使用开源的 MALDI TOF-MS IDBac 分析流程解析微生物蛋白质与特化代谢物数据

IDBac 将未知细菌分离物的蛋白质和特化代谢物区域的质谱数据相结合，能够基于分离物的身份及其潜在环境功能快速区分不同分离物。我们的开源软件扩展了现有基于 MALDI TOF 的微生物鉴定策略的应用范围，该扩展包括将特化代谢分析作为区分表型相似菌落的另一种手段。

表征未知微生物的一个主要挑战是区分亲缘关系密切的分离株。IDBac 为研究人员提供了一种简便快速的方法，通过蛋白质和小分子谱型分析来表征分离株。IDBac 可对细菌样本中特化代谢产物的生成进行可视化比较，有助于从生态学研究到药物先导化合物发现等多个领域的广泛研究。

在不同仪器之间保存 MALDI 数据的方法有多种。如果您在使文件与 IDBac 兼容时遇到问题，请向 IDBac 的 GitHub 提交问题报告。使用无菌牙签，将少量细菌菌落转移至洁净 MALDI 板上的相应位置。

将细菌菌落均匀涂布于检测点上，使菌落分布尽可能平整。在样品和基质对照点上各覆盖1 µL 70%质谱纯级甲酸，置于化学通风橱中自然晾干。随后，向样品及基质培养基对照点各加入1 µL预先配制好的MALDI基质溶液，静置至完全自然干燥。

设置好基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI TOF）后，采集质谱图。将蛋白质质谱数据保存在一个文件夹中，将特化代谢物质谱数据保存在另一个独立的文件夹中。开始此操作前，请下载 IDBac 软件。

双击下载的 install_idbac 以启动安装程序。随后双击桌面上的 IDBac 快捷方式来运行 IDBac，程序将默认打开介绍页面。单击“从原始数据开始”选项卡，在“创建 IDBac 实验”菜单中选择将与 IDBac 一起使用的数据类型。

在设置数据文件的转换和处理时，系统提示输入实验名称时，请填写一个具有描述性的名称，然后点击“原始数据文件夹”并选择相应的文件夹。接着点击“处理数据”。文件转换并使用 IDBac 处理完成后，进入“使用先前实验”页面，选择一个实验进行后续操作。

使用“点击此处修改所选实验”菜单添加有关样本的信息。在自动生成的电子表格中输入信息，然后点击保存。准备开始分析时，请确保已选中要使用的实验。

然后选择蛋白质数据分析。在蛋白质数据分析页面中，选择峰检测设置，并通过显示的镜像图评估样品的蛋白质谱。调整峰在重复样本中出现的百分比阈值，以确定纳入分析的峰。

以镜像图作为视觉参考，调整信噪比截断值，以保留最多的真實峰信号并去除最多的噪声。需注意，重复实验次数越多，峰存在百分比值越高，越能允许选择更低的信噪比截断值。随后，设定质荷比的下限和上限截断值，以确定在后续由IDBac进行分析时每个质谱图中所采用的质量范围。在蛋白质数据分析页面中，选择“树状图”（Dendrogram）标签，以便根据用户选定的距离度量和聚类算法将样本分组生成树状图。

单击菜单中的“选择样本”选项，并按照说明选择要包含在分析中的样本。仅包含蛋白质谱的样本才会显示在可用样本框中。使用默认的距离和聚类算法，并选择强度作为输入。

要在进化树上显示自举值，请在“bootstraps”下输入一个介于 2 到 1,000 之间的数值。要开始自定义进化树，请打开“调整进化树”菜单。要为进化树的分支线条着色，请选择“单击以修改线条”并选择所需的选项。

要在树状图旁边绘制电子表格中的信息，请选择“合并样本信息”按钮。这将打开一个面板，其中的类别会根据输入的值自动填充。如需插入来自其他实验的样本，请选择“从其他实验插入样本”菜单按钮，并按照新打开面板中的说明操作。

进入小分子数据分析页面，通过主成分分析和代谢物关联网络来实现数据可视化，其中代谢物关联网络采用二分网络来展示小分子质荷比值与样本之间的相关性。在树状图上单击并拖动，以高亮选择感兴趣的特定样本进行分析。若未高亮任何样本，或未生成蛋白质树状图，则将分别显示随机子集样本或全部样本的代谢物关联网络。

为了在代谢物关联网络中减去基质空白样本，请打开菜单，选择要减去的样本，并选择适当的样本作为空白。打开“显示/隐藏MAN设置”菜单，以选择峰出现百分比、重复性、信噪比以及质荷比上下限截断值的期望参数。可利用小分子镜像图来指导这些参数的选择。

在报告结果时，复制“关于报告MAN分析段落的建议”中的文本，以提供用于生成代谢关联网络的用户自定义设置。使用IDBac软件分析了六株Micromonospora chokoriensis和两株Bacillus subtilis的数据。根据“从原始数据开始”选项卡中的说明，选择“单击此处转换Bruker文件”选项，并按照IDBac为每组数据提供的说明进行操作。

在自动化转换和预处理峰检测步骤中，通过将两次实验中的芽孢杆菌属（Bacillus）和小单孢菌属（Micromonospora）样本合并至单次实验，创建了一个整合的IDBac实验。该分析通过镜像图比较蛋白质谱，有助于评估谱图质量并优化峰检测参数设置。此处展示了采用默认参数设置时蛋白质聚类结果的截图。

通过调整图中的阈值对树状图进行着色。值得注意的是，不同属之间呈现出明显的分离，其中 M.chokoriensis 和 B.subtilis 的分离株各自聚集成独立的分支。通过在蛋白质树状图上点击并拖动，可快速构建代谢关联网络，用于单独比较 B.subtilis 菌株、单独比较 M.chokoriensis 菌株，或同时比较所有菌株。

这些网络的主要功能是为研究人员提供细菌之间特化代谢物重叠程度的全面概览。在处理新数据时，使用 IDBac 的镜像图来确保数据合理且质谱图质量较高。在每一步骤中都应批判性地评估实验设计和结果。

IDBac 可帮助研究人员构建小型且多样化的微生物库，以供进一步研究。这大大降低了与传统大型且冗余的微生物库相关的成本。由于 IDBac 能够可视化高度相似的系统发育群内特化代谢产物的重叠情况，因此可用于提出将两个通常互不关联的研究领域联系起来的研究问题和假设。

甲酸具有腐蚀性，应在化学通风橱中操作。某些环境分离株可能具有潜在健康危害，所有菌株均应按生物安全二级标准处理。