小鼠感染甲型流感病毒期间T卵泡帮助细胞和胚芽中心反应的评价

滤泡辅助性 T 细胞是新发现的 CD4 T 细胞亚群，可在高亲和力动物生产中为 B 细胞提供帮助。证明流感病毒感染中 Tfh 细胞的鉴定将有助于新研究人员了解如何执行 Tfh 相关研究的必要技术。由于不适当的病毒滴度会导致死亡或免疫反应过弱，因此我们建议在进行实验之前确定滴度。

用于 8 周龄雄性 C57 黑色 6 只小鼠的 PR8 病毒接种。在生物安全 2 级条件下，解冻冰上储存的零下 80 摄氏度的 PR8 病毒原液。涡旋病毒以获得均匀的溶液。

在预冷的 1.5 毫升试管中将病毒稀释为每微升 PBS 的两个平台单位，并确认麻醉动物没有反应的脚趾捏。再次涡旋病毒。在 20 微升移液器吸头中加入 10 微升病毒。

小心地将病毒滴剂加入最多三只镇静动物的一个鼻孔中，然后在另一侧重复接种。然后，将所有小鼠置于温暖笼子中的胸骨卧位中，并监测直至完全恢复，并每天称量每只小鼠 10 天。实验结束时，将小鼠放入生物安全 2 级层流罩中，并将第一只动物固定在吸水性、覆盖着纸的泡沫解剖板上。

用解剖剪刀沿腹部中线切开皮肤，用镊子拉伸皮肤，将皮肤固定在解剖板上。打开腹膜收集脾脏，并将脾脏放入一个 70 微米的过滤器中，该过滤器带有一个 6 厘米的培养皿，其中含有 5 毫升 DMEM，并补充有 1% FBS。将隔膜和肋骨劈开到胸腺，并将肋骨固定在一侧以露出胸腔。

移动肺和心脏，将纵隔淋巴结定位在气管腹侧附近。然后，将淋巴结放在第二个 6 厘米长的培养皿中，该培养皿中含有 5 毫升培养基，并使用 3 毫升注射器柱塞通过两个过滤器的网孔轻轻捣碎两个组织。用 1 毫升新鲜 DMEM 加 FBS 冲洗每个过滤器，然后将细胞悬液转移到单独的 15 mL 离心管中。

通过离心收集细胞，并将沉淀彻底重悬于每管 1 毫升新鲜 DMEM 加 FBS 中。然后向脾细胞悬液中再加入 4 毫升培养基，并将两个试管置于冰上。为了对细胞进行 CXCR5 表达染色，将试管倒置数次以混合，并将每个样品 2 乘 10 至 6 个细胞转移到单独的 FACS 管中。

向每管中加入 2 毫升染色缓冲液，并通过涡旋混合细胞。通过离心沉淀细胞并弃去上清液。在吸收纸上轻轻敲击每个试管两次，然后轻轻轻弹两个底部，使细胞重悬于残留的上清液中。

用每管 0.2 μL Fc 受体阻滞剂阻断非特异性结合，轻轻弹动试管混合，然后将试管置于冰上 10 分钟。孵育结束时，向每个试管中加入 0.3 微升生物素抗小鼠 CXCR5，轻轻轻弹混合。将试管放在冰上 1 小时，轻轻弹动 30 分钟。

孵育结束时，向试管中加入 2 mL 染色缓冲液并涡旋混合，然后通过离心沉淀细胞。弃去上清液并轻弹以将细胞重悬于残留缓冲液中。然后，将试管放在冰上，并用针对目标表面标志物的抗体标记细胞，如刚才所示。

孵育结束时，用 2 mL 染色缓冲液洗涤细胞，并将每个沉淀重悬于 400 μL 新鲜染色缓冲液中，以便通过流式细胞术进行分析。PR8 病毒感染的小鼠在第 6 天开始减轻体重，在第 8 天达到最高减轻，并在第 10 天恢复到初始体重水平。正如预期的那样，在 PBS 处理的对照小鼠中未观察到体重减轻。

病毒感染还会导致引流淋巴结内强大的淋巴细胞扩增。通过流式细胞术分析观察到，T 滤泡辅助细胞分化在感染后第 5 天开始，并在感染后第 10 天达到峰值，与对照动物相比，流感病毒感染的小鼠诱导了大量滤泡辅助性 T 细胞。此外，在纵隔淋巴结和脾脏中，与在 PR8 动物中 PD-1 阳性 CXCR5 阳性细胞群增加的对照小鼠相比，流感抗原特异性 CD4 阳性 T 细胞数量显着诱导。

此外，IL-21 的细胞内染色显示，PR8 感染在病毒感染后诱导这种细胞因子的产生显着增加。免疫荧光染色表明 PR8 感染小鼠中存在诱导的生发中心反应，ELISA 表明在病毒感染的动物中产生流感病毒特异性抗体。在冰上进行 CXCR5 染色一小时很重要，因为染色质量会受到染色温度和时间的影响。

尽管我们证明了 CXR5 和 IL-21 染色，但可以通过这种方法评估其他表面标志物、转录因子和细胞因子，以提供有关 Tfh 分化和功能的大量信息。