September 9th, 2020
光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。比较研究中的一个主要问题是环境差异。我们的协议描述了多个标本同时进行实时成像的实验框架,因此,主动解决这个问题。
基于样品室的光片荧光显微镜专为高内涵而非高通量而设计。因此,实时成像分析必须按顺序进行,因此受环境变化的影响较小。我们的蜘蛛网支架允许堆叠和同时成像多个胚胎,消除环境变化并提高通量。
将胚胎安装在蜘蛛网支架中需要一定的技巧。解说视频非常适合说明许多简短行为手势的顺序。用于校准基于样品室的光片荧光显微镜。
首先,将琼脂糖等分试样在 80 摄氏度的干块加热器混合器中液化。让熔化的琼脂糖冷却至 35 摄氏度,并将 50 μL 琼脂糖转移到 1.5 mL反应管中。将 0.5 微升荧光微球溶液与琼脂糖以每分钟 1, 400 转的速度混合,持续 1 分钟,并用 10 微升琼脂糖荧光微球溶液混合物填充蜘蛛网支架的槽孔。
吸出尽可能多的琼脂糖,直到只剩下一层薄的琼脂糖膜,并让琼脂糖凝固 30 至 60 秒。用高压灭菌的自来水填充样品室,然后将蜘蛛网支架缓慢插入样品室。将检测镜头前面的槽孔移动,并将支架相对于照明和检测轴旋转到 45 度位置。
蜘蛛网支架不应在透射光通道中可见。切换到适当的荧光通道并调整激光功率和曝光时间,以便荧光微球提供适当的信号。指定完全覆盖现在横向的琼脂糖薄膜的视野体积,并计算相应照明和检测镜头组合的最大可能轴向分辨率以定义 Z 间距。
然后,记录荧光微球的三维测试 Z 堆栈,并将 X、Y 和 Z 最大投影与校准图表进行比较。如果微球看起来模糊、模糊和/或扭曲。调整照明和/或检测镜头的位置。
对于胚胎去绒毛膜,将 8 毫升高压灭菌的自来水加入每条线 1-6 孔板的 A1、A2、A3 和 B3 孔中。然后,将 7 毫升高压灭菌的自来水和 1 毫升次氯酸钠溶液加入 B1 和 B2 孔中。将第一块板放在立体显微镜下,并将第一个含有胚胎的细胞过滤器插入 A1 孔中。
在轻轻搅拌下洗涤胚胎 30 至 60 秒,然后将过滤器移至 B1 孔。用力摇晃板 30 秒,然后将过滤器转移到 A2 孔中。在轻轻搅拌下洗涤胚胎 1 分钟,然后将过滤器移入 B2 孔中剧烈摇晃,直到大多数胚胎完全脱绒。
然后,将过滤器转移到 A3 孔中轻轻洗涤一分钟,然后将去绒毛膜胚胎的过滤器存放在 B3 孔中,直到其他品系的胚胎得到处理。要将胚胎安装到蜘蛛网支架上,如图所示,将另一份琼脂糖等分试样液化。琼脂糖冷却后,将蜘蛛网支架放在立体显微镜下,并将 10 微升琼脂糖添加到槽孔中。
使用移液器吸头将琼脂糖涂抹在槽孔上,然后吸出尽可能多的琼脂糖,直到只剩下一层薄的琼脂糖膜。当琼脂糖凝固后,用画笔小心地挑选胚胎并将其转移到琼脂糖膜上。将它们沿槽孔的长轴排列,它们的前后轴与槽孔的长轴对齐。
为了稳定胚胎,小心地将 1 到 2 微升琼脂糖移液到胚胎和琼脂糖膜之间的间隙中。当琼脂糖凝固后,将带有安装胚胎的蜘蛛网支架缓慢插入充满图像缓冲液的样品室中。要对胚胎进行成像,请确认蜘蛛网支架相对于照明和检测轴处于 45 度位置,并在透射光通道中,将胚胎移动到视野的中心。
蜘蛛网架不应可见。接下来,将具有微平移阶段的胚胎沿 Z 方向移动,直到胚胎的中平面与焦平面重叠并且轮廓出现清晰。在不切换到荧光通道的情况下,将胚胎在两个方向上移动 250 微米以指定视野体积。
如果需要沿多个方向成像,请适当旋转胚胎,使胚胎聚焦并指定刚才演示的视野体积。然后,对所有其他已安装的胚胎重复此过程。当为所有胚胎指定了视野体积后,定义荧光通道和延时参数并开始成像过程。
对于持续数天的分析,请考虑至少部分覆盖样品室开口以减少蒸发。成像测定结束后,小心地从样品室中取出蜘蛛网支架,并使用小画笔将胚胎从琼脂糖膜上分离,并将胚胎放在适当标记的显微镜载玻片上。将玻片放入检索皿中,在适当的标准饲养条件下进行孵育。
随着孵化时间点的临近,经常检查检索皿,并将任何孵化的幼虫转移到 24 孔板的各个孔中。用适当的生长培养基填充 Wells 的一半,然后在适当的标准饲养条件下孵育幼虫。当观察到的个体成年后,提供合适的交配伙伴并在几天后检查后代。
在本视频中,可以观察到来自不同转基因果蝇品系的三个胚胎在大约一天内的荧光信号动力学。预期会有类似的荧光模式,因为所有品系都在可能普遍存在且组成活性的启动子的控制下表达核定位的 EGFP。然而,比较实时成像结果显示,表达模式存在强烈的时空差异,这些差异不是由于环境差异引起的次要影响。
在对携带相同基于背负式转基因的三个 Tribolium 胚胎的分析中。原肠胚形成过程中浆膜窗关闭过程的比较实时成像结果表明,第二个亚线提供的总体信号明显强于其他两个亚线。正如这些数据所示,基因组环境也可能对 Tribolium 中转基因的表达水平产生重大影响。
我们的方法非常适合分析敲低和敲除表型,因为它允许同时对野生型对照胚胎进行成像。我们的协议也可用于比较两种或多种昆虫的形态发生。因此,可以更深入地了解发展的演变。
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本研究提出了一种使用光片荧光显微镜同时对多个标本进行活体成像的协议,解决了发育生物学中环境差异的问题。通过使用蛛网架支架堆叠胚胎,该方法提高了成像的效率,同时最大限度地减少了不一致性。
Simultaneous live imaging of multiple insect embryos addresses ambient variance in comparative studies, a critical factor for reliable phenotypic analysis in target validation and mechanistic de-risking. By enabling high-throughput imaging under consistent conditions, the method supports predictive confidence in early discovery workflows where genetic perturbations are evaluated. This approach enhances assay reproducibility and scalability, directly impacting enterprise R&D efficiency in preclinical model characterization.
The method integrates into discovery biology workflows by improving assay readiness for genetic screening and phenotypic analysis, particularly when comparing multiple genetic backgrounds or species.