Name: 小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学习TRAP-seq技术用于小鼠肝脏细胞类型特异性基因表达分析。该方法通过亲和纯化从全器官裂解物中分离核糖体结合的mRNA，无需去除非目标细胞，为研究肝损伤修复过程中的基因表达变化提供高效工具。

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本工作由以下基金资助：F31-DK113666（AWW）、K01-DK102868（AMZ）、K08-DK106478（KJW）和 P30-DK050306（KJW 的试点资助）。

所有涉及小鼠使用的方法均符合宾夕法尼亚大学动物福利办公室IACUC提供的指南。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>放线菌酮
	<ol>
		<li>配制 500 µL 浓度为 0.1 g/mL 的放线菌酮溶液：将 50 mg 放线菌酮溶于 500 µL 甲醇中。 
		注意：放线菌酮对环境具有极高毒性，可导致先天性畸形。所有含放线菌酮的废液和缓冲液均应收集并妥善处理。 
		备注：放线菌酮可在 4 °C 下保存最多 1 天。放线菌酮可抑制翻译过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二硫苏糖醇（DTT）
	<ol>
		<li>配制 1 mL 浓度为 1 M 的 DTT 溶液：将 0.15 g DTT 粉末溶于无 RNase 水中。 
		注意：DTT 可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。 
		备注：DTT 是一种去垢剂。DTT 可在 -20 °C 下保存。建议将 1 M DTT 分装为每份 50 µL 的单次使用 aliquot。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱氧胆酸盐（DOC）
	<ol>
		<li>配制 10% DOC 溶液：取 1 g DOC 粉末置于 50 mL 锥形管中，加入无 RNase 水至总体积 10 mL，剧烈震荡直至粉末完全溶解。 
		备注：10% DOC 溶液呈淡黄色，可在室温（RT）下保存长达 1 年。DOC 用于核裂解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP 抗体
	<ol>
		<li>首次使用时将 GFP 抗体分装，迅速冷冻后于 -80 °C 保存。 
		备注：建议将 50 µg GFP 抗体分装为单次使用 aliquot。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>B 生物素化蛋白 L
	<ol>
		<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬生物素化蛋白 L，使其终浓度为 1 µg/µL。 
		备注：重悬后的溶液可在 -20 °C 下保存最多 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>牛血清白蛋白（BSA）缓冲液
	<ol>
		<li>配制 50 mL 的 3% BSA 缓冲液：将 1.5 g 无 IgG 和蛋白酶的 BSA 粉末加入 40 mL 的 PBS 中，涡旋混匀。待 BSA 完全溶解后，用 PBS 定容至 50 mL。 
		注意：BSA 缓冲液可在 4 °C 下保存长达六个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖缓冲液
	<ol>
		<li>配制 50 mL 解剖缓冲液母液：将 5 mL 10x Hank's 平衡盐溶液（HBSS）、125 µL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1,750 µL 1 M 葡萄糖和 200 µL 1 M NaHCO3 混合，再用无 RNase 水定容至 50 mL。 
		注意：解剖缓冲液母液可在 4 °C 下保存长达六个月。</li>
		<li>使用前立即加入终浓度为 100 µg/mL 的 0.1 g/mL 放线菌酮，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高盐缓冲液
	<ol>
		<li>配制 50 mL 高盐缓冲液母液：将 1 mL 1 M HEPES、8.75 mL 2 M KCl、500 µL 1 M MgCl2 和 500 µL 100% 辛基苯基聚乙二醇（材料表）加入无 RNase 水中，定容至 50 mL。 
		注意：高盐缓冲液母液可在 4 °C 下保存长达六个月。</li>
		<li>使用前立即加入 0.5 µL/mL 的 1 M DTT 和 1 µL/mL 的 0.1 g/mL 放线菌酮。新鲜配制的高盐缓冲液需置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低盐缓冲液
	<ol>
		<li>配制 50 mL 低盐缓冲液母液：将 1 mL 1 M HEPES、3.75 mL 2 M KCl、500 µL 1 M MgCl2 和 500 µL 100% 辛基苯基聚乙二醇加入 44.25 mL 无 RNase 水中，定容至 50 mL。 
		注意：低盐缓冲液母液可在 4 °C 下保存长达六个月。</li>
		<li>使用前加入 0.5 µL/mL 的 1 M DTT 和 1 µL/mL 的 0.1 g/mL 放线菌酮。新鲜配制的低盐缓冲液需置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织裂解缓冲液
	<ol>
		<li>配制 50 mL 组织裂解缓冲液母液：将 1 mL 1 M HEPES、3.75 mL 2 M KCl 和 500 µL 1 M MgCl2 混合，再用无 RNase 水定容至 50 mL。 
		注意：解剖缓冲液母液可在 4 °C 下保存长达六个月。</li>
		<li>使用前立即加入每 10 mL 缓冲液加 1 片无 EDTA 蛋白酶抑制剂、1 µL/mL 的 0.1 g/mL 放线菌酮和 10 µL/mL RNase 抑制剂。新鲜配制的组织裂解缓冲液需置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗体与磁珠的偶联
<ol>
	<li>抗体
	<ol>
		<li>计算所有样品所需的GFP抗体用量，并额外准备一个样品的用量。 
		注意：每个样品需要50 µg的每种GFP抗体。</li>
		<li>将GFP抗体置于冰上解冻，并在4 °C下以最大速度（&#62;13,000 x g）离心10分钟，然后将上清液转移至新的微量离心管中。 
		注意：抗体准备步骤可在磁珠准备之前进行，解冻后的抗体可保持在冰上。或者，此步骤也可在磁珠与生物素化蛋白L孵育期间进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重悬磁珠
	<ol>
		<li>通过轻柔吹打重悬磁珠（材料表）。</li>
		<li>每个样品使用150 µL磁珠。计算所有样品所需的磁珠总体积，并额外准备一份。将重悬后的磁珠转移至1.5 mL或2 mL微量离心管中。若实验所需总体积超过1 mL，应将总量均分为若干等份。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下微量离心管，加入1 mL PBS，轻柔吹打至少数次以洗涤磁珠。再次将磁珠置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备蛋白L包被的磁珠
	<ol>
		<li>每个样品使用60 µL生物素化蛋白L。若蛋白L此前已重悬并储存于-20 °C，需在冰上解冻；若为现用现重悬，则按所有样品所需总量并额外多准备一份取用。</li>
		<li>将计算好的体积的生物素化蛋白L加入已重悬并洗涤过的磁珠中。加入1x PBS，使终体积在使用1.5 mL微量离心管时为1 mL，或在使用2 mL微量离心管时为1.5 mL。将磁珠与生物素化蛋白L在室温下置于旋转仪上孵育35分钟。 
		注意：在此步骤中，可同时进行抗体的准备工作。</li>
		<li>将蛋白L包被的磁珠置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下微量离心管，加入1 mL 3% BSA缓冲液，轻柔吹打至少5次以洗涤蛋白L包被的磁珠。</li>
		<li>将包被磁珠置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除上清液。用3% BSA缓冲液重复洗涤4次（共洗涤5次）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体结合
	<ol>
		<li>将计算好的GFP抗体加入蛋白L包被的磁珠中，在4 °C下于旋转仪上孵育1小时。 
		注意：抗体孵育后，切勿涡旋亲和基质。</li>
		<li>在孵育期间，根据所有样品所需的总体积配制低盐缓冲液，并在使用前向低盐缓冲液原液中加入0.5 µL/mL的1 M DTT和1 µL/mL的0.1 g/mL环己酰亚胺。 
		注意：每个GFP偶联磁珠管需用3 mL低盐缓冲液洗涤，每个样品需200 µL低盐缓冲液用于重悬GFP偶联磁珠。新鲜配制的低盐缓冲液可在冰上保存数小时。</li>
		<li>将亲和基质置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除上清液。加入1 mL低盐缓冲液，轻柔吹打数次以洗涤亲和基质。再次将亲和基质置于磁力架上静置&#62;1分钟，吸除低盐缓冲液。用低盐缓冲液再重复洗涤2次（共洗涤3次）。</li>
		<li>用低盐缓冲液重悬磁珠，使每个样品含有200 µL亲和基质。 
		注意：亲和基质可在含0.02% NaN3的溶液中于4 °C保存最多2周。若亲和基质在1周内或过夜制备，使用前应迅速用低盐缓冲液洗涤3次，并在4 °C下于旋转仪上轻柔重悬至少10分钟。本步骤后可暂停实验流程。 
		警告：叠氮化钠对环境具有极高毒性，与酸接触会产生有毒气体。所有废弃物应收集并妥善处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肝组织裂解
<ol>
	<li>缓冲液配制与仪器准备
	<ol>
		<li>计算所需微量离心管的数量，标记后置于冰上预冷。 
		注意：通常每个样品需要七个 1.5 mL 微量离心管：1 个用于保存剩余的解剖肝脏，4 个用于盛装 4 mL 匀浆后的肝裂解液，2 个用于转移上清液。</li>
		<li>根据所有样品所需的总体积计算，配制新鲜的解剖缓冲液，并加入 1 µL/mL 的 0.1 g/mL 环己酰亚胺。将新鲜解剖缓冲液置于冰上，确保整个实验过程中保持低温。 
		注意：每个样品需要 10 mL 解剖缓冲液。</li>
		<li>根据所有样品所需的总体积计算，配制新鲜裂解缓冲液，并每 10 mL 加入 1 片无 EDTA 蛋白酶抑制剂、1 µL/mL 的 0.1 g/mL 环己酰亚胺以及 10 µL/mL 的 RNase 抑制剂。整个实验过程中将裂解缓冲液保持在冰上。 
		注意：每个样品需要 4 mL 裂解缓冲液。</li>
		<li>设置组织研磨器（材料表），使聚四氟乙烯（PTFE）-玻璃研磨管可在肝脏组织匀浆过程中置于冰上。向 PTFE-玻璃研磨管中加入 4 mL 冷裂解缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏再殖组织匀浆
	<ol>
		<li>根据批准的动物实验指南，对一只注射了 TRAP 载体并已由中国台湾 Fah-/- 小鼠移植肝细胞再殖 1−4 周的 8−12 周龄小鼠实施麻醉和颈椎脱位处死。</li>
		<li>将小鼠置于解剖板上，用 70% 乙醇喷洒腹部。用镊子在腹部较低位置挑起皮肤和腹膜，用剪刀做横向切口。继续用剪刀剪开，形成一个宽阔的 U 形腹膜瓣，注意不要剪破内脏。将腹膜瓣翻转至胸骨上方，暴露肝脏。</li>
		<li>使用精细剪刀和镊子小心取出肝脏，并迅速将组织放入冷解剖缓冲液中冲洗。如需匀浆冷冻组织，应迅速将所需量的肝组织转移至含有冷裂解缓冲液的 PTFE-玻璃研磨管中，避免组织解冻。 
		注意：解剖后的组织可在用解剖缓冲液清洗后进行速冻，并于 -80 °C 保存。本步骤后可暂停实验流程。</li>
		<li>将肝脏置于培养皿中称重，分离出 200−500 mg 肝组织块并转移至 PTFE-玻璃研磨管中。将剩余肝组织放入预冷的微量离心管中并速冻。</li>
		<li>使用电动匀浆器以 300 rpm 起始速度对样品进行匀浆，至少研磨 5 次，以从肝脏结构中充分解离肝细胞。每次下降玻璃管时，注意避免研杵升至液面以上，以防产生气泡导致蛋白质变性。</li>
		<li>将转速提高至 900 rpm，继续充分匀浆肝脏组织，至少完成 12 次完整往复运动。</li>
		<li>将裂解液转移至已标记并预冷的微量离心管中，每支 1.5 mL 微量离心管中裂解液体积不超过 1 mL。若使用了 4 mL 裂解缓冲液，则保留 1 管，其余 3 管立即速冻。 
		注意：在解剖下一只动物及配制新鲜裂解液期间，裂解液可在冰上保存最多 1 小时。肝组织匀浆可在裂解步骤后速冻并储存于 -80 °C。若使用冻存裂解液，所提取 RNA 量可能减少约 50%。本步骤后可暂停实验流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核裂解
	<ol>
		<li>将肝裂解液在 4 °C 条件下以 2,000 x g 离心 10 分钟，随后将上清液转移至新的、预冷的微量离心管中，置于冰上。</li>
		<li>加入相当于上清液体积 1/9 的 10% 辛基苯基聚乙二醇（nonylphenyl polyethylene glycol），使终浓度为 1%，并通过轻轻颠倒微量离心管混匀。</li>
		<li>短暂离心后，加入相当于样品体积 1/9 的 10% 脱氧胆酸钠（DOC），使终浓度为 1%，并通过轻轻颠倒微量离心管混匀。再次短暂离心后，冰上孵育 5 分钟。</li>
		<li>将核裂解液在 4 °C 条件下以 20,000 x g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的、预冷的微量离心管中，置于冰上。 
		注意：去除线粒体后的上清液可在冰上放置数小时，以便完成其余样品的收集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫沉淀
<ol>
	<li>对于每个离心管，取出上清液总体积的1%作为免疫沉淀前对照，用于与亲和基质孵育后的靶标富集情况进行比较。将免疫沉淀前对照与免疫沉淀样品同样处理，在4 °C下置于管式旋转仪上过夜孵育。</li>
	<li>向每个样品中加入200 µL亲和基质。在将亲和基质加入各样品前，务必通过轻柔吹打充分重悬磁珠。将裂解液与亲和基质在4 °C下于管式旋转仪上轻轻混匀，过夜孵育。 
	注意：本实验方案在完成此步骤后可暂停，暂停时间最长可达一天。</li>
</ol>
6. RNA 提取
<ol>
	<li>缓冲液配制与仪器准备
	<ol>
		<li>将磁力架置于 4 °C 预冷至少 30 分钟，并在整个实验过程中保持其置于冰上。</li>
		<li>计算所需微量离心管的数量，并在冰上或 4 °C 预冷。 
		注意：通常每个样本需要 1 个微量离心管用于最终纯化的 RNA。</li>
		<li>短暂离心步骤 5.2 中的离心管，并将其置于磁力架上至少 1 分钟以收集磁珠，将上清液转移至额外的微量离心管中收集或弃去。 
		注意：含有未结合组分的上清液可进行速冻并储存在 -80 °C，以便在纯化后与结合组分进行转录本富集的比较。此步骤后可暂停实验流程。</li>
		<li>通过向高盐缓冲液母液中添加 0.5 µL/mL 的 1 M DTT 和 1 µL/mL 的 0.1 g/mL 放线菌酮，配制高盐缓冲液。 
		注意：每个样本需要 5 mL 高盐缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>向每管中加入 1 mL 新鲜的高盐缓冲液，轻柔吹打至少 5 次，避免产生气泡。 
		注意：洗涤不充分可能引入未结合转录本的背景信号，而产生气泡可能加速 RNA 降解。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上静置 &#62;1 分钟后去除上清液。再用高盐缓冲液重复洗涤 4 次（共洗涤 5 次）。</li>
		<li>去除残留的高盐缓冲液，将微量离心管从磁力架上取下，置于室温（RT）5 分钟以升温。</li>
		<li>用含 β-巯基乙醇的裂解缓冲液（RNA 提取试剂盒提供）将磁珠重悬于 100 µL 中。 
		注意：任何含有变性剂硫氰酸胍的 RNA 提取与纯化试剂盒均可作为裂解缓冲液，用于从亲和基质中释放结合的 RNA。RNA 提取应在室温下进行，因为硫氰酸胍在低温下可能结晶。</li>
		<li>在最高速度下涡旋震荡磁珠和缓冲液至少 5 秒，短暂离心使缓冲液收集至微量离心管管壁，随后在室温下孵育 10 分钟，使磁珠结合的 RNA 释放至裂解缓冲液中。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上静置 &#62;1 分钟，收集上清液，并立即按照试剂盒说明书中的 RNA 纯化流程（材料表）进行 RNA 清洁步骤。 
		注意：含有洗脱 RNA 的裂解缓冲液上清液也可在 -80 °C 保存长达 1 个月，使用前解冻至室温即可进行清洁处理。</li>
		<li>为获得最高质量的提取 RNA，应执行所有可选步骤，包括 DNase 消化和全部 RNA 洗脱步骤。将 RNA 提取试剂盒提供的洗脱缓冲液或无 RNase 水加热至 60 °C，以实现最大 RNA 回收率。 
		注意：提取的 RNA 可在 -20 °C 保存长达 1 个月，或在 -80 °C 保存数年。此步骤后可暂停实验流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 可选的 RNA 质量分析（推荐）
<ol>
	<li>使用生物分析仪11评估RNA质量，并使用分光光度计12测定其浓度，以判断是否需要重复免疫沉淀过程，从而获得足量且高质量的RNA。 
	注意：用于高通量测序的RNA最佳质量应符合文库构建试剂盒和测序平台所规定的操作流程。</li>
</ol>
8. 下游应用
注意：通过TRAP方法分离的总RNA可用于多种标准下游应用，包括RNA测序（TRAP-seq）。在TRAP之后，也可采用标准的反转录和定量PCR方案。
<ol>
	<li>对于TRAP-seq，按照标准方法进行RNA-seq文库构建13。</li>
	<li>对于RNA-seq，使用商业化的RNA-seq试剂盒，通过基于寡核苷酸d(T)富集多聚腺苷酸化（poly(A)）转录本的方法制备cDNA测序文库。或者，如果总RNA质量低于多聚腺苷酸富集所推荐的水平，可使用rRNA去除模块。但需注意，测序后可能会观察到更多的rRNA比对结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TRAP-seq 是一种通过表位标记的核糖体实现细胞类型特异性翻译中 mRNA 分离的技术，可作为流式细胞分选（FACS）方法的替代方案，避免了 FACS 所需时间较长等局限性9。TRAP 技术能够直接从大量组织中快速高效地分离 RNA，有助于避免基因表达的任何改变。TRAP-seq 特别适用于再生的 Fah-/- 小鼠肝脏研究，因为在停用尼替西农后，肝细胞的扩增是细胞自主性的，从而可以对整合了转基因的肝细胞亚群进行基因表达谱分析。TRAP 载体还可与基因激活或沉默分子17共表达，包括 cDNA、短发夹 RNA 和向导 RNA，以研究特定基因激活或抑制对全局基因表达的影响。另外，RosaLSL-GFP-L10A 转基因小鼠可用于对任何具有 Cre 重组酶活性的细胞进行基因表达谱分析。由于 GFP:RPL10A 可在表达 Cre 的细胞中特异性表达，因此可借此研究肝脏损伤和再生过程中其他肝内细胞类型的作用。例如，将 CK19-Cre 小鼠与 TRAP 转基因小鼠杂交...

作为脊椎动物的主要代谢器官，肝脏负责葡萄糖稳态、血清蛋白合成、胆汁酸分泌以及外源性物质的代谢与解毒。当暴露于毒素时，肝脏具有非凡的能力，可再生受损的实质组织，以防止发生急性肝功能衰竭1。然而，在对乙酰氨基酚或酒精过量摄入的情况下，肝脏再生可能失败，从而导致急性肝衰竭2。此外，由病毒性肝炎感染、脂肪肝疾病以及脂肪性肝炎引起的慢性肝损伤可导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌3。目前针对终末期肝病唯一有效的治疗方法是肝移植，但受限于器官供体短缺，无法为所有患者提供有效的治疗4。因此，深入理解毒性肝损伤后的恢复过程，对于开发能够促进足够再生以恢复病变器官功能的治疗策略至关重要。
研究肝脏再生最广泛应用的模型系统是啮齿类动物的部分肝切除术，即切除大部分肝脏以刺激肝细胞快速增殖5。然而，部分肝切除术并不能模拟毒性肝损伤后所引发的肝细胞增殖过程，因为在人类急性肝损伤中常见的免疫细胞浸润和肝细胞坏死在该模型中并不发生6。一种更适用于模拟此类器官再生的系统是Fah-/-小鼠模型，该小鼠缺乏功能性的延胡索乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH），无法正常代谢酪氨酸，从而导致严重的肝损伤并最终死亡7。通过在饮水中添加药物尼替西农（nitisinone），可使这些小鼠长期维持健康状态。 Alternatively, FAH expression can be restored by transgene delivery to a subset of hepatocytes, which will expand to repopulate the liver upon nitisinone removal8.
为了分析再生肝细胞的基因表达变化，需要一种能够特异性分离Fah-/-小鼠中正在复制的肝细胞的工具，同时避免邻近受损肝细胞及其他细胞类型的污染。然而，肝细胞的荧光激活细胞分选（FACS）存在困难，原因如下：（1）再生肝细胞较为脆弱，导致肝脏灌注后细胞回收率低；（2）复制中的肝细胞大小高度不均，难以通过FACS获得纯度较高的细胞群体；（3）从肝脏灌注到RNA提取的整个操作过程耗时超过2小时，因此在样本获取前，基因表达谱可能已发生显著的人为改变9。
或者，可在再生肝细胞中特异性表达带有表位标签的核糖体，从而在器官收获后，利用亲和纯化技术从整体肝脏组织裂解液中快速分离出与核糖体结合的、正在活跃翻译的mRNA。本文中，我们描述了一种翻译核糖体亲和纯化（TRAP）10 结合高通量RNA测序（TRAP-seq）的实验方案，用于特异性分离并分析 Fah-/- 小鼠中再生肝细胞内的mRNA9。通过共表达绿色荧光蛋白标记的核糖体蛋白（GFP:RPL10A）与FAH，可利用抗体对含有GFP:RPL10A的多聚核糖体所结合的翻译中mRNA进行亲和纯化。该方法无需进行细胞解离操作（例如肝脏灌注）来分离脆弱的再生肝细胞，而是通过对完整器官组织进行裂解，并利用特异性抗体快速从目标细胞中提取RNA。最后，通过TRAP-seq获得大量且高质量的mRNA，可用于后续分析，例如测序以描绘肝细胞再生过程中基因表达的动态变化。

<table><tbody><tr><td>10 mL 组织研磨器，Potter-Elv，涂层</td><td>DWK生命科学（Wheaton）</td><td>358007</td><td></td></tr><tr><td>Absolutely RNA Miniprep试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>400800</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>纪念斯隆-凯特琳抗体 &amp;amp; 生物资源中心</td><td>GFP 抗体 #19C8 和 GFP 抗体 #19F7</td><td></td></tr><tr><td>无IgG、无蛋白酶的牛血清白蛋白</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸，DOC</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2510</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖，右旋糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 带透明盖培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（10倍浓度），含钙、含镁，不含酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，1 M 溶液，pH 7.3，分子生物学级，超纯，Thermo Scientific</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VV-83061-00</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA 磁珠分离模块</td><td>New England BioLabs</td><td>E7490S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）</td><td>New England BioLabs</td><td>E7530S</td><td></td></tr><tr><td>壬基苯基聚乙二醇，NP-40。IGEPAL CA-630</td><td>默克生命科学</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水，非DEPC处理水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>DWK生命科学（Wheaton）</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液（10倍浓度），pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 重组蛋白 L，生物素化</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>29997</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾，KCl</td><td>默克生命科学</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico试剂盒 &amp;和试剂</td><td>安捷伦</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 去污染溶液</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠，NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&amp;middot;在RNase抑制剂中</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

肝脏在损伤后的再生是哺乳动物的一项重要特征，可在暴露于环境毒素后防止器官立即衰竭和死亡。深入理解再生过程中基因表达的变化，有助于识别可用于促进肝脏损伤后功能恢复的治疗靶点。然而，由于缺乏特异性细胞标志物、细胞数量有限以及这些细胞的脆弱性，特异性分离再生肝细胞的方法受到限制。将核糖体亲和纯化（TRAP）技术与Fah-/-小鼠模型相结合，可在模拟肝脏损伤的背景下实现肝细胞再生过程的重现，从而对再生中的肝细胞进行基因表达谱分析。利用TRAP技术，可快速高效地分离特定细胞类型的正在翻译的mRNA。我们建立了一种方法，结合TRAP技术，通过亲和法从特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体蛋白（RP）GFP:RPL10A的肝细胞中分离正在翻译的mRNA。TRAP技术避免了传统荧光激活细胞分选所需较长时间可能引起的基因表达谱改变。此外，由于只有再生中的肝细胞表达GFP:RPL10A融合蛋白，所分离的mRNA不会受到周围受损肝细胞及其他肝内细胞类型的污染。经亲和纯化获得的mRNA质量高，可用于后续基于PCR或高通量测序的基因表达分析。

为了分析Fah-/-小鼠中再生肝细胞的基因表达谱，通过水动力注射法将包含转座子的质粒（TRAP载体）8递送至肝脏，该质粒共携带Gfp:Rpl10a融合基因和Fah转基因（图1A）。撤除尼替西农可诱导产生毒性肝损伤，从而形成选择压力，促使稳定表达FAH的肝细胞增殖并重建受损的肝实质9。免疫荧光染色显示，在肝脏再生两周后，再生肝细胞中FAH与GFP:RPL10A融合蛋白共表达（图1B）。
在以下代表性实验中，使用静息状态和再生中的小鼠肝细胞进行了TRAP-seq分析。首先，为了从静息肝细胞中获得GFP标...

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。

损伤后肝脏再生是哺乳动物的一项关键特征，可在暴露于环境毒素后防止器官立即衰竭和死亡。

通过TRAP-seq技术，我们可以分离特定细胞类型中的RNA，例如在受损肝脏中重新填充的肝细胞，以分析这些细胞中发生的基因表达变化。该方法无需从组织中去除不需要的细胞。细胞类型特异性的RNA是通过亲和纯化从整个器官裂解液中分离得到的。该技术有助于我们确定特定细胞对损伤的反应方式，从而可能帮助识别出治疗肝病的新策略或药物。该方法可用于研究肝细胞对不同类型的肝损伤的反应。目前，针对严重的急性肝损伤治疗选择有限，而该方法将有助于揭示新的治疗方法。该方法最初起源于脑部研究。在肝脏中，我们设想它可用于检测多种细胞类型的动态变化，例如肝细胞、胆管细胞、库普弗细胞和内皮细胞等。演示该实验操作的是我的研究生兼指导学生 Amber Wang。首先，通过轻柔吹打重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液。随后，将微量离心管从磁力架上取下，加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），再通过上下吹打洗涤磁珠。将离心管重新放回磁力架上静置超过一分钟，以收集磁珠并吸除PBS。为制备蛋白L包被的磁珠，向重悬并洗涤后的磁珠中加入16微升生物素标记的蛋白L，并加入1× PBS，若使用1.5毫升微量离心管，则调整终体积至1毫升，若使用2毫升微量离心管，则调整至1.5毫升。将磁珠与生物素标记的蛋白L在室温下于旋转仪上孵育35分钟。然后，将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液以收集蛋白L包被的磁珠。从磁力架上取下微量离心管，加入1毫升含3% BSA的PBS缓冲液，轻轻吹打至少五次以洗涤蛋白L包被的磁珠。再次将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液以收集包被的磁珠。将BSA洗涤步骤再重复四次。接着，将50微克的GFP抗体19C8和50微克的GFP抗体19F7分别加入蛋白L包被的磁珠中，在4°C条件下于旋转仪上孵育一小时。为收集亲和基质，将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，然后移除上清液。将离心管从磁力架上取下，加入1毫升低盐缓冲液。轻轻吹打混匀以洗涤亲和介质，并重复低盐缓冲液洗涤步骤两次。用200微升低盐缓冲液重悬珠子，制成200微升亲和介质悬液。首先，设置组织研磨器，使聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管在匀浆过程中可置于冰上。向聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管中加入 4 毫升冷裂解缓冲液。将肝脏置于培养皿中。使用刀具分离 200 至 500 毫克的肝组织块，并转移至聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管中。将剩余的肝组织放入预冷的微量离心管中，并在液氮中速冻。使用电动匀浆器对样品进行匀浆，起始转速为 300 转/分钟，至少研磨五次，以从肝组织结构中解离肝细胞。每次降低玻璃管时，保持研杵位于液面以下，以防止通气导致蛋白质变性。然后将转速提高至900 rpm，对肝组织进行充分匀浆，至少完成12个完整的往复行程。将裂解液转移至已标记且预冷的离心管中，每管裂解液不超过1毫升。为开始核裂解，将肝脏裂解液在4°C下以2,000 × g离心10分钟，然后将上清液转移至冰上预冷的新微量离心管中。向冰上的微量离心管中加入相当于上清液体积1/9的10% NP-40，并通过轻轻颠倒离心管混合溶液。使用小型离心机快速离心微离心管，然后加入相当于样品体积1/9的10% DOC。通过轻轻倒置微离心管进行混匀，再次快速离心，并在冰上孵育5分钟。在4°C条件下以20,000 × g离心核裂解液10分钟，随后将上清液转移至预冷的新的微离心管中，置于冰上。对于每个离心管，取上清液总体积的1%作为免疫沉淀前对照。将免疫沉淀前对照置于4°C条件下，在旋转仪上孵育过夜。使用移液器轻柔地重悬亲和介质，务必小心操作，然后向每个样品中加入200 µL。将裂解液在4°C下于试管旋转仪上轻轻混匀，孵育过夜。为分离RNA，先在小型离心机中短暂离心含有裂解液的试管，然后将试管置于磁力架上至少一分钟以收集磁珠。将上清液转移至新的微量离心管中。向每根试管中加入一毫升新鲜的高盐缓冲液，然后轻轻吹打至少五次，避免产生气泡。将试管置于冰上的磁力架上静置超过一分钟，使磁珠聚集，然后移除上清液。重复洗涤步骤另外四次。然后，将微量离心管从磁力架上取下，在室温下放置五分钟以升温。加入100 µL裂解缓冲液和0.7 µL β-巯基乙醇，重悬磁珠，以从亲和基质中释放结合的RNA。在最高转速下涡旋振荡管子至少五秒钟，并迅速离心。然后，将离心管在室温下孵育10分钟。将离心管置于磁力架上至少1分钟，收集上清液，并立即按照试剂盒中的RNA纯化方案进行RNA纯化。为获得最高质量的分离RNA，需执行所有可选步骤，包括DNase消化以及所有RNA洗脱步骤，包括建议将洗脱缓冲液预热至60摄氏度。本研究中，通过水动力注射法将含有GFP-L10A融合基因和Fah转基因的转座子质粒捕获载体共同递送至肝脏。撤除尼替西农后，诱导产生肝脏毒性损伤。免疫荧光染色证实，在肝脏细胞重建两周后，FAH与GFP-L10A融合蛋白共表达，并观察到再生的肝细胞。静息状态的样本产生了最高的融合蛋白产量，因为所有肝细胞在注射 AAV8-TBG-Cre 后均表达 GFP-L10A。相反，在不含 GFP-L10A 转基因的野生型对照组中几乎检测不到 RNA，表明 TRAP 实验流程具有高度特异性且背景信号低。当 TRAP 应用于正在由转导了 GFP-L10A 的肝细胞进行再增殖的肝组织时，获得了大量高质量的 RNA。相比之下，通过Bioanalyzer在阴性对照样本中未检测到RNA条带。与静息状态的肝细胞相比，增殖肝细胞中Gsta1的表达水平诱导上升了十倍以上，而由于缺乏输入RNA，从野生型小鼠经TRAP分离的RNA未检测到阈值循环值。在匀浆组织时，务必缓慢移动研杵，以防止产生气泡。在分离RNA后，可进行高通量测序或qPCR以分析基因表达。通过TRAP-seq技术，我们现在能够特异性地分离出再增殖肝细胞中的RNA，并分析肝脏再增殖过程中基因表达的变化。这使我们能够鉴定在此过程中发生改变的基因，以及治疗肝损伤的潜在治疗靶点。环己酰亚胺和DTT存在于多种缓冲液中，二者均有毒性。废弃物应根据机构规定进行收集和处理。

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生物学

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达分析

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

通过水动力基因递送法对裸DNA进行体内转染，可将基因导入动物组织，且引发的炎症反应极小。该方法能够产生足量的基因产物，从而可用于分析基因功能与调控机制，以及蛋白质结构与功能。...

通过水动力基因递送在小鼠中瞬时表达蛋白质

我们介绍一种 体外 小鼠胎肝成红细胞培养系统，可解析终末红细胞生成的早期与晚期阶段。该系统有助于对不同发育阶段中特定基因的功能进行分析。...

小鼠胎肝培养系统用于解析终末红细胞生成早期和晚期靶基因功能

本方案描述了如何在克隆水平上评估大量基因的表达。单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可对数百个样本和基因产生高度可靠且灵敏度强的结果。...

利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

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小鼠精准切割肝片作为肝脏生物学的离体研究模型

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

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激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

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小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

本文介绍了通过胎内（in utero）和离体（ex...

in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

学习TRAP-seq技术用于小鼠肝脏细胞类型特异性基因表达分析。该方法通过亲和纯化从全器官裂解物中分离核糖体结合的mRNA，无需去除非目标细胞，为研究肝损伤修复过程中的基因表达变化提供高效工具。

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

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