利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

本方案可通过基于作用机制的方法，助力发现潜在的抗病毒小分子。加药时间实验可确定小分子在感染过程的哪个步骤发挥其抗病毒活性。分子对接可预测小分子与病毒蛋白之间的相互作用。

为评估药物在病毒感染前对宿主细胞的影响，将RD细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的接种密度接种于12孔板中。将细胞置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中过夜培养。次日早晨，在1 mL基础培养基中，以无毒浓度的待测化合物处理RD单层细胞，每组设三个复孔，处理时间为1小时或4小时。

处理孵育结束后，用一毫升 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 300 微升基础培养基中含有 50 个空斑形成单位的病毒， rocking 每 15 分钟一次，持续一小时。感染孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞，并每孔覆盖含 0.8% 甲基纤维素的一毫升新鲜基础培养基。在细胞培养箱中培养 72 小时后，每孔用两毫升 PBS 洗涤，并每孔加入 0.5 毫升 37% 甲醛固定细胞，固定 15 分钟。

固定结束后，用 PBS 洗涤各孔，每孔加入 0.5 毫升 0.5% 结晶紫溶液对细胞进行染色。2 分钟后，用轻柔的水流洗涤各孔，并将培养板静置风干。然后将培养板置于白色光源灯箱上进行计数，并根据公式计算柯萨奇病毒感染细胞的百分比。

进行分子对接分析时，从 PubChem 下载待测化合物的三维分子结构。若某分子尚无上传的三维结构，可下载其二维结构，或利用 SMILE 字符串序列，通过适当的分子软件将结构转化为三维分子。接下来，从 RCSB 蛋白质数据库下载病毒的生物组装单元。

使用适当的生物计算程序，从蛋白质数据库（Protein Data Bank）文件中删除溶剂分子，利用 Dunbrack 2010 旋转异构体库中的数据替换不完整的侧链，并如先前报道所述，为结构添加氢原子和电荷。为将待测化合物对接至已准备好的病毒单元，将待测化合物文件作为配体上传至加州大学旧金山分校（University of California San Francisco）Chimera 软件中，并选择整个已准备好的病毒蛋白作为受体，进行盲对接。为进一步对接，可根据盲对接结果所确定的兴趣区域，将对接位点限定在病毒蛋白的特定区域，进一步缩小搜索体积。

然后将对接文件上传至合适的分子图形系统，以分析结合模式的位置。选择配体，查找化合物与病毒蛋白之间的极性相互作用，并使用“与任意原子”选项识别极性接触。在本代表性实验中测试的两种小分子，无论是在病毒感染前对宿主细胞进行预处理，还是在感染后进行处理，均仅对柯萨奇病毒A16的感染性产生轻微影响。

相比之下，在共添加处理中，这些分子能够有效抑制感染，抑制率超过80%，表明当这两种化合物与病毒颗粒同时存在于宿主细胞表面时，其抗感染效果最为显著。基于流式细胞术的结合分析证实，这两种单宁通过阻止病毒颗粒与宿主细胞的结合，从而抑制柯萨奇病毒A16的感染性进入。单宁的分子对接结果显示，二者均被预测结合于柯萨奇病毒五聚体的峡谷区域，位置恰好位于容纳“口袋因子”（pocket factor）的口袋入口上方，该区域在介导柯萨奇病毒与宿主细胞的结合及入侵过程中发挥重要作用。

在这些表面投影中，可以观察到由小分子在结合口袋入口周围形成的极性相互作用所预测的独特残基，其中两种单宁酸共同涉及天冬酰胺-85、赖氨酸-257和天冬酰胺-417。在进行分子对接时，对结合构象进行排序时需要考虑病毒蛋白的拓扑结构。进一步的实验可包括在已发现的关键氨基酸位点引入突变的重组病毒，测试该化合物的抗病毒活性，以验证这些氨基酸对药物功效的重要性。