Name: 利用傅里叶变换和自组织映射的形态学区分健康和病理细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解利用傅里叶变换和自组织映射区分健康与病理细胞的方法。该技术通过三维显微数据分析细胞形态，为癌症诊断和免疫学研究提供客观可靠的细胞分类工具。

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作者感谢 Benjamin Krause 富有成效的讨论及其支持。作者还感谢 Robert Günther 在活细胞显微镜实验中的协助。
本工作获得了德国研究基金会（DFG）基金项目NI1167/3-1（JIMI）对R.N.和Z.C.的资助。&#160;DFG 资助项目：Z.C. 获得 CRC 1278 PolyTarget 项目 Z01 资助，R.N. 获得 TRR130 项目 C01 资助，A.E.H. 和 J.B.S. 获得 SFB633、TRR130 和 Exc257 项目资助。德国联邦风险评估研究所（BfR）为 F.L.K. 和 A.L. 提供所内支持项目 SFP1322-642。

1. 实验方案要求
<ol>
	<li>获取符合奈奎斯特准则的高分辨率去卷积三维（3D）显微图像数据，采样间隔至少为样本最高空间频率的两倍，以获得高分辨率图像。</li>
	<li>使用三维渲染软件进行表面重建并导出。</li>
	<li>使用能够运行 Python 脚本的三维动画软件（Python 脚本可从 GitHub 仓库下载：https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis）生成二维投影。</li>
	<li>使用 Fiji13 分析二维投影并提取 DFT 成分。
	<ol>
		<li>使用当前版本的 Fiji。如果已安装 Fiji，请确保其为最新版本，可通过运行 帮助 |更新 选项完成。</li>
		<li>使用 Active Contour 插件15，该插件可从 http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start 下载，并复制到插件文件夹中。</li>
		<li>从 GitHub 仓库下载 SHADE Fiji 插件，并复制到插件文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用能够计算自组织映射的计算数学软件。</li>
</ol>
2. 重建三维图像。
注意：出于测试目的，示例数据集已在 github 代码仓库中提供（见上文）。
<ol>
	<li>启动3D重建软件并打开3D图像数据。</li>
	<li>创建（所有）对象的三维表面。
	<ol>
		<li>选择 3D 视图 选项并点击 表面. 点击 下一步 单击按钮（蓝色圆圈内含白色三角形）以继续进行表面创建向导。</li>
		<li>选择用于表面重建的图像通道。</li>
		<li>应用平滑函数以避免多孔表面。
		<ol>
			<li>选择一个既能保留表面细节又可避免多孔表面的平滑值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择一种阈值分割方法以识别表面。
		<ol>
			<li>当目标物体与背景分离良好且亮度水平大致均匀时，使用绝对强度阈值。</li>
			<li>当目标物的强度存在差异，但仍能与局部背景及其周围其他目标物区分开时，应用局部对比度阈值。根据重建目标物的预期直径值设置局部阈值搜索区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据感兴趣的形态学参数过滤重建的表面， 例如， 体积，球形度，表面积与体积比 等等。，并完成表面重构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生成的表面保存并导出为与下一步所用的3D动画软件兼容的格式。</li>
</ol>
3. 将三维重建表面转换为二维投影
<ol>
	<li>启动 Blender，进入右侧窗口中的输出选项卡。从下拉菜单中选择 TIFF 格式，并将颜色深度设置为 8 位 RGBA。</li>
	<li>切换到脚本模式，打开本研究提供的代码仓库（https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis）中的脚本文件 &#34;GUI_AutoRotate.py&#34;。</li>
	<li>点击 运行脚本。当提示输入时，选择包含 wrl 文件的文件夹。</li>
	<li>如有需要，在处理更复杂的表面时可增加旋转次数：进入 GUI 界面，将 旋转次数 的数值设置为大于 6 的值。 
	注意：6 个不同角度的旋转通常已足以区分不同的细胞群体。不建议每个表面生成少于六次的旋转，以免造成信息丢失。</li>
	<li>在 GUI 中点击 旋转 按钮以运行脚本。将各个表面的投影图像保存至与输入文件夹相同的目录（步骤 2.3）。默认情况下，图像以 8 位 Tiff 格式保存（见步骤 2.1），该格式是 Fiji 插件 SHADE 所要求的格式。</li>
</ol>
4. 使用 Fiji 找到边缘并计算傅里叶分量。
<ol>
	<li>打开 Fiji，从插件菜单中选择 SHADE。首先使用默认值，之后再对参数进行微调。准备就绪后点击 OK 以运行程序。
	<ol>
		<li>为输入图像的阈值分割选择一个梯度阈值。</li>
		<li>选择迭代次数。迭代次数越高，对细胞边缘的重建越精确。对于较简单的形状，通常较低的数值即可满足需求。</li>
		<li>使用膨胀次数参数来确定起始掩膜相比实际细胞扩大了多少。通常更复杂的形状需要更多的膨胀步骤以准确找到边缘。</li>
		<li>如果投影形状比背景更亮，请勾选暗背景复选框。</li>
		<li>仅在使用小型测试数据集评估 SHADE 性能时，才激活显示中间结果复选框。对大型数据集启用此选项会降低计算效率，并可能导致显存较低的系统停止响应。</li>
		<li>勾选保存结果表格复选框，以便将 SHADE 的结果用作第 5 步的输入。若勾选此选项，所有结果将保存为独立的 csv 文件。输出数据的汇总将始终生成在一个名为 &#34;Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv&#34; 的文件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择包含第 3 步生成的 TIFF 文件的输入数据文件夹。</li>
	<li>指定输出数据文件夹。</li>
	<li>点击 OK 以启动插件。</li>
</ol>
5. 自组织映射
注意：SOM 网络仅在使用包含所有预期细胞类型和条件输入的大数据集进行训练时，才能对数据进行分类。出于演示目的，我们提供了一个此类数据集，可在我们的代码仓库中找到（https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis 中的“AllCells_summary_normalised.csv”）
<ol>
	<li>如果输入数据尚无训练好的SOM，则遵循这些指南；否则，继续执行步骤5.2。
	<ol>
		<li>启动能够执行神经网络分类的计算数学软件。</li>
		<li>选择一个用于训练SOM网络的数据文件。该数据集应包含所有实验条件，以便针对特定的细胞类型和实验条件对SOM进行训练。 
		注意：也可以使用提供的 AllCells_summary_normalised.csv 文件来测试该系统。</li>
		<li>开始训练，并等待训练完成后再继续下一步。默认情况下，脚本设置为运行 2000 次迭代（&#34;时期&#34;). 
		注意：迭代次数取决于自组织映射（SOM）的学习率。根据输入数据的不同，建议测试更高和更低的训练轮数（epochs），并观察SOM模式的稳定性。使用所提供的脚本时，可在第32行修改迭代次数。网络大小可在第34行进行更改（默认设置为12乘以12）。</li>
		<li>训练结束后，检查网络的拓扑结构（邻近距离、输入平面、样本命中情况） 等等。）。网络现已训练完成，可保存以供将来使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载SOM，当使用已训练好的映射（可来自步骤5.1或其他来源）对数据集进行聚类时。
	<ol>
		<li>导入要使用预加载的训练后SOM进行测试的csv文件。若使用由SHADE插件准备的数据，请选择第4步中SHADE插件生成的csv输出文件。 
		注意：也可以使用提供的示例数据文件“InteractingCells_summary_normalised.csv”、“MobileCells_summary_normalised.csv”或“PhagocytosingCells_summary_normalised.csv” 通过 github</li>
		<li>分类完成后，按照步骤 5.1.5 评估 SOM 的结果。
		<ol>
			<li>检查从 csv 文件生成的热图。该图中的每个单元格显示数据集被命中次数 &#34;命中数&#34; 该训练好的SOM的特定细胞。当一组细胞聚集在该图的较小区域内时，表明数据集具有较高的同质性。多个簇的存在则表明数据集中可能存在若干亚群。</li>
			<li>检查邻域权重距离。该图中分离较明显的区域，对应于自组织映射（SOM）视角下行为差异显著的对象组。当以DFT成分为输入数据时，这意味着这些细胞组对应的三维表面具有截然不同的形状。</li>
			<li>检查权重平面，以了解特征向量中每个元素的贡献情况。若如前所述使用20个DFT分量，则此处将显示19个权重图。当使用提供的示例数据集时，前5或6个权重平面会有所不同，但其余的则显得较为相似。在此情况下可以得出结论：使用约7个DFT分量已足够。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Niesner, R. A., Hauser, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+dynamic+intravital+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy.</a> Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).</li>
<li>Ho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeurphologyJ%3A+an+automatic+neuronal+morphology+quantification+method+and+its+application+in+pharmacological+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery.</a> BMC Bioinformatics. 12, 230(2011).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+morphological+complexity+identifies+regulators+of+switch-like+transitions+between+discrete+cell+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 860(2013).</li>
<li>Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphometric+Analysis+in+Cellular+Behaviors%3A+Shape+and+Size+Matter%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter.</a> Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).</li>
<li>Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+modeling+of+cell+and+nuclear+shape+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Joint modeling of cell and nuclear shape variation.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -D. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/1099-4300/20/4/254">Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm.</a> Entropy. 20 (4), 254(2018).</li>
<li>Kriegel, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+characterization+and+classification+with+discrete+Fourier+transforms+and+self-organizing+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps.</a> Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).</li>
<li>Styner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Framework+for+the+Statistical+Shape+Analysis+of+Brain+Structures+using+SPHARM-PDM%5BTitle%5D)+AND+%22Insight+Journal%22%5BJournal%5D)">Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM.</a> Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).</li>
<li>El-Baz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+shape+analysis+for+early+diagnosis+of+malignant+lung+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention%22%5BJournal%5D)">3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules.</a> Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).</li>
<li>Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+harmonic+analysis+of+cortical+complexity+in+autism+and+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia.</a> Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).</li>
<li>Kruggel, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1361841507001107">Robust parametrization of brain surface meshes.</a> Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kohonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+the+self-organizing+map%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">Essentials of the self-organizing map.</a> Neural Networks. 37, 52-65 (2013).</li>
<li>Andrey, P., Boudier, T. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/4b2d/57e828777e7f5578b1192fd804890f9a464f.pdf">Adaptive Active Contours.</a> ImageJ user and developer conference. , Luxembourg. (2006).</li>
<li>Burger, W., Burge, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurger%2C+W+%22Principles+of+Digital+Image+Processing%22">Principles of Digital Image Processing</a>. , Springer-Verlag. (2013).</li>
<li>Lestrel, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLestrel%2C+PE+%22Fourier+Descriptors+and+their+Applications+in+Biology%22">Fourier Descriptors and their Applications in Biology</a>. , Cambridge University Press. (2008).</li>
<li>Bayerl, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+in+vivo+microscopy+reveals+distinct+dynamics+of+microglia-tumor+environment+interactions-a+new+role+for+the+tumor+perivascular+space+as+highway+for+trafficking+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia.</a> Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

利用微小且完整的组织样本识别潜在病理状况具有重要意义。此类技术将确保对传染病和侵袭性癌症类型作出及时反应。各类免疫细胞的动力学和形态学反应， 例如， 小胶质细胞和巨噬细胞是机体免疫反应的特征性细胞。尽管在大多数情况下，监测这些细胞的动力学行为并不现实甚至不可能，但获取其三维图像以重建其形态则相对直接。通常情况下，免疫细胞在健康组织中呈现复杂的形态，而在炎症或癌变条件下则表现为更简单的形态。18尽管此类形状变化的时间依赖性特征有助于加深我们对免疫应答发育过程的理解，但仅利用一组代表性细胞的三维形态也足以判断组织的健康或病理状态。
表征细胞的三维表面并非易事。应用球谐函数是一种用相对较多数目（50–70个）的分量来表示三维表面的方法11,12。此外，计算球谐函数的代价较高；由于需要在单位球面上应用多个不同精细程度的网格，将非常复杂的形状投影到单位球面上要么不可能，要么极为困难；最后，对球谐函数分量谱的有意义解释也远非 trivial。
在本研究中，我们用原始表面的二维投影这一更为简便的方法，取代了直接进行三维表面分析这一复杂任务，从而获得足够的形态学信息以识别病理状态。我们利用髓系细胞的三维显微成像数据，展示了该工作流程的每一步骤，同时明确指出所有步骤均易于完成，所获得的二维图谱易于解读。
显然，三维到二维的投影会导致表面结构信息的丢失。在我们关于小鼠皮层肿瘤模型中小胶质细胞的示例数据集中，创建二维投影时使用六个角度已足够。然而，对于更复杂的形状或形态学变化不够显著的情况，可能需要生成更多的投影，以便能够利用自组织映射（SOM）可靠地识别细胞亚群。因此，我们的方法设计为能够生成并分析任意数量的投影。只需针对更复杂的形状选择更多的投影数量，即可将信息丢失程度降至可接受的最低水平。例如，图4a 和 4b 中所示的相互作用细胞类型就需要更多的投影数量，才能准确表征其复杂的表面结构。
作为一种近似方法，本文所提出的流程必须通过小胶质细胞手动分类结果进行验证18。前文展示的结果证实了该自动化流程的可靠性。此外，与传统分析方法相比，该流程具有更高的时间效率。进行小胶质细胞手动分类的医学专家对其数据集的分析耗时约4周，而我们的流程仅需约1天。该方法的稳健性也通过训练所得SOM对属于同一种细胞类型但未用于训练SOM的数据子集的可重复性得到了明确验证，如图3c所示。
尽管我们的方法未考虑动力学信息，但仍考察了时间因素对基于DFT的形态分析的影响。在移动细胞群体中发现了最典型的随时间变化的行为，其中高阶DFT组分的贡献明显可见，如图4a所示。这提示在处理具有显著时间依赖性行为的细胞类型时，应使用足够多的DFT组分。由于我们软件工具具有自动化程度高和执行速度快的特点，增加DFT组分和投影的数量将提高结果的精确性和可靠性，而不会明显影响计算性能。

及时、简便且精确地确定生物组织的病理状态，在生物医学研究中具有重要意义。小鼠模型为研究多种病理状况（如免疫反应或癌症发生）提供了手段，并可结合复杂的三维（3D）和四维（4D，即三个空间维度和时间）显微成像技术进行分析。显微成像研究可被实施 通过 活体或离体组织双光子显微镜成像、光片显微镜成像，以及在组织深度约100 µm的有限范围内进行的共聚焦显微镜成像。为了获取细胞在生理或病理条件下行为的时间相关性信息，需要对组织进行长时间的监测，这通常要求采用活体成像技术。1,2. 由于该技术具有侵入性，其适用范围自然仅限于动物模型。对于人类应用，也可采用多种非侵入性技术，包括各种断层成像方法（MSOT、CT、 等等。），但这些方法在空间分辨率上（且常常在时间分辨率上）均不足以用于细胞水平的行为研究。
通过对手术切除的组织样本执行各种三维成像技术，可更便捷地获取有关细胞形态的静态信息。via 此类方法并不测量细胞的动力学行为，因此有必要采用新颖的分析技术，仅基于细胞形态即可确定被检细胞的致病状态3。已有研究采用此类方法，将细胞形状和组织纹理与病理行为相关联4,5,6。
在此处描述的新技术中，细胞被重建为三维表面，并对其形态进行表征 通过 三维到二维投影与基于傅里叶的边缘形状连续分析7,8通过将维度从三维降至二维，问题得以简化。此外，也可通过应用球谐分析对细胞表面进行三维表征，该方法此前已用于医学图像分析。9然而，球谐函数难以有效处理尖锐和崎岖的形状，需要在单位球面上建立多尺度网格。此外，所需的球谐函数成分数量可能较多（50–70个），其底层计算非常耗时，且结果难以解释。10,11,12.
通过我们新提出的方法，该任务被简化为一系列二维形状描述，二维投影的数量由分析人员决定，并可根据三维形状的复杂程度进行调整。这些投影可自动生 通过 一个在3D动画工具内部运行的Python脚本。其二维投影由外围的离散傅里叶变换（DFT）分量描述，该分量通过Fiji计算得出13 作为我们软件包一部分提供的插件。此处应用离散傅里叶变换（DFT）将细胞复杂轮廓分解为一系列正弦和余弦函数。通过这种方式，可以用相对较少的DFT分量来描述轮廓，从而降低问题的复杂性（详见公式部分）。这些DFT分量被输入至一个经过训练的自组织映射（Self-Organizing Map, SOM）14），其中形状聚类的存在可进行客观检验8自组织映射（SOMs）是人工智能领域中一种具有竞争性和无监督学习能力的工具。它由一组相互连接的人工神经元构成，这些神经元之间能够相互通信。 通过 加权邻域距离函数。神经元系统对输入数据集的第一个元素产生响应，其中响应最强的神经元 &#34;分组&#34; 彼此更加接近。随着神经系统接收到越来越多的输入，那些反复强烈响应的数据神经元开始在系统内形成明确定义的聚类。在包含二维形状信息（以一组DFT分量形式表示）的大规模数据集上完成适当训练后，任何单个细胞的DFT分量均可输入训练好的SOM，以判断该细胞更可能属于健康细胞组还是致病细胞组。我们预期此类工具将成为科学研究与临床诊断方法的重要补充。

<table><tbody><tr><td>Imaris 9.1.2，软件</td><td>Bitplane，Z&amp;uuml;rich，瑞士</td><td>v.9.1.2</td><td>三维图像重建与表面生成；我们使用了该软件！</td></tr><tr><td>Blender 2.75a，软件</td><td>https://www.blender.org/</td><td>v.2.75a</td><td>开源的三维与四维动画软件；2.75a 是此 Python 脚本所需的版本</td></tr><tr><td>Fiji /ImageJ，软件</td><td>https://fiji.sc/</td><td>ImageJ v.1.52b</td><td>开源的多维图像分析工具包</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks，www.mathworks.com</td><td>R2017b</td><td>通用数学计算软件</td></tr><tr><td>MATLAB 机器学习工具包</td><td>MathWorks，www.mathworks.com</td><td>R2017b</td><td>必须与 MATLAB 配合使用</td></tr><tr><td>Fiji 插件：SHADE</td><td>https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis</td><td>v.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 插件：ActiveContour</td><td>http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?&lt;br /&gt;id=plugin:segmentation:active_contour:start</td><td>absnake2</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>任意</td><td>NA</td><td>有关最低计算机配置要求，请参见 Imaris 的使用说明</td></tr></tbody></table>

基于形态学的健康与病变细胞区分方法：利用傅里叶变换与自组织映射

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

免疫细胞的形态和运动受其微环境驱动。当病原体入侵时，免疫细胞会被募集到炎症部位并被激活，以防止感染进一步扩散。这一过程也体现在免疫细胞行为及其形态学特征的变化上。在癌组织中，小胶质细胞的行为也观察到了类似的形态动力学改变：肿瘤内的小胶质细胞具有较简单的三维形态，细胞突起分支较少，并且比健康组织中的细胞移动更快。对这类形态动力学特性的研究需要复杂的三维显微技术，而纵向连续观察时尤其具有挑战性。因此，仅记录细胞静态的三维形态则要简单得多，因为这种方法无需进行活体测量，也可在离体组织上完成。然而，关键在于必须具备能够快速而精确地描述三维形态的分析工具，并能仅基于静态的形态相关信息，对健康与病变组织样本进行诊断分类。本文介绍了一种工具包，该工具包通过自组织映射（Self-Organizing Maps）分析三维细胞表面一系列二维投影轮廓的离散傅里叶分量。via 人工智能方法的应用使本框架在处理越来越多组织样本的过程中不断学习各种细胞形态，同时保持工作流程的简洁性。

我们应用离散傅里叶变换（DFT）来计算对应于细胞突起形态的主要成分。傅里叶描述符是通过对细胞突起拟合边缘的 xy 坐标对应用 DFT 算法获得的，这些坐标对来自我们工作流程中 AbSnake 模块的输出结果。这些 xy 坐标对可被视为一个复数值二维向量“g”： 
<img alt="公式序列，数学符号 g=(g₀,g₁,...,gₘ₋₁)，序列分析。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">
从向量“g”出发，我们使用离散傅里叶变换（DFT）计算其复数值傅里叶谱： 
<img alt="图论公式，G=(G₀,G₁,...,GM-1)，序列表示，数学方程。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"> 
基于离散傅里叶谱的已知公式，并利用“g”的复数标记形式： 
<img alt="复数表示；公式 gₖ=xₖ+i·yₖ；数学方程。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"> 
可得： 
<img alt="傅里叶变换公式，复分析，数学方程，教育概念。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4">（1） 
我们可以计算<img alt="光学系统复增益方程：Gm=(Am+i·Bm)。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5">的实部（“A”）和虚部（“B”）： 
<img alt="傅里叶分析公式，Σ用于信号分解，数学图示。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6"> （2） 
<img alt="静态平衡方程公式，Bm等于Im(Gm)，傅里叶级数表示，数学分析图。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 7"> （3） 
其中，DFT 的第一个分量 G0 对应于 m = 0，此时有： 
<img alt="静态平衡方程，公式 A₀=(1/M)Σ[xk·cos(θ)+yk·sin(θ)]，数学概念。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 8"> （4） 
<img alt="静态平衡方程，Σ[y·cos(0)-z·sin(0)]=ȳ，数学公式分析。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 9"> （5） 
因此，该分量描述了原始物体的几何中心。 
DFT 正向谱的第二个元素 G1 对应于 m = 1： 
<img alt="傅里叶变换方程，图示，Gk=G₁·e^(i2πk/M)，信号处理概念。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 10"> 
<img alt="含三角函数分量的傅里叶级数方程；公式可视化。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 11"> （6）
由公式6可知，这些点构成一个半径为 <img alt="r₁=|G₁| 方程，数学公式，幅值计算，分析，代数概念" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 12">、起始角度为 <img alt="用于数学分析中角度计算的三角公式 θ=tan⁻¹(B₁/A₁)。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 13"> 的圆，其中该圆完成一次完整旋转的同时，图形被绘制一次。该圆的圆心位于原点（0, 0），半径为 |G1|，起始点为：
<img alt="静态平衡方程，傅里叶变换符号，谱分析的数学图示。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq14.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 14"> <img alt="静态平衡；ΣFx=0 图示；力平衡；机械系统分析；教学工具" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq15.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 15"> (7)
通常，对于单个傅里叶系数 <img alt="理论研究中函数 Gm 的数学公式，表示为一对 Am, Bm。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq16.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 16">，其坐标描述如下：
<img alt="数学方程，傅里叶变换表示，复指数函数，示意图。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq17.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 17"> 
<img alt="傅里叶变换方程；余弦和正弦中的复指数项；数学分析。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq18.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 18"> (8)
与公式6类似，公式8也描述了一个圆，但其半径为Rm=|Gm起始角度 <img alt="数学表达式中的反正切方程，tan⁻¹(Bₘ/Aₘ)。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq19.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 19"> 起点 <img alt="公式：g₀^(m) = Gₘ；符号表示；数学符号；研究用途。" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq20.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 20">，其中轮廓被描绘一次，而圆则完成“m”次完整轨道运动16,17.
将形态参数作为SOM输入 
如图1所示的工作流程被应用于去卷积（使用实测点扩散函数）的活体多光子显微成像数据集，以表征小胶质细胞在健康或癌变皮层组织中的形态学变化18。对重建的三维表面的每个二维投影计算了20个DFT分量，结果用作SOM训练的输入。在生理条件下，小胶质细胞呈现较为复杂的形态，具有多个高度分支的突起（图2a）。当处于癌性环境（皮层肿瘤模型）中时，小胶质细胞转变为更简单、更呈纺锤状的形态（图2b）。
为评估自组织映射（SOM）区分健康细胞与癌细胞的能力，对其进行了测试。健康细胞群体被投射到SOM的单一区域（图2c）。SOM对癌变小胶质细胞数据集的响应表现为哑铃形状的活跃区域（图2d）。由健康组和癌变组的DFT形状分量混合组成的盲混输入数据集被SOM投射为两个明显不同的群体，同时各自轮廓的形状仍与分离群体的轮廓相似（图2e；与2c和2d比较）。由此可见，SOM成功地对混合数据集实现了聚类。
我们通过将SOM的投影结果与医学专家对相同数据的手动分析进行比较，以评估SOM的性能，该专家根据细胞的时空行为对数据集进行了分类。专家识别出四类不同的细胞群（静息细胞、吞噬细胞、相互作用细胞和运动细胞18），并据此重建数据用于训练一个12×12的SOM。训练后的网络（图3a）显示出多个高命中值的人工神经元群，尤其集中在SOM的左下区域和中部区域。此外，我们还使用专家识别出的四类细胞中随机选取的四个子集图像（不属于训练数据集）测试了训练后网络的响应18。这些图像子集在SOM中产生了四个清晰可辨的响应，如图3b所示。静息细胞表现出最复杂的形态，并在神经网络中展现出最高的分离度（图3b“静息”面板）。其余三种细胞类型在SOM的左下角共享一个共同区域，但在其他区域被SOM有效区分。因此，SOM左下角区域对应于较低指数的DFT值。
通过使用训练好的SOM对同一种静息细胞类型的三个随机子集（不属于训练数据集）进行测试，验证了SOM方法的稳健性。SOM对这些输入的响应表现出高度相似的结果（图3c，子集1-3），证明了我们方法的稳健性。
时间依赖性细胞形态变化通过DFT被精确表征 
为了检验细胞形态随时间变化对DFT组分的影响，每个亚组选取一至三个细胞（参见 图3b) 被追踪了13至28个时间点。 图4 显示一个移动细胞的前十个DFT分量（图 4a）以及一个相互作用的细胞（图4b），以时间函数形式绘制。该运动细胞表现出持续变化的形态（参见补充视频4） 8），这反映为DFT表面更为粗糙。相互作用细胞在时间进程的前三分之一阶段出现的DFT振幅爆发，与快速而显著的细胞形态变化相一致，如补充视频5所示。 8.
在追踪移动细胞（图5a）和相互作用细胞（图5b）的过程中，这两个细胞在三个独立时间点的所有19个DFT组分的时间过程也得到了表征。垂直轴代表六个旋转角度，表明所有投影对于表征这两类细胞的形态均具有同等重要性。
<img alt="显微成像数据处理示意图：三维重建、二维投影、DFT、SOM分析、聚类。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 基于细胞形态识别细胞聚类的数据处理逐步流程图。 三维重建的表面结构被用作Blender软件中自动化三维到二维投影的输入。定位每个投影的边缘轮廓，并计算其DFT分量。这些分量可作为输入数据用于Matlab中已训练好的SOM模型，或用于训练新的SOM模型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在微米尺度下用于形态分析的3D显微图像中呈现的绿色分子结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠皮层小胶质细胞在对照条件下（a）及癌组织中（b）的典型形态 重建的小胶质细胞表面截图。自小鼠皮层三组小胶质细胞样本生成SOM投影：对照组（无肿瘤）细胞（c）、肿瘤细胞（d）以及混合细胞群体（e）。本图经许可修改自文献8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="具有权重热图的细胞活性状态；聚类与子集分析；研究示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. （a，左）由768个输入特征向量组成的小鼠小胶质细胞数据集的自组织图（SOM）。该数据集用于训练一个12×12的人工神经网络，采用六边形邻域几何结构、随机初始化和2000个训练周期。（a，右）对应于（a，左）中SOM的前10个DFT分量的输入平面。（b）该SOM对四种细胞类型——“移动型”、“相互作用型”、“静息型”和“吞噬型”——各自一个随机VRML文件子集的响应，这些细胞类型最初在Bayerl et al.18的图5中描述。（c）同一SOM（如a左图所示）对整个数据集中“静息细胞”类型3D表面的三个随机子集（因此不属于训练数据集）的响应。这三个响应之间的相似性显著。本图经许可修改自文献8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示振幅与时间点的傅里叶分析图；频谱数据及DFT分量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. (a) 小鼠小胶质细胞活体成像实验期间前10个DFT分量的时间依赖性。本图展示的是“移动细胞”类型的一个细胞的数据。x轴对应实验的时间点，时间分辨率为60秒；y轴表示DFT分量的振幅（任意单位，a.u.）；z轴对应第1至第10个DFT分量。(b) 同(a)，但展示的是“相互作用细胞”类型的一个细胞。本图经许可修改自文献8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="离散傅里叶分析，振幅与分量ID，3D图，光谱数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. (a) “移动细胞”类型的一个细胞在实验开始、中期和结束时所有19个离散傅里叶变换（DFT）分量的行为。x轴上的数字对应于从1到19的DFT分量ID。y轴显示DFT分量振幅（任意单位，a.u.），z轴标记六个随机旋转角度。(b) 同(a)，但针对“相互作用细胞”类型的一个细胞。本图经许可修改自文献8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文提供了一种基于细胞三维形态来鉴别健康与病变细胞的工作流程。我们描述了如何利用基于三维表面生成的二维投影轮廓，训练自组织映射网络，从而实现对所研究细胞群体的客观聚类。

免疫细胞的出现和运动由其微环境驱动。在病原体入侵的反应中，免疫细胞被招募至……

该方法有助于回答基础研究和临床应用中的关键问题，例如癌症研究与癌症治疗，同时也适用于免疫学领域。该方法的主要优势在于其为一种静态方法，易于实施。该技术能够根据细胞的形态和运动特征自动识别病变细胞类型。该技术的应用前景涵盖癌症或炎症性疾病的诊断与治疗。此方法可揭示免疫细胞与癌细胞之间的相互作用，同时也可应用于任何需要三维显微成像数据的领域。对于刚接触该方法的研究人员而言，由于在描述和验证三维显微成像数据方面可能存在困难，可能会面临一定的挑战。我们认为，对本方法进行可视化演示至关重要，因为此处所使用的软件工具对许多科研人员而言并不熟悉。首先，按照随附的文字方案获取高分辨率、去卷积的三维显微成像数据集。将三维图像数据载入重建软件中，并开始为每个对象创建三维表面。为此，请选择 3D 视图选项，点击表面，然后点击下一步按钮以继续表面创建向导。接下来，选择用于表面重建的图像通道。选择一个平滑值，该值应既能保留表面的细节，又能避免产生多孔表面。通过点击“平滑选项”复选框并提供平滑半径来应用平滑函数。在创建显微镜数据的三维图像结构时，尤其需要注意平滑因子和合适的阈值方法，以避免丢失任何细胞特征或形态。接下来，选择阈值方法以确定表面。当目标物体（如此处所示）与背景分离良好且亮度水平大致均匀时，使用绝对强度阈值。当目标物体的强度存在差异，但仍能与局部背景及其周围其他物体分离时，应应用局部对比度阈值。根据预期重建物体直径的数值设置局部阈值搜索区域。接下来，从选项列表中进行选择，根据感兴趣的形态学参数对重建的表面进行筛选。这些参数包括体积、球形度、表面积与体积比等。将生成的表面以兼容后续步骤所用三维动画软件的格式（例如 VRML）保存并导出。启动 Blender，然后转到窗口右侧的输出选项卡。从下拉菜单中选择 TIFF 格式，并将颜色深度设置为 8 位 RGBA。接下来，切换到脚本模式，并导航至提供的脚本文件，标题为：GUI_Autorotate。py，可从本研究的 GitHub 代码仓库下载。返回主窗口后，单击运行脚本，当提示输入时选择 wrl 文件所在的文件夹。然后，进入默认菜单。此处，将旋转次数设置为六次或以上。通过单击“旋转”按钮运行脚本。通常，六次不同角度的旋转已足以区分不同的细胞群体；但为了不丢失任何关于细胞形态或特征的信息，我们不建议使用少于六次的旋转。将各个表面的投影保存到与输入文件相同的文件夹中。默认情况下，图像以8位TIFF格式保存，这是FIJI插件Shade所要求的格式。打开Fiji，然后在插件菜单中选择Shade。从默认值开始，之后再对参数进行微调。准备运行程序时，点击“确定”。接下来，选择包含上一节中生成的 TIFF 文件的源文件夹，然后点击“选择”。然后，提供一个输出数据文件夹。当第一张图像出现时，绘制一个矩形框选细胞，并点击“确定”开始。插件运行过程中，您将在图像周围看到细胞的预处理过程，细胞边缘以红线标出。现在使用所找到边缘的坐标来计算离散傅里叶分量。首次训练自组织映射时，首先启动 MATLAB，加载 TrainSOM MATLAB 脚本，然后选择运行以开始训练。如有需要，请确保正确设置文件路径。程序开始运行后，会弹出一个额外窗口以显示进度。请等待训练完成后再继续下一步操作。默认情况下，脚本设置为运行 2,000 次迭代，即 epics。训练完成后，检查网络的拓扑图。以下是邻域距离图、样本命中图和输入平面图的示例。自组织映射是发现数据集中隐藏关系的重要工具。它能够客观地对数据进行聚类，并且具有无需训练数据集的优势，因为其采用无监督学习方式。网络现已训练完成。在工作区中右键单击文件，将其保存以供将来使用。当使用已训练好的自组织映射时，加载自组织映射以对数据集进行聚类。然后，导入将使用预加载训练映射进行测试的 CSV 文件。此处，我们将选择 Shade 插件的 CSV 输出。数据加载后，将输出类型更改为数值矩阵，然后选择导入选中内容。分类完成后，使用命令窗口评估各种图表。此处显示的图像来自小胶质细胞的去卷积活体多光子显微镜数据集。在生理条件下，小胶质细胞呈现出较为复杂的形态，具有多个高度分支的突起。当处于癌症环境中时，例如本皮层肿瘤模型，小胶质细胞则转变为更简单、更呈纺锤形的形态。将这20个纺锤形的描述性组分作为输入，用于训练自组织映射。训练完成后，对该映射进行测试，以评估其区分健康细胞与癌细胞的能力。健康细胞群体被投射到此处所示的单一区域，而癌变的小胶质细胞数据集则呈现为哑铃形的活跃区域。医学专家还可以训练地图以识别不同的细胞群。在此，静息细胞、吞噬细胞、相互作用细胞和移动细胞被识别、重建，并用于训练一个12×12的地图。该整合地图显示了具有高命中值的人工神经元群，尤其集中在地图的左下部和中部区域。通过使用训练好的自组织映射方法，并以不属于训练数据集的同一种静息细胞类型的3个随机子集进行测试，验证了该映射方法的稳健性。自组织映射（S.O.M）对这些输入的响应表现出非常相似的结果，表明能够正确识别细胞类型。在该技术开发完成后，我们现在拥有了一个工具包，可以据此简单地对细胞形态变化进行分类。这些变化在癌症或其他免疫系统反应过程中会发生，我们可以通过显微镜进行测量，所用样本包括完整动物、切除的组织，甚至器官芯片。

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