比较图2）。如果微球呈现模糊、轮廓不清和/或变形的情况（图2B，C），调整照明和/或检测物镜的位置。</li>
</ol>
3. Drosophila 胚胎的收集
<ol>
	<li>在成像实验前2-3天，将100-200只目标品系的黑腹果蝇（Drosophila）成虫转移至新鲜的培养管中，以建立胚胎收集培养体系。若尚无该品系的子代培养物，可考虑利用旧培养管启动一个子代培养。为确保成虫年龄不超过&#160;两周，请及时用子代培养物替换胚胎收集培养物。</li>
	<li>将产卵培养皿&#160;恢复至室温，并在琼脂表面添加一滴酵母糊。</li>
	<li>将产卵培养体系中的成虫转移至一个空的细口培养管中，并将其倒置于产卵培养皿上。将整个产卵装置在室温下孵育15分钟。此步骤应尽量避免使用麻醉处理（如低温或CO2）。</li>
	<li>将成虫移回原培养管中。将产卵培养皿在适宜的温度和时间条件下孵育后，用小号画笔将10-20个胚胎从培养皿转移至孔径为100 µm的细胞筛中。弃去产卵培养皿。</li>
	<li>对每个黑腹果蝇（Drosophila）品系重复执行步骤3.1至3.4。</li>
</ol>
4. 收集Tribolium胚胎
注意：为方便起见，提供了赤拟谷盗（Tribolium）卵收集步骤的示意图（图3A），本步骤中括号内的编号均对应于该图。
<ol>
	<li>在成像实验前2-10天，将200-300只（约400-700 mg）目标品系的赤拟谷盗（Tribolium）成虫转移至一个空的1 L玻璃瓶中，以建立卵收集培养体系（图3A_01）。向瓶中加入50-100 g新鲜培养基。若尚无子代培养物，可利用现有的幼虫和蛹建立子代培养体系。为确保成虫年龄不超过3个月，应及时用子代培养物替换卵收集培养物。</li>
	<li>将卵收集培养物通过孔径为800 µm的筛网过滤（图3A_02）。将含有未分期胚胎的培养基返回至原始玻璃瓶中（图3A_03），并将成虫转移至另一个空的1 L玻璃瓶中（图3A_04）。加入10 g产卵培养基（图3A_05），并将产卵装置在室温下孵育1小时（图3A_06,07）。</li>
	<li>将产卵装置再次通过孔径为800 µm的筛网过滤（图3A_08），将成虫返回至其原始培养瓶中（图3A_09）。根据需要成像的发育过程，将含有约30-100个胚胎的产卵培养基置于适宜的温度与时间组合条件下进行孵育（图3A_10）。</li>
	<li>将产卵培养基通过孔径为300 µm的筛网过滤（图3A_11），并将胚胎（图3A_12）转移至孔径为100 µm的细胞筛中。弃去筛过的产卵培养基（图3A_13）。</li>
	<li>对每个赤拟谷盗（Tribolium）品系重复步骤4.1至4.4。</li>
</ol>
5. 基于次氯酸钠的去卵壳处理
注意：果蝇（Drosophila）和赤拟谷盗（Tribolium）的胚胎均被一层卵壳（chorion）包裹，该卵壳是一种具有保护作用且强烈散射光线的蛋白质层；只要在去除后保持胚胎湿润，此卵壳对正常发育并非必需。这两种物种胚胎的脱卵壳处理方案完全相同。
<ol>
	<li>准备一个6孔板&#160;，在A1、A2、A3和B3孔中各加入8 mL经高压灭菌的自来水，在B1和B2孔中各加入7 mL经高压灭菌的自来水和1 mL次氯酸钠（NaOCl）溶液（图3B）。在体视显微镜下观察去壳过程，建议使用透射光观察。 
	注意：次氯酸钠具有腐蚀性。</li>
	<li>将含有胚胎的细胞筛（步骤3.4和/或4.4）插入A1孔中，在轻微振荡条件下清洗胚胎约30–60秒。</li>
	<li>将细胞筛转移至B1孔&#160;，剧烈振荡培养板30秒，然后将其转移至A2孔，在轻微振荡条件下清洗胚胎1分钟。</li>
	<li>将细胞筛转移至B2孔，剧烈振荡培养板，直至大多数胚胎完全去壳（图3C），然后将其转移至A3&#160;孔，在轻微振荡条件下清洗胚胎1分钟。</li>
	<li>在进行后续封片操作前，将细胞筛存放于B3孔中。</li>
	<li>对每条样品重复步骤5.1至5.5。</li>
</ol>
6. 使用蛛网支架固定多个胚胎
<ol>
	<li>将琼脂糖分装样品置于干式金属浴/混匀仪中，80 °C 加热至重新熔化，随后冷却至 35 °C。</li>
	<li>用移液器吸取 10 µL 琼脂糖，滴加至蛛网支架的狭缝孔上方。用移液器吸头将琼脂糖均匀铺展覆盖狭缝孔，然后尽可能吸除多余琼脂糖，仅保留一层薄薄的琼脂糖膜。静置 30–60 秒，使其凝固。</li>
	<li>对于每条样品，用小号画笔小心挑取一个或多个胚胎，并将其放置于琼脂糖膜上。</li>
	<li>将胚胎沿狭缝孔的长轴方向排列整齐，同时使其头尾轴与狭缝孔的长轴方向一致（图 3D）。</li>
	<li>用移液器小心地向胚胎与琼脂糖膜之间的缝隙中加入 1–2 µL 琼脂糖，以固定胚胎位置。静置 30–60 秒，使其凝固。</li>
	<li>将载有胚胎的蛛网支架缓慢插入已充满成像缓冲液的样品腔中。</li>
</ol>
7. 基于样品腔的光片荧光显微镜中的比较性活体成像
<ol>
	<li>使用微调移动装置将其中一个胚胎移至检测物镜前方。确保蛛网状固定架相对于照明（x）轴和检测（z）轴呈45°角（参见图1C）。</li>
	<li>在透射光通道中，将胚胎移至视野中央。蛛网状固定架不应出现在视野中。</li>
	<li>使用微调移动装置沿z轴方向移动胚胎，直至胚胎的中平面与焦平面重合，即轮廓清晰可见。无需切换至荧光通道，从中间平面向两个方向各移动250 µm，以确定成像体积范围。</li>
	<li>可选：若需从多个方向成像，请适当旋转胚胎，并重复步骤7.2和7.3。蛛网状固定架支持以90°为步进的四个不同取向。</li>
	<li>对蛛网状固定架上所有其他已固定的胚胎重复步骤7.1至7.3（或7.4）（参见图3E）。确保当最底部的胚胎位于检测物镜前方时，最顶部的胚胎仍不脱离成像缓冲液。</li>
	<li>设定荧光通道参数（激光功率、曝光时间、检测滤光片）以及时间序列参数（时间间隔、总持续时间），并启动成像过程。参考示例数据集的元数据表可获取建议参数值（补充表1）。对于持续数天的实验，建议至少部分覆盖样品室开口，以减少蒸发。</li>
</ol>
8. 成像后胚胎的回收与进一步培养
<ol>
	<li>成像实验结束后，小心地将蛛网支架从样品室中取出。</li>
	<li>用小号画笔将胚胎从琼脂糖膜上分离，并转移至适当标记的显微镜载玻片上。将载玻片放入回收培养皿中，并在相应的标准培养条件下孵育。</li>
	<li>根据实验条件，预估胚胎发育完成的时间。当接近孵化时间点时，频繁检查回收培养皿，将已孵化的 Drosophila 幼虫转移至单独的培养管中，将 Tribolium 幼虫转移至24孔板的独立孔中。向各孔中加入培养基至半满。在相应的标准培养条件下孵育。</li>
	<li>当观察的个体发育为成虫后，为其提供合适的交配伴侣，并在数天后检查子代情况。</li>
</ol>
9. 图像数据处理与元数据记录
注意：对于图像数据处理，推荐使用 ImageJ 的衍生版本 FIJI35（imagej.net/Fiji/Downloads）。FIJI 无需安装，且提供 32 位和 64 位版本。光片显微镜（LSFM）数据最常用的格式之一是标签图像文件格式（TIFF），该格式支持以 TIFF 容器的形式存储&#160;图像堆栈。
<ol>
	<li>计算所有 z 层堆栈的 z 轴最大投影图像 | 图像序列 | Z轴投影，选择 最大强度）。最大投影是一种数据简化方法，可减少空间维度的数量&#160;从三到二。提供了一个用于批量处理的 FIJI 脚本（补充文件 1).</li>
	<li>将相应的z轴最大投影进行拼接，以创建时间序列堆栈（t堆栈）。将这些数据保存在一个TIFF容器中。对所有记录的胚胎以及各自的方向均进行此操作。&#160;荧光通道（如适用）。</li>
	<li>旋转 z 和 t 图像序列&#160;围绕 z 轴旋转，以将胚胎的前-后轴与 x 或 y 图像轴对齐（图像 | 变换 | 旋转）。沿三个图像轴裁剪z轴堆栈，并在x和y图像轴上裁剪t轴堆栈，使胚胎周围仅保留最小缓冲空间（x和y轴方向20-40像素，z轴方向5-10张图像）图像 | 调整 | 画布大小 x轴和y轴 图像 | 图像序列 | 工具 | Slice Keeper （用于 z 轴）。
	<ol>
		<li>对所有记录的胚胎及其相应的方向（如适用）分别进行此操作。如有荧光通道，应采用相同的旋转和裁剪参数进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尽可能详细地记录元数据。可参考代表性结果部分示例数据集的元数据表格作为指南（补充表1).</li>
</ol>
10. 数据可视化
注意：本数据可视化指南主要聚焦于生成沿多个方向和/或随时间记录的多个胚胎的 z 轴最大投影图像矩阵。以下步骤描述了对示例数据集应用的数据可视化流程，用于生成代表性结果部分中所示的图像及关联视频。
<ol>
	<li>通过“图像 | 图像组 | 工具 | 合并”（Image | Stacks | Tools | Combine）功能合并多个方向的时间序列图像组，和/或使用“图像 | 颜色 | 合并通道”（Image | Color | Merge Channels）功能合并多个荧光通道，以可视化目标生物学结构和/或过程。</li>
	<li>根据需要使用“设置”（Set）功能调整时间序列图像组的强度（图像 | 调整 | 亮度/对比度）。最小显示值应略高于背景信号，最大显示值应产生合适的对比度。记录这两个数值，以便后续对相应的 z 序列图像组进行一致性调整。使用“应用”（Apply）功能固化调整结果。根据实验条件，建议对所有记录的胚胎采用相同的参数进行处理。</li>
	<li>将强度调整后的时间序列图像组另存为独立文件，切勿覆盖未经调整的原始图像组。利用专用图像选择功能（例如 图像 | 图像组 | 工具 | Slice Keeper）从调整后的图像组中提取合适的子序列，并使用拼接工具（图像 | 图像组 | 制作拼接图）生成可用于图表设计的图像网格。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光片荧光显微镜（LSFM）的独特应用领域之一是发育生物学。在该学科中，观察活体样本至关重要，否则无法以动态方式描述形态发生过程。本文所述的基于样品腔的 LSFM 同时进行活体成像的实验框架具有两个主要优势，因而十分便捷。
在连续活体成像过程中，环境变异是不可避免的，但可以主动加以应对。在与昆虫胚胎相关的活体成像中，我们观察到如下一些易受影响的因素：卵收集培养物在胚胎采集时可能具有不同的年龄。在Drosophila中已证明，这会影响后代的质量45。尽管可以采用适当去同步化的培养物进行实验，但使用同步化培养物进行同时成像则要方便得多。基于Drosophila和Tribolium的代表性结果均来自同步化卵收集培养物，因此我们可以有把握地排除荧光特性的差异是由亲代衰老所导致的非预期效应。
去壳是关键步骤，因为胚胎长时间暴露于次氯酸钠会降低其活力。然而，次氯酸钠的离子强度会随时间下降，带来不便。尽管可以测定其离子强度<sup class...

荧光显微镜是生命科学领域中最基本的成像技术之一，尤其在细胞生物学和发育生物学中应用广泛。自20世纪90年代中期以来，共聚焦荧光显微镜1已成为三维荧光成像的先进手段，其使用同一物镜进行荧光团激发和发射光检测。照明激光束会激发照明/检测轴线上所有的荧光团，而相应的离焦信号则在&#160;检测前通过针孔被排除。因此，每获取一幅二维图像时，整个样品都会被照射一次。相应地，每获得一幅三维图像（即一系列空间上连续的二维图像堆叠而成）时，整个样品会被照射数十次至数百次2，这容易导致光漂白和光毒性3。
近二十年前，基于光片的技术4 已成为三维荧光成像的一种有前景的替代方法，因而成为发育生物学中的重要工具5在此方法中，照明与检测相互解耦。照明物镜用于生成具有特定深度的光片&#160;仅为几微米的范围，位于垂直排列的检测物镜的焦平面内。因此，对于每幅二维图像，仅焦平面附近的一个薄层平面体积被照明。相应地，对于每幅三维图像，整个样品仅被照明一次，这显著降低了光漂白和光毒性6因此，光片荧光显微镜（LSFMs）提供&#160;在发育生物学中，需要在亚细胞水平上分析长达数毫米的样本，因此，能够在多个生物学相关尺度上高效研究复杂过程的解决方案具有特别重要的价值。
传统上，光片荧光显微镜（LSFM）基于样品腔设计7,8。在这些装置中，照明光路（x轴）和检测光路（z轴）通常与重力方向（y轴）垂直。样品腔提供了充分的实验自由度。首先，它们具有较大的成像缓冲容量，从而便于使用灌流系统来控制环境条件，例如维持特定温度9或施加生化刺激因子。此外，它们支持根据具体实验需求定制的样品固定方法10，同时保持样本的三维结构完整性，在某些情况下还能维持其动态特性11。另外，基于样品腔的系统通常配备旋转功能，可使样本绕y轴旋转，从而从两个、四个甚至更多方向进行成像。由于&#160;常用的模式生物胚胎在显微成像背景下相对较大，沿腹侧-背侧、侧向和/或前-后体轴进行连续成像可提供更全面的三维信息。这使得研究人员能够对沿复杂三维迁移路径运动的细胞进行长期追踪12,13。
光片荧光显微镜已被广泛应用于系统研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的胚胎形态发生过程14，15，以及针对发育过程中生物物理特性的具体研究。例如，该技术被用于获取高分辨率的形态发生数据，以发现内胚层内陷与原肠带伸长过程中体轴延伸之间的生物力学关联16，并进一步将复杂的细胞流动与原肠作用期间的力生成模式相关联17。该技术还与其他前沿技术相结合，例如与光遗传学联用，以研究表皮前后轴模式形成过程中Wnt信号通路的调控机制18。
然而，仅研究单一物种并不能提供关于发育演化的深入见解。为了在系统发育背景下理解胚胎发生过程，研究人员已对多种替代性昆虫模式生物开展了深入研究。其中被最全面研究的物种之一是赤拟谷盗Tribolium castaneum，这是一种具有重要经济意义的仓储谷物害虫19，其胚胎形态发生过程也已通过光片显微镜（LSFM）进行了系统的成像研究20。这两个物种的胚胎形态发生在多个方面存在显著差异，例如体节形成模式21，以及胚外膜的形成与降解过程22。后一过程已通过光片显微镜得到了广泛分析。例如，已有研究表明，浆膜作为一种胚外组织，在胚胎发育的大部分阶段包裹并保护Tribolium胚胎免受多种危害23,24，同时&#160;在背闭合过程中也充当其自身回缩过程的形态发生“驱动力”25。此外，研究还表明，在原肠胚形成期间，囊胚的特定区域会锚定在卵黄膜上，从而产生不对称的组织运动26；基于这一观察，进一步发现区域性组织的流体化使得细胞能够在浆膜窗口闭合过程中依次离开浆膜边缘27。
在上述引用的所有与Drosophila和Tribolium相关的研究中，均使用了基于样品腔的LSFM。在大多数研究中，利用样品旋转功能从多个方向对胚胎进行记录。尽管未明确说明，但可以推断这些胚胎是在连续的活体成像实验中单独记录的，彼此相互独立，类似于我们此前关于Tribolium20,28的研究。在某些情况下，这种方法是可接受的；但在定量比较研究中，环境差异可能导致结果偏差。例如，早已知晓昆虫的发育速度受温度影响29，而最近的一项研究进一步表明，在Drosophila中，温度还可能影响形态发生素的浓度30。因此，若需精确量化胚胎发生过程中的某些特征（如细胞的动态比例、分裂速率和迁移速度），则必须在无环境差异的条件下进行足够次数的重复实验。这有助于最小化标准差和标准误，从而更便于与其他实验条件（即使仅有轻微差异）进行对比分析。
然而，基于样品腔的光片显微镜（LSFM）主要设计用于高内涵而非高通量的检测。与通常配备标准化夹具以适配显微镜载玻片、培养皿和多孔板的共聚焦显微镜不同，几乎所有基于样品腔的LSFM均采用基于圆柱形的夹持机制。这类机制旨在适配可旋转、非侵入式的定制样品 holder10，但通常不适用于容纳多个样本20,31,32。一种能够在不牺牲基于样品腔系统优势的前提下，实现对两个或多个胚胎进行同步活体成像的框架，可解决环境变异问题，从而提升LSFM在比较研究中的应用价值。
在本方案中，我们提出了一种基于样品室的光片荧光显微镜（LSFM）进行比较性活体成像的实验框架（图1A），其中 y 轴可选择性地用于“堆叠”胚胎。首先，我们提供了一种基于荧光微球的校准指南，适用于基于样品室的 LSFM，这对于缺乏校准辅助功能的仪器尤为重要。其次，我们描述了一种基于蜘蛛网式固定装置28（图1B）的多胚胎装载方法，该方法兼容样品旋转，因而可沿多个方向同时对多个样本进行成像（图1C）。多个胚胎被排列在一层薄的琼脂糖膜上，在插入样品室后依次通过光片，以获取三维图像。第三，我们提供了三组果蝇（Drosophila）和赤拟谷盗（Tribolium）的活体成像示例数据集。对于前者，我们对比了细胞核荧光标记的转基因品系；对于后者，我们比较了携带相同转基因但插入基因组不同位点的亚系之间的成像性能。最后，我们讨论了并行化在比较性活体成像及环境变异控制中的重要性33，探讨了本实验框架的通量极限，并评估了该方法向其他模式生物的推广应用前景。

<table><tbody><tr><td>6孔板</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Orange Scientific</td><td>4430300</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>35 mm &amp;Oslash; 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;的活体成像。</td></tr><tr><td>90 mm &amp;Oslash; 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>L9004575</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 孔径细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m 孔径筛网</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-038</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>300 &amp;micro;m 孔径筛网</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-040</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>710 &amp;micro;m 孔径筛网</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-050</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>800 &amp;micro;m 孔径筛网</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-051</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>405细小麦粉</td><td>Demeter e.V.</td><td>SP061006</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>市售果蝇培养基</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-115</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;的活体成像 / 也可使用自制&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;培养基</td></tr><tr><td>荧光微球，1.0 &amp;micro;m &amp;Oslash;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7282</td><td></td></tr><tr><td>灭活干酵母</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-108</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Carl Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>窄瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr><tr><td>小型画笔</td><td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠（NaOCl），约12%有效氯</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>注意：次氯酸钠具有腐蚀性</td></tr><tr><td>全麦面粉</td><td>Demeter e.V.</td><td>SP061036</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Tribolium&lt;/em&gt;的活体成像 / 英国：全麦粉（wholemeal flour）</td></tr><tr><td>宽瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-110</td><td>仅用于涉及&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;的活体成像</td></tr></tbody></table>

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

基于光片的荧光显微镜技术为在多个生物学相关尺度上研究复杂过程提供了高效的解决方案。在发育生物学中，基于样品腔的成像系统是最佳选择，这类系统专门设计用于保持样品的三维完整性，通常还具备样品旋转功能。例如，此类系统已被用于记录黑腹果蝇Drosophila melanogaster和赤拟谷盗Tribolium castaneum的整个胚胎形态发生过程。然而，目前许多可用的活体成像方案仅提供针对单个胚胎的实验框架。对于比较研究而言，这类方法存在诸多不便，因为依次成像的样品会受到环境差异的影响。此外，这种方法也限制了在特定时间内可检测的样品数量。我们提供了一种可实现同步活体成像的实验框架，可在基于样品腔的成像系统中提高通量，从而确保所有样品处于&#160;相似的环境条件下。首先，我们提供了光片荧光显微镜的校准指南；其次，我们提出了一种适用于多个胚胎的固定方法，该方法兼容样品旋转；第三，我们提供了果蝇Drosophila的示例性三维活体成像数据集，其中并列展示了三个荧光标记细胞核的转基因品系，同时也提供了赤拟谷盗Tribolium的数据集，比较了携带相同转基因但插入基因组位置不同的三个转基因亚系的成像效果。本实验方案专为比较研究设计，能够主动应对始终存在于顺序活体成像中的环境差异。这一点对于定量分析以及异常表型的表征尤为重要，例如由基因敲除实验所导致的表型变化。此外，该方案显著提高了整体通量，当光片&#160;荧光显微镜的使用机会有限时，这一点尤为便利。最后，所提出的固定方法可轻松适配于其他昆虫物种及其他模式生物，例如斑马鱼，基本无需额外优化。

本方案描述了一种基于样品腔的激光扫描荧光显微镜（LSFM）中进行比较性活体荧光成像的实验框架。例如，该框架可用于并列比较：（i）两种或多种物种的胚胎，（ii）一种或多种基因被敲除的品系胚胎及其野生型对照，（iii）同一转基因品系的多个胚胎，（iv）不同转基因品系的胚胎，或（v）携带相同转基因但插入基因组位置不同的亚系胚胎。在本节中，我们将以前述最后两种情况为例进行说明。
在我们的首个示范应用中，我们展示了来自不同转基因品系的三个胚胎的荧光信号动态变化 果蝇 线条（表 2约1天的时间内（图4, 补充视频 1）。对于这些品系，我们原本预期其荧光模式较为相似，因为它们均在不同启动子的调控下表达核定位的EGFP/GFP，而这些启动子据信均为普遍表达且组成型活跃。然而，我们的比较性活体成像结果显示，其表达模式存在显著的时空差异，这些差异显然并非由环境变异引起的继发效应。
在我们的第二个应用实例...

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。

光片荧光显微镜为在多个生物学相关尺度上研究复杂过程提供了高效的解决方案。样品……

基于样品腔的光片荧光显微镜旨在实现高通量成像而非高内容分析。因此，活体成像实验必须依次进行，从而较少受到环境变异的影响。我们的蛛网式支架可实现多个胚胎的堆叠和同步成像，消除了环境变异并提高了通量。将胚胎装入蛛网状固定架需要一定的技巧。通过一段说明性视频来展示一系列简短操作动作的顺序最为理想。用于光片荧光显微镜样品腔的校准。首先，在80摄氏度的干式恒温混匀仪中重新熔化一份琼脂糖样品。待熔化的琼脂糖冷却至35摄氏度后，取50微升琼脂糖转移至1.5毫升离心管中。将0.5微升荧光微球溶液与琼脂糖在1,400转/分钟条件下混匀1分钟，然后取10微升琼脂糖-荧光微球混合溶液填充至蛛网状支架的槽孔中。尽可能吸去琼脂糖，直至仅剩一层薄薄的琼脂糖膜，静置30至60秒使其凝固。用经高压灭菌的自来水注满样品室，缓慢将蛛网状支架插入样品室中。将槽孔移至检测镜头前方，并将支架旋转至相对于照明轴和检测轴呈45度的位置。蛛网支架在透射光通道中不应可见。切换至适当的荧光通道，并调整激光功率和曝光时间，使荧光微球提供适当的信号。设定一个视场体积，完全覆盖当前呈横向取向的琼脂糖薄膜，并计算针对相应照明和检测物镜组合所能达到的最大轴向分辨率，以确定Z轴步进间距。然后，记录荧光微球的三维测试Z轴层叠图像，并将X、Y和Z方向的最大投影与校准图进行比较。如果微球图像模糊、弥散或失真，则调整照明和/或检测物镜的位置。进行胚胎去壳时，每组在六孔板的 A1、A2、A3 和 B3 孔中各加入 8 毫升经高压灭菌的自来水。然后，在 B1 和 B2 孔中各加入 7 毫升经高压灭菌的自来水和 1 毫升次氯酸钠溶液。将六孔板置于体视显微镜下，将第一个含有胚胎的细胞筛放入 A1 孔中。将筛子移至B1孔前，在轻微振荡下清洗胚胎30至60秒。剧烈振荡培养板30秒后，再将筛子转移至A2孔。在轻微振荡下清洗胚胎1分钟，然后将筛子移入B2孔进行剧烈振荡，直至大多数胚胎完全去壳。然后，将滤网转移至 A3 孔中轻柔清洗一分钟，随后将去壳胚胎的滤网保存在 B3 孔中，直至其他品系的胚胎完成如上处理。为将胚胎装载到蛛网状支架上，按前述方法重新溶化另一份琼脂糖。待琼脂糖冷却后，将蛛网状支架置于体视显微镜下，并向槽孔中加入 10 µL 琼脂糖。用移液枪吸头将琼脂糖涂抹至带槽孔上，然后尽可能吸出多余的琼脂糖，仅留下一层薄薄的琼脂糖膜。待琼脂糖凝固后，使用画笔小心挑取胚胎并将其转移至琼脂糖膜上。将胚胎沿槽孔的长轴方向排列，使其头尾轴与槽孔的长轴方向一致。为了稳定胚胎，小心地将一到两微升琼脂糖注入胚胎与琼脂糖膜之间的缝隙中。待琼脂糖凝固后，缓慢将载有胚胎的蛛网状支架插入已加入成像缓冲液的样品室中。进行胚胎成像时，需确认蛛网状支架相对于照明和检测轴呈45度角，并在透射光通道中将胚胎移至视野中央。蛛网支架不应可见。接下来，使用微调移动平台在Z轴方向上移动胚胎，直至胚胎的中平面与焦平面重合，且轮廓清晰。在不切换至荧光通道的情况下，将胚胎在两个方向上各移动250微米，以确定视野范围。如果需要沿多个方向进行成像，请适当旋转胚胎，将胚胎调至焦点，并如前所述确定视场体积。随后，对所有其他已固定的胚胎重复此操作。当所有胚胎的视场体积均确定后，设定荧光通道和时间推移参数，并启动成像过程。对于持续数天的实验，应考虑至少部分覆盖样品室开口，以减少蒸发。成像实验结束后，小心地将蛛网支架从样品室中取出，并使用小号画笔将胚胎从琼脂糖膜上轻轻分离，然后将其转移至适当标记的显微镜载玻片上。将载玻片放入回收皿中，在适当的常规培养条件下进行孵育。随着孵化时间的临近，需频繁检查回收培养皿，将已孵化的幼虫转移至24孔板的各个独立孔中。向孔中加入适量生长培养基至半满，然后在适当的标准培养条件下孵育幼虫。当观察到的个体发育至成虫阶段时，提供合适的交配对象，并在数天后检查子代情况。在本视频中，可以观察到源自三种不同转基因果蝇品系的胚胎在约一天时间内的荧光信号动态变化。由于这些品系均在假定普遍表达且持续活跃的启动子调控下表达核定位的EGFP，因此预期会呈现相似的荧光模式。然而，比较性的活体成像结果揭示了表达模式存在显著的时空差异，这些差异并非由环境变异引起的继发效应。在对三例携带相同基于piggyback转座子的转基因赤拟谷盗胚胎的分析中，比较其原肠胚形成期间绒毛膜窗口闭合过程的活体成像结果表明，第二个亚系的整体信号强度显著强于另外两个亚系。这些数据表明，基因组环境可能对赤拟谷盗中外源基因的表达水平具有显著影响。我们的方法非常适合分析基因敲低和基因敲除表型，因为它能够同时对野生型对照胚胎进行成像。本方案还可用于比较两种或多种昆虫物种的形态发生过程，从而更深入地理解发育的进化机制。

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科研

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生物学

样品室光片荧光显微镜中多个昆虫胚胎的同步实时成像

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

本文介绍了光片荧光显微镜的样品制备方法，并演示了一种用于长期成像的活体斑马鱼胚胎安装技术，该方法可在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间延时摄影记录。...

光片显微镜样品制备：活体斑马鱼胚胎的长期成像固定方法

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

本方案描述了光片显微镜的搭建及其应用方法 体内 成像 秀丽隐杆线虫...

搭建简易光片显微镜用于 整体 成像 秀丽隐杆线虫 发育

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

利用光片荧光显微镜对昆虫胚胎的形态发生过程进行成像已成为当前的标准技术。本实验方案概述并比较了三种适用于赤拟谷盗（Tribolium...

活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP)...

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。...

一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

此处，一种 方案是 提供 使用市售的光片显微镜和图像处理工作站对眼球形态发生过程进行延时成像，并分析所得数据。本方案详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终利用图像分析软件对成像数据进行分析的操作步骤。...

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

学习使用光片荧光显微镜对多个昆虫胚胎进行同步实时成像的方法。本研究利用蛛网支架堆叠果蝇胚胎，有效减少环境差异并提高成像通量，为发育生物学比较研究提供可靠技术支持。

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

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