Name: 使用左前部降冠动脉的永久结扎的月心肌梗死模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习小鼠左前降冠状动脉永久结扎手术技术，用于建立心肌梗死动物模型。该方法可监测从冠脉闭塞到心力衰竭的病理过程，适用于心脏生物学与生理学研究。

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本模型的开发得到了瑞士国家科学基金会（资助号 310030_162629，授予 LL）以及洛桑大学医院胸外科和重症医学科部门资金的支持。JL 获得了 Emma Muschamp 基金会资助。我们感谢洛桑大学生物与医学学院兽医及动物实验设施工作人员提供的关键支持。我们感谢洛桑大学医院心脏外科的 Giuseppina Milano 博士和洛桑大学心血管评估中心的 Alexandre Sarre 博士提供的技术指导。

本方案中描述的动物实验已通过沃州动物伦理委员会的审查和批准。
注意：本实验使用体重在 25 g 至 30 g 之间、年龄为 8 至 12 周的雄性 C57Bl/6J 小鼠。小鼠在常规条件下饲养，自由摄取颗粒饲料和水。手术器械已预先灭菌。实验人员应佩戴无菌外科手套和外科口罩，以减少污染和术后感染的风险。
1. 麻醉与气管插管。
<ol>
	<li>称重小鼠以确定麻醉药物、术后镇痛药物的剂量以及呼吸机的潮气量。将加热垫预热至 37 °C。手术装置示意图见图1。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮和赛拉嗪混合物，剂量分别为 80 mg/kg 和 10 mg/kg。</li>
	<li>使用电动剃刀快速剃除小鼠喉部及左侧肋骨区域的毛发。</li>
	<li>通过夹捏尾巴和/或后肢足部检查麻醉深度，并将动物仰卧位固定在加热垫上。在动物头部下方放置一小块纱布，以避免眼睛过热。涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥。</li>
	<li>用胶带将四肢固定在加热垫表面。将一段5-0丝线环穿过动物上切牙下方，并将线环末端用胶带粘贴固定在加热垫上。此操作可保持动物口腔张开，便于插管。</li>
	<li>在已剃毛区域涂抹脱毛膏，并用棉签轻轻按摩1分钟。用纱布擦去多余的毛发和脱毛膏。使用0.9%生理盐水滴液和纱布清洁切口区域。将无菌纱布块覆盖于已剃毛的喉部和胸壁，并浸润碘伏溶液。 
	注意：建议在切口部位使用局部麻醉药（如利多卡因或布比卡因）。</li>
	<li>将呼吸机设置为潮气量 7 mL/kg，通气频率 140 次/分钟。 
	注意：从此步骤开始，所有操作均应在显微外科立体显微镜下进行。</li>
	<li>握住喉部中央皮肤，使用小剪刀沿头尾方向做长约0.5 cm的切口。分离唾液腺叶，然后用弯头解剖镊轻轻分离胸骨舌骨肌筋膜，直至暴露喉部和气管。使用连接弹性带的牵开器固定切口边缘。 
	注意：此步骤无需切开肌肉。&#160;经验丰富的操作者可在不暴露气管的情况下经口腔完成插管，因此此步骤可选。</li>
	<li>轻柔地将舌头向一侧牵拉。用镊子将16 G套管的钝头内针插入气管。通过喉部切口观察内针是否正确进入气管。</li>
	<li>将套管连接至呼吸机，并将排气管插入水中以确认通气是否正常。气泡的出现表明插管成功。 
	注意：为保持术中组织湿润，可在喉部切口处覆盖浸有0.9%生理盐水和碘伏的无菌纱布。操作过程中应持续监控湿度。</li>
</ol>
2. 左前降支冠状动脉结扎
<ol>
	<li>松开左侧前肢的胶带，小心将小鼠移至右侧卧位。待动物处于正确体位后，固定左侧前肢。</li>
	<li>确定胸小肌与胸大肌之间的分界线，沿该线用剪刀做一长约1 cm的斜行皮肤切口。使用钝头显微剪分离胸肌筋膜，避免切开筋膜。用连接弹性带的牵开器保持胸肌处于分离状态。</li>
	<li>设置呼吸机，呼气末正压（PEEP）为 3 cm H₂O2O.</li>
	<li>使用钝头镊在第3肋间打开胸腔rd 第3肋间隙rd 和 4th 肋骨。避免触碰胸廓内动脉，以防出血。不要接触心脏或肺。将两个牵开器插入肋骨间隙，每侧肋骨各一个。图 2A).</li>
	<li>用弯头精细镊子小心地去除心包膜，并将其分开，注意不要损伤心脏和肺部。</li>
	<li>定位左前降支（LAD）冠状动脉。LAD 动脉呈一条浅表的鲜红色线条，从左心耳边缘延伸至心尖。</li>
	<li>使用持针器在左心房下方 2 至 3 mm 处将 7-0 丝线穿过左前降支（LAD）。缓慢牵拉丝线，避免撕裂心肌组织。打三个结完成结扎。结扎后，左心室的左下部将立即变为苍白图2B-). 
	注意：进入心室腔时切勿过深或过浅。对于假手术组动物，将缝合丝线置于LAD下方后缓慢抽出，避免组织撕裂。</li>
	<li>松开肋骨牵开器，握住 3rd 用镊子夹住肋骨，用6-0丝线在第3肋下穿过两次rd 和 4th 肋骨 
	注意：切勿穿孔心脏或肺组织。暂勿收紧结扣。</li>
	<li>在开口处滴加三滴37 °C的0.9%生理盐水溶液，关闭呼气排气管，持续2至3个呼吸周期，以充分膨胀肺部。收紧缝线，并以两道结扎固定。</li>
	<li>松开牵开器，释放被牵拉的肌肉，并协助其恢复至正常位置。</li>
	<li>用5-0缝合丝线缝合胸壁皮肤两针，并打两个结固定。用5-0缝合丝线缝合 throat 皮肤一针，并打两个结固定。</li>
</ol>
3. 术后操作步骤与随访。
<ol>
	<li>移除四肢上的胶带。将一块敷料放在动物右侧的加热垫上。 
	注意：从麻醉开始到此步骤的整个过程不应超过40-45分钟。可选地，腹腔注射0.2 mL浓度为0.1 mg/mL的阿替美唑，以加快苏醒过程。</li>
	<li>腹腔注射0.3 mL预热至37 °C的5%葡萄糖溶液。</li>
	<li>小心地将动物俯卧位放置在敷料垫上。</li>
	<li>停止呼吸机；若小鼠能自主呼吸，则谨慎拔除插管。</li>
	<li>皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并将小鼠置于预热至30 °C的笼子中，在100% O2条件下通风至少1小时。监测小鼠是否出现危及生命的情况，如严重呼吸困难或出血。</li>
	<li>术后前两天，每天监测小鼠两次。每天两次皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。每天两次腹腔注射0.3 mL的5%葡萄糖溶液。提供软质饲料并自由饮水。必要时对动物进行保温。 
	注意：除阿片类药物外，还应通过饲料混合或饮水稀释的方式给予非甾体抗炎药。</li>
	<li>从第三天起，若动物出现外观、呼吸或行为方面的异常表现，每天两次皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。若动物体重仍在下降，则每天两次腹腔注射0.3 mL的5%葡萄糖溶液。必要时对动物进行保温。 
	注意：必要时应严格应用预设的终止标准，以避免过度痛苦。通常小鼠在第3至第4天体重下降，之后开始回升。七天后，小鼠通常恢复至术前体重。</li>
</ol>

<ol><li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
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<li>van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse%3A+a+comparison+with+coronary+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), H1291-H1300 (2005).</li>
<li>Duerr, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+myocardial+remodeling+between+cryoinfarction+and+reperfused+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298(2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该操作的第一步关键环节无疑是插管。我们使用16 G导管的钝化内针作为气管插管。不建议将此装置用于体重低于22 g的小鼠。使用该装置时，对体重较小的小鼠进行插管可能难以准确操作，且易损伤气管。另一个关键点是在暴露气管和肋骨时，应尽量减少对肌肉组织的切口。减少组织损伤至关重要，尤其是在研究心肌梗死（MI）后炎症反应的过程中。因此，我们更倾向于使用镊子和牵开器轻柔地分离肌肉和肋骨8,9。我们不使用电灼器来控制出血10，因为这可能导致医源性灼伤并增加感染风险。创伤和感染均可能干扰炎症指标的准确读取。在开胸过程中，通过将呼吸机排气管插入水柱中，施加3 cm H2O的外源性呼气末正压（PEEP），可限制呼气末肺泡的塌陷。左前降支（LAD）的定位是另一个关键步骤，需注意冠状动脉的解剖结构可能因小鼠品系和基因型的不同而存在差异11。准确识别LAD需要一定经验，但按照本方案所述，将缝线直接置于左心耳下方2-3 mm处，通常可实现准确结扎定位。缝线下方左心室大范围迅速出现变色，即可确认结扎位置准确。最后，在关闭胸腔时，通过阻塞呼吸机排气管2-3个呼吸周期，人为制造自动PEEP，可使肺部短暂过度膨胀，有助于将胸腔内的空气排出12。我们有意不进行胸腔穿刺，如文献9,10所示，以此降低肺和心脏损伤的风险，并避免过度组织损伤或穿孔。
心肌缺血-再灌注（I/R）是一种相关的手术模型，可模拟临床上对心肌梗死（MI）患者恢复冠状动脉血流的过程。在I/R模型中，通过将一段导管结扎于左前降支（LAD）上，造成冠状动脉短暂阻塞，持续20至45分钟8,13。随后松开结扎，使心肌再灌注达到所需时长。对本实验方案进行这一简单修改，即可轻松将其转变为I/R模型4,8,14,15。心肌梗死可通过检测心肌肌钙蛋白T的血液水平8,10或通过超声心动图检查15加以确认。
心肌梗死（MI）与缺血/再灌注（I/R）模型不同，因为再灌注过程本身即可引起损伤。MI 引起更广泛的组织坏死，而在再灌注心肌中细胞凋亡更为显著5。MI 与 I/R 模型中炎症细胞浸润的动力学也存在差异，MI 中免疫细胞向心肌的浸润相对延迟7。梗死区域的大小和位置在永久性结扎模型与 I/R 模型之间也有所不同15。鉴于上述差异，在选择相关模型时必须谨慎，因为 I/R 模型与永久性 MI 模型并不等同。另一种小鼠心肌梗死模型是冷冻梗死模型。将低温探针作用于左心室前壁可导致心室组织冻结，并引起左前降支（LAD）动脉血流中断。然而，该技术在心肌重塑及炎症反应的时间进程和强度方面，与 MI 和 I/R 模型均存在差异16,17。
变异性是任何外科手术操作的局限性。这种变异性源于生物学差异，一个典型的例子是小鼠冠状动脉排列的个体差异11。此外，变异性也与操作者的技能有关。值得强调的是，操作者必须接受充分的培训，才能在此模型中获得稳定的结果。训练有素的操作者可以轻松地产生可重复的心肌梗死范围（图3A-B）。该模型的死亡率取决于左前降支（LAD）的位置、实验持续时间（天数、周数）、小鼠品系和基因型。所使用的麻醉药和镇痛药类型也可能通过潜在的心脏保护或心脏抑制效应影响实验结果。在我们的操作中，该模型的总体死亡率为25%-30%，此数据包括实验结束前发生的自然死亡和因人道终点而实施的安乐死，不考虑品系和实验持续时间。大多数死亡或安乐死事件发生在术后第2至第4天。严格实施疼痛管理和对动物的密切随访可降低死亡率。
此处展示了通过TTC染色分析梗死面积，以及通过蛋白质印迹法和实时PCR分别检测左心室（LV）中参与炎症或纤维化过程的蛋白和基因表达的代表性结果（图3C-G）。此外，这些参数中的许多也可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）或酶活性测定进行测量。当然，根据待验证的假设，本方法之后可结合超声、磁共振成像（MRI）或心室内导管对压力和容积的测定，进行任何功能性分析。也可取心脏组织，对分离的心肌细胞进行进一步的心脏细胞生物学研究。总体而言，左冠状动脉前降支（LAD）永久结扎的心肌梗死（MI）模型，特别适用于评估心肌梗死后发生的炎症和纤维化过程、伤口愈合以及心脏功能的变化。

急性心肌梗死（MI）是缺血性心脏病（IHD）最严重的表现形式。IHD 是全球范围内发病率和死亡率的首要原因，尤其在西方国家更为突出1。因此，它对医疗系统造成了巨大的经济负担2。MI 的特征是冠状动脉被动脉粥样硬化斑块阻塞，导致心肌大范围区域的血流中断。心肌供氧不足会引起心肌细胞的缺血性死亡。这种病理状态会触发心室组织的一系列反应，最终导致心室功能障碍、心室重构和心力衰竭3。MI 是一种复杂的病理生理状态，涉及多种复杂且相互关联的生物学过程，包括程序性细胞死亡、氧化应激反应、炎症、伤口愈合、纤维化以及心室重构。其中一些生物学反应可在体外被模拟为独立的过程，例如坏死诱导的损伤相关分子模式释放及其引发的炎症反应4。这些简化的模型对于理解 MI 至关重要。然而，只有体内模型才能真实反映 MI 发生后所涉及的生物学过程的复杂性。
尽管猪等大型动物的心肌梗死（MI）模型在心肌梗死病理生理学方面与人类更为接近，但小鼠模型的优势在于其基因工程技术的应用可能性，该技术在小鼠中的发展程度超过其他任何哺乳动物。此外，相对较低的成本和手术操作的简便性也是不可忽视的优点。
值得指出的是，心肌缺血-再灌注模型可能表现出与永久性心肌梗死模型不同的结果。心肌组织中涉及的细胞死亡类型、炎症反应以及伤口愈合反应的质量/强度或动力学特征等生物学过程，可能因模型不同而有所差异5,6,7。然而，本永久性冠状动脉闭塞方案可轻松调整，以建立缺血-再灌注模型。
该方法适用于与无再灌注心肌梗死的病理生理学相关的研究，能够监测从冠状动脉闭塞（数分钟）到晚期心力衰竭（数周）期间，在心脏局部组织和全身水平上发生的病理过程。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器，Omnifix-F</td><td>B. Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>30G 针头</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘 60 mL</td><td>MundiPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝性拉钩</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>直型带锁持针钳，Castroviejo</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Applimed SA</td><td>6001109</td><td></td></tr><tr><td>弯头组织剪</td><td>Aesculap</td><td>BC603R</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Remington</td><td>HC720</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖 5% B. Braun</td><td>B. Braun</td><td>531032</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏，Veet</td><td>Silk &amp;amp; Fresh Tech.</td><td>8218535</td><td></td></tr><tr><td>全弯虹膜组织镊</td><td>Aesculap</td><td>&amp;nbsp;OC022R</td><td></td></tr><tr><td>Ketasol 100 (100 mg/mL)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>弯头钝/钝显微剪</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>FM013R</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 0.9% B. Braun</td><td>B. Braun</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>短型固定器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线，BB</td><td>Ethicon</td><td>K880H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线，P-1</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>7-0 丝线缝合线，BV-1</td><td>Ethicon</td><td>K804</td><td></td></tr><tr><td>学生型 Dumont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>学生型精细弯头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>Weitacare</td><td>834301</td><td></td></tr><tr><td>手术加热垫</td><td>个性化设置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镇痛新&amp;nbsp; 溶液 0.3 mg/mL&amp;nbsp; 丁丙诺啡</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>16G 静脉导管内针（用于气管插管）</td><td>Abbocath-T</td><td>G714-A01</td><td></td></tr><tr><td>Universal S3 显微镜，OMPIMD</td><td>Zeizz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>呼吸机，MiniVent 型号 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>维滋泪</td><td>Alcon</td><td>1551535</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 (1 mg/mL)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr></tbody></table>

采用左前降支冠状动脉永久性结扎的小鼠心肌梗死模型

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

心肌梗死（MI）和急性冠状动脉疾病是西方生活方式人群中死亡的最主要原因之一。通过永久性结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立的小鼠MI模型，能够很好地模拟人类心肌梗死的病理过程。小鼠模型的优势在于可利用当前丰富的遗传工程技术。本文提出一种可重复的小鼠心肌梗死手术模型，采用氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉，并可通过拮抗剂快速逆转麻醉效果；无需气管切开即可完成气管插管，实现机械通气；通气过程中应用外源性呼气末正压（PEEP）以防止肺泡塌陷；采用对骨骼肌损伤最小的胸廓切开术；并在不进行胸腔穿刺的情况下实现肺膨胀。该方法创伤小、可重复性强，且能显著降低术后死亡率和并发症发生率。

小鼠在手术后第7天实施安乐死。动物以80 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪进行麻醉。在麻醉状态下，从下腔静脉采血并取心脏组织。去除心房后，心肌组织用冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。为测定缺血区域，将心脏在-20 °C下冷冻40分钟，随后切片，并在含2%氯化三苯基四氮唑（TTC）的PBS中37 °C染色20分钟。心脏切片于室温下用4%缓冲的多聚甲醛溶液固定过夜。由于脱氢酶的存在，存活组织染成红色，而缺血区域则无染色。使用成像软件计算左心室（LV）中未染色区域所占百分比，以表示缺血面积（图3A、B）。用于生化和分子生物学分析的心脏组织则用液氮速冻。在液氮中研磨心脏组织后，所得组织粉末用于蛋白和mRNA的提取。通过检测α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的表达以及SMAD2的磷酸化水平，采用蛋白质印迹法评估梗死心肌组织中纤维化的程度，这两者分别是成肌纤维细胞活性和TGFβ信号通路激活的主要指标（图3C）。此外，Tgfb及其下游靶基因Ctgf、Postn和Il11的mRNA表达水平均可反映心肌纤维化程度，通过实时聚合酶链式反应（PCR）进行检测（图3D）。
心肌梗死后第一周内，通常可观察到促炎信号通路及促炎基因的表达被激活。NF-κB p65 转录因子的磷酸化是炎症的标志性事件，在心肌梗死小鼠的全心肌提取物中可检测到该现象（图 3E）。通过实时 PCR 分析了促炎基因 Il1b、Il6 和 Cxcl10（图 3F）以及单核细胞/巨噬细胞标志物 Cd14 和 Mertk 的 mRNA 表达水平（图 3G）。需要注意的是，NF-κB p65 和 SMAD2 的磷酸化程度存在差异（图 3C、E，泳道 4–7），这种差异在很大程度上取决于梗死灶的大小。
<img alt="带有呼吸机、加热垫、剪刀、镊子、牵开器的手术器械装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：手术装置示意图。（A）手术装置包括经改装的加热垫、连接至弹性带的呼吸机和牵开器。（B）手术中使用的剪刀、镊子和持针器组合。（C）微型牵开器的特写。未显示：手术体视显微镜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术过程与心脏解剖示意图；啮齿类动物冠状动脉研究中的结扎操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：手术操作与左前降支结扎的代表性图像。（A）打开的胸腔并使用牵开器。左心室清晰可见。上方、左侧和下方的牵开器固定肋骨，右侧牵开器牵拉胸大肌。（B）将缝合针穿过左前降支下方。（C）将丝线缝合材料穿过左前降支下方并进入左心室。（D）在左前降支上完成单针缝合。（E）结扎操作结束，缝线通过三个结扎打结固定。（F）心脏前位视图示意图。左前降支结扎位置位于左心耳下方2-3 mm处，且在左前降支对角支上方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心肌梗死对小鼠心脏的影响；包括梗死面积、Western blot 和 mRNA 分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：术后第7天全心肌提取物中的纤维化与炎症情况。（A）术后第7天梗死心脏切片的TTC染色代表性图像。苍白的缺血区域未被染色而呈白色，存活组织则被染成红色。结扎线位于从左数第三个切片上。（B）采用TTC染色技术测量五只梗死心脏的缺血区域大小。结果以左心室（LV）中白色区域所占百分比表示。（C）全心肌中SMAD2磷酸化及α-SMA表达的Western blot分析，作为纤维化的指标。（D）全心肌提取物中Tgfb、Ctgf、Postn和Il11的mRNA表达。（E）全心肌提取物中NF-κB p65磷酸化的Western blot分析。（F）全心肌提取物中促炎基因Il1b、Il6和Cxcl10的mRNA表达。（G）Cd14和Mertk的mRNA表达，分别作为心肌中单核细胞/巨噬细胞及吞噬性巨噬细胞存在的指标。假手术组n = 3，心肌梗死组n = 4。mRNA表达分析中，表达量相对于内源性对照Rps18，组间比较采用非配对Student's T检验，*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001。图B、D、F和G中的误差线代表标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种外科手术方法，用于实现小鼠左前降支冠状动脉的永久性结扎。该模型对于研究心肌梗死的病理生理学及其伴随的生物学过程具有重要意义。

心肌梗死（MI）和急性冠状动脉疾病是西方生活方式人群中死亡的最主要原因之一。小鼠……

这种小鼠心肌梗死模型可用于在局部心肌组织和全身水平上监测从冠状动脉闭塞到晚期心力衰竭的病理过程。该方法适用于目前心脏生物学和心脏生理学中使用的任何检测手段，并且得益于小鼠遗传模型的极大多样性。掌握足够的外科手术技能可能需要较长时间才能精通。该操作最好在经验丰富的研究人员指导下逐步学习。通过可视化演示这种小鼠模型，可以分享有助于手术操作的技巧，从而加快学习进程。使用电动剃须刀快速剃除一只25至30克重的雄性C57-Black/6小鼠喉部及肋骨左侧区域的毛发。通过脚趾夹捏确认小鼠无反应。在动物眼睛上涂抹眼膏。将小鼠仰卧置于加热垫上，并在头部下方放置一小块纱布，以避免眼睛过热。用胶带固定四肢。将5-0丝线缝合线环穿过上切牙下方，并将线环末端固定在加热垫上，以在插管期间保持口腔张开。将脱毛膏涂抹于预先剃过的区域，用棉签轻轻按摩一分钟。用纱布去除多余的毛发和脱毛膏，并用数滴0.9%生理盐水溶液和纱布清洁暴露的皮肤。将无菌纱布块覆盖于剃过的喉部和胸部，然后用碘伏充分浸湿纱布。将呼吸机设置为潮气量7 mL/kg，通气频率140次/分钟。将小鼠置于显微外科立体显微镜下。固定喉部中央的皮肤，沿尾头方向做0.5 cm切口，并分离唾液腺叶。使用弯头镊子轻轻分离胸骨舌骨肌的筋膜，直至可见喉部和气管。然后用连接在弹性带上的牵开器固定切口边缘。接着，轻轻将舌头向侧方牵拉，用镊子将16号套管针的钝头内针插入气管。通过喉部切口观察气管内的正确插管，并将套管连接至呼吸机。将浸有碘伏的无菌0.9%生理盐水纱布覆盖于切口处，以保持手术过程中组织湿润。然后将排气管插入水中。气泡的存在表明插管成功。结扎左前降支冠状动脉（LAD）时，小心将小鼠移至右侧卧位，并在新体位下重新固定左前肢。辨认左胸小肌与胸大肌之间的分界线，并沿此线做一斜向的1厘米皮肤切口。使用钝性解剖显微剪刀分离胸肌筋膜，避免切开组织，并使用连接在弹性带上的牵开器维持分离状态。将呼吸机设置为呼气末正压 3 cmH₂O。用钝性镊子在第三与第四肋骨之间的第三肋间隙处打开胸腔。将两个牵开器分别插入肋骨两侧的肋骨笼中，使用弯头精细镊子小心去除心包膜，避免损伤心脏和肺部。找到左前降支（LAD），其表现为一条从左耳缘向心尖走行的浅表鲜红色线条。使用持针器将一根7-0丝线缝合线穿过左前降支下方，位置位于左心房下方2至3毫米处。缓慢牵拉丝线，避免撕裂心肌组织，用三个结扎紧结扎线。结扎后，左心室左下部会立即变苍白。现在松开肋骨牵开器，用镊子夹住第三根肋骨，在第三和第四肋骨下方各穿两次6-0丝线缝合。在开口处滴加三滴37摄氏度的0.9%生理盐水溶液，并关闭呼气排气管两到三个呼吸周期，以充分膨胀肺部。打两个结扎紧并固定缝线，然后松开牵开器以释放肌肉，帮助肌肉恢复至正常的解剖位置。随后用5-0缝合丝线缝合两针，并打两个结，关闭胸壁皮肤。用5-0缝合丝线单针双结缝合喉部皮肤。操作结束后，移除四肢的胶带绑带，小心将动物转为俯卧位放置在压迫垫上，并在动物右侧放置压迫垫于加热垫上。经腹腔注射0.3毫升37摄氏度预温的5%葡萄糖溶液。停止呼吸机。如果小鼠出现自主呼吸，需谨慎拔除插管。皮下注射每千克0.1毫克的丁丙诺啡。将小鼠置于30摄氏度、通风并提供100%氧气的笼子中，持续至少一小时，并进行监测。术后前两天，为小鼠提供软质食物和自由摄取的水，必要时对动物进行保温。术后七天，缺血区域因缺乏脱氢酶而不被氯化三苯基四氮唑染色，而存活组织因含有脱氢酶而呈红色。随后可在图像分析软件中将缺血区域计算为左心室白色区域所占的百分比。通过蛋白印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白和SMAD2磷酸化水平，可分别作为心肌成纤维细胞和转化生长因子β信号通路激活的主要检测指标，用于确定梗死心脏心肌组织中纤维化的程度。此外，还可通过实时聚合酶链式反应分析转化生长因子β及其下游靶基因mRNA的表达水平，以评估心肌纤维化的情况。心肌梗死后通常在第一周内即可观察到促炎信号通路的激活以及促炎基因的表达。同时也能检测到促炎基因和单核细胞/巨噬细胞标志物的 mRNA 表达。结扎高度将显著影响存活率，应根据不同品系或基因型进行调整，因为左前降支（LAD）的分支模式可能存在差异。连接反应中的恒定条件是获得可重复结果的关键。该步骤可与任何分析方法联用，并可后续进行功能分析、组织固定、细胞培养或任何感兴趣的实验技术。

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关键词：心肌梗死，小鼠模型，左前降支冠状动脉，永久性结扎，开胸手术，心肌缺血，动物模型，心血管疾病

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