Name: 小鼠感染甲型流感病毒期间T卵泡帮助细胞和胚芽中心反应的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解甲型流感病毒感染小鼠模型中T卵泡帮助细胞和胚芽中心B细胞反应的评估方法。本研究使用C57BL/6小鼠和PR8病毒，为免疫学研究提供关键实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢上海巴斯德研究所流式细胞仪平台、ABSL2 实验室和 SPF 动物实验平台工作人员提供的技术帮助与建议。本工作获得以下基金项目资助：中国科学院战略性先导科技专项（XDB29030103）、国家重点领域研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2016YFA0502202）、国家自然科学基金（31570886）。

动物实验已获得中国上海巴斯德研究所机构动物护理和使用委员会的批准。所有实验均依据该委员会批准的动物实验方案进行。
注意：小鼠病毒感染及器官分离操作应在生物安全二级（ABSL2）条件下进行。
1. PR8流感病毒接种及小鼠体重记录
<ol>
	<li>在ABSL2实验室中准备8周龄雄性C57BL/6小鼠用于感染实验。 
	注：本方案同样适用于雌性小鼠实验。</li>
	<li>PR8病毒稀释：将病毒从-80 °C冰箱中取出，置于冰上孵育直至完全融化。充分涡旋混匀原液病毒，然后在预冷的1.5 mL离心管中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，135 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）将病毒稀释至2 PFU/µL。</li>
	<li>小鼠麻醉：称量每只小鼠的体重，计算所需戊巴比妥钠（2 mg/mL）的注射体积（注射体积为小鼠体重（g）的4倍，单位为µL）。通过腹腔注射计算所得体积的戊巴比妥钠。 
	注：此步骤旨在使小鼠呼吸平稳安静，以便准确进行鼻内接种病毒。心跳过快或过慢均提示麻醉不当。此外，建议使用兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>鼻内接种：充分涡旋混匀稀释后的PR8病毒。吸取10 µL病毒液，逐滴小心地对一侧鼻孔进行鼻内接种。完成同笼内所有小鼠（最多5只）该侧接种后，再依次对另一侧鼻孔重复相同操作（整个接种过程中保持小鼠呼吸平稳安静）。每只小鼠总共感染40 PFU的PR8病毒。</li>
	<li>将小鼠置于温暖的笼具中，使其保持胸卧位，以利于恢复。</li>
	<li>连续10天每日监测小鼠体重（感染当天记为第0天）。</li>
</ol>
2. 从脾脏和纵隔淋巴结（mLN）中分离淋巴细胞
<ol>
	<li>小鼠安乐死：将小鼠放入一个小容器中，从容器底部缓慢通入CO2，使其平静地安乐死。当小鼠不再活动时将其取出，并实施颈椎脱位以确保完全死亡。用75%乙醇浸泡小鼠体表，随后转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将小鼠固定在铺有吸水纸的解剖泡沫板上，使用解剖剪沿腹部中线及后肢剪开皮肤，用镊子将皮肤向两侧拉伸，并用解剖针固定拉伸后的皮肤。</li>
	<li>为每只小鼠准备两个6 cm培养皿，并置于冰上。在每个培养皿中放置一个70-μm细胞筛网，并加入5 mL含1%胎牛血清的DMEM培养基（DMEM (1% FBS)）。</li>
	<li>脾脏分离：用解剖剪剪开腹膜以暴露腹腔，取出脾脏并放入已准备好的培养皿中。</li>
	<li>纵隔淋巴结（mLN）分离：剪开膈肌及肋笼底部至胸腺附近区域，将肋骨向一侧拉开并用解剖针固定，以暴露胸腔。将肺向右侧推开，用镊子在心脏下方、气管腹侧附近取出mLN。</li>
	<li>将mLN放入已准备好的培养皿中。</li>
	<li>制备单细胞悬液：用3 mL注射器的推杆轻轻研磨脾脏或mLN，使其通过70-μm细胞筛网。用1 mL新鲜DMEM (1% FBS)冲洗细胞筛网。重悬细胞悬液后转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以350 × g离心6分钟，弃上清，加入1 mL DMEM (1% FBS)。</li>
	<li>用1 mL移液器彻底重悬细胞沉淀。向脾细胞悬液中加入4 mL DMEM (1% FBS)，并在后续操作中保持在冰上。 
	注意：为完全从沉淀中分离出单个细胞，必须先用1 mL培养基重悬细胞沉淀，而不是直接使用5 mL。&#160; 
	从本步骤开始，所有操作可在普通实验室中进行。</li>
	<li>脾细胞计数
	<ol>
		<li>通过反复倒置离心管数次重悬细胞。取10 μL细胞悬液加入90 μL红细胞裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，155 mM NH4Cl）中。室温（RT）孵育3分钟，然后加入900 µL冷PBS终止反应。</li>
		<li>在4 °C条件下以400 × g离心6分钟，弃上清，用100 μL冷PBS重悬细胞沉淀。取10 μL细胞悬液与10 μL 0.4% w/v台盼蓝混合，从中取出10 µL混合液用于血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>计算方法：按常规方法计算细胞数量。简而言之，计数血细胞计数板上两个对角线角落方格内的细胞数，分别记为N1和N2。5 mL细胞悬液的细胞浓度应按(N1+N2)/2 × 104 /mL计算。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 PD-1 和 CXCR5 对多克隆 Tfh 细胞进行免疫染色
<ol>
	<li>使用生物素标记的抗CXCR5抗体进行染色。
	<ol>
		<li>通过上下颠倒离心管重悬细胞悬液。取2 × 106 个细胞加入流式管中，并加入2 mL染色缓冲液（PBS含1% FBS和1 mM EDTA）。在涡旋振荡仪上涡旋洗涤。</li>
		<li>在4 °C下以350 × g离心6分钟。倾去上清液，并将管口在吸水纸上轻蘸两次以去除残留液体。</li>
		<li>轻轻敲击管底，利用残留液体重悬细胞沉淀。将离心管置于冰上的管架中。 
		注意：残留液体积约为25 μL。</li>
		<li>每管加入0.2 µL抗小鼠CD16/CD32（Fc受体阻断剂）。轻敲管底混匀，冰上孵育10分钟。 
		注意：若需处理多个样本，可通过将每管5 µL染色缓冲液进行稀释来配制抗体混合液。混合液的配制方法为：将(n/10+1) × 0.2 µL Fc受体阻断剂加入(n/10+1) × 5 µL染色缓冲液中混匀，每管加入5.2 µL混合液。</li>
		<li>每管在残留的30 µL染色缓冲液中加入0.3 µL生物素标记的抗小鼠CXCR5抗体，轻敲管底涡旋混匀。 
		注意：抗体混合液的配制方法同步骤3.1.4。</li>
		<li>冰上孵育1小时，于30分钟时轻敲管底轻轻重悬细胞。 
		注意：30分钟时轻敲是为了防止细胞聚集，以获得更好的染色效果。</li>
		<li>加入2 mL染色缓冲液，在涡旋振荡仪上涡旋混匀。在4 °C下以350 × g离心6分钟，按步骤3.1.2所述弃去上清液。轻敲管壁涡旋重悬细胞，冰上放置以进行后续染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用其他表面标志物进行染色。
	<ol>
		<li>按照步骤3.1.4所述方法配制抗体混合液（表1）。</li>
		<li>将抗体混合液加入各管中。轻敲管底混匀，冰上孵育30分钟。</li>
		<li>用2 mL染色缓冲液洗涤细胞。在4 °C下以350 × g离心6分钟。</li>
		<li>弃去上清液，每管加入400 µL染色缓冲液。在涡旋振荡仪上涡旋混匀，避光保存直至进行流式细胞术分析。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PR8流感病毒NP特异性Tfh细胞的免疫染色
注意：该针对NP特异性Tfh细胞的染色方案来自先前的研究15,17。
<ol>
	<li>进行生物素标记的CXCR5染色，步骤同3.1，但染色时细胞数量取3 × 106，以确保在流式细胞术中能记录到足够数量的抗原特异性细胞。</li>
	<li>向3.1.7步骤中的离心管中加入0.3 µL APC标记的IAbNP311-325 MHC II类（NP311-325）四聚体。如步骤3.1.4所述，为多个样本配制混合液。 
	注意：必须在加入抗CD4抗体之前进行四聚体染色，因为CD4与抗CD4抗体的结合会干扰四聚体的最佳染色效果。</li>
	<li>轻轻敲击离心管使细胞混合物重悬，并在室温下避光孵育30分钟。 
	注意：在管口覆盖湿润的纸巾以减少蒸发。</li>
	<li>加入其他表面标志物的混合抗体（表1），继续在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>按照步骤3.2.3和3.2.4所述进行洗涤并重悬细胞。</li>
</ol>
5. 多克隆Tfh细胞中Bcl6的免疫染色
<ol>
	<li>按照第3节所述进行表面标志物（表2）染色，但最后一次用2 mL PBS洗涤，而非染色缓冲液。</li>
	<li>在4 °C下以350 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管底重悬细胞沉淀。</li>
	<li>向管中加入300 µL 3.7%甲醛溶液（用PBS稀释37%甲醛制备），用于细胞固定。在涡旋振荡仪上涡旋混匀，并在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>加入2 mL染色缓冲液进行洗涤，在4 °C下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管壁重悬细胞。</li>
	<li>向管中加入300 µL 0.2% Triton-X 100，并在涡旋振荡仪上涡旋重悬细胞。室温孵育15分钟。</li>
	<li>加入2 mL染色缓冲液进行洗涤，在4 °C下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管底重悬细胞。</li>
	<li>每管加入1.5 µL PE标记的抗Bcl6抗体。轻轻敲击管底以重悬混合物，在室温下孵育2小时，每隔30分钟轻敲一次管底。 
	注意：在管口覆盖湿润的滤纸，以减少混合液蒸发。</li>
	<li>向管中加入2 mL含0.01% Triton-X 100的PBS。涡旋混匀后，在4 °C下以500 × g离心6分钟。</li>
	<li>重复步骤5.8的洗涤操作。用400 µL染色缓冲液重悬细胞，将细胞置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
6. IL21 的细胞内染色
<ol>
	<li>用PMA（佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）和离子霉素刺激细胞。
	<ol>
		<li>从脾细胞悬液中取2 × 106个细胞，于4 °C下以350 × g离心6分钟。弃去上清液，用500 µL完全T细胞培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至24孔板中。</li>
		<li>向500 µL完全培养基中加入20 nmol PMA和2 µmol离子霉素18，通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>将步骤6.2中配制的溶液加入24孔板的细胞悬液中，轻轻振荡混匀。设置未刺激对照组：向另一孔细胞中加入500 µL不含PMA和离子霉素的完全T细胞培养基。将板置于&#160;CO2培养箱&#160;中&#160;37°C孵育4小时。</li>
		<li>向每孔中加入10 μmol BFA（布雷菲德菌素A，用甲醇溶解），以阻断高尔基体介导的蛋白质转运。将培养板放回细胞培养箱，继续孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行细胞表面标志物染色。
	<ol>
		<li>轻轻吹打使细胞重悬，转移至FACS管中。向管中加入1 mL染色缓冲液，在4 °C下以350 × g离心6分钟。</li>
		<li>参照步骤3.1.4进行Fc受体阻断染色。</li>
		<li>参照步骤3.2.1至3.2.3进行细胞表面标志物染色（表3），但用2 mL PBS洗涤细胞。</li>
		<li>在4 °C下以350 × g离心6分钟，弃去上清液，轻敲管底使细胞重悬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每管中加入0.2 µL活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒中的试剂，在室温避光孵育10分钟，以标记死细胞。</li>
	<li>向管中加入2 mL PBS，使用涡旋振荡器混匀，在4 °C下以350 × g离心6分钟，弃去上清液。</li>
	<li>参照步骤5.3和5.4进行细胞固定。</li>
	<li>加入300 µL染色缓冲液重悬细胞，将样品管于4 °C冰箱中过夜保存。在4 °C下以500 × g离心6分钟，弃去上清液。 
	注意：此步骤可省略，直接从步骤6.5进入步骤6.7。</li>
	<li>向管中加入1 mL皂苷缓冲液（含0.2%（w/v）皂苷的染色缓冲液），使用涡旋振荡器混匀，冰上孵育20分钟，以实现细胞通透化。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心6分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入0.5 µL人Fc-IL21受体。若需处理多个样本，参照步骤3.1.4配制抗体混合液，但使用皂苷缓冲液而非染色缓冲液稀释抗体。</li>
	<li>室温孵育1小时，期间在30分钟时轻敲管底使细胞重悬。</li>
	<li>加入2 mL皂苷缓冲液洗涤细胞，在500 × g下离心6分钟，弃去上清液，重复洗涤一次。</li>
	<li>向每管中加入0.1 µL APC-抗人Ig(H+L)抗体。若需处理多个样本，参照步骤3.1.4配制混合液，但使用皂苷缓冲液而非染色缓冲液稀释抗体。</li>
	<li>将样品置于冰上避光孵育30分钟，并参照步骤6.11进行洗涤。</li>
	<li>用400 µL染色缓冲液重悬细胞，样品置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
7. 生发中心B细胞和浆细胞染色
<ol>
	<li>取细胞，并按照步骤 3.1.1 至 3.1.4 进行抗 Fc 受体抗体染色。</li>
	<li>进行表面标志物染色（表 4），步骤同 3.1.5 至 3.1.7，但孵育时间为 30 分钟，而非 1 小时。</li>
	<li>用 400 µL 染色缓冲液重悬细胞。将样品置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
8. 从血液中分离血清
<ol>
	<li>感染后第14天（d.p.i 14），从面部静脉采集血液，并将血液样本置于4 °C冰箱中过夜。 
	注意：血液采集需在ABSL2条件下进行，从本步骤起，后续所有操作可在普通实验室中进行。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g 离心10分钟。使用200 µL移液器小心分离血清，避免红细胞污染。每份样本分装至3个管中，并储存于-80°C。</li>
</ol>
9. 采用ELISA法检测HA特异性抗体滴度
<ol>
	<li>每孔加入 50 µL 浓度为 2 µg/mL 的 HA 蛋白溶液，包被 ELISA 板，在 4 °C 冰箱中过夜孵育。</li>
	<li>用 200 µL 含 0.05% Tween 的 PBS（PBST）洗涤三次。每孔加入 100 µL 含 5% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，室温孵育 2 小时，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>血清稀释与孵育：以 PBS 中含 3% BSA 作为稀释缓冲液。将血清用稀释缓冲液按 1:50、1:150、1:450，…… 至 1:36450 进行系列稀释（建议采用 3 倍系列稀释）。每孔加入 50 µL 稀释后的血清，置于 4°C 冰箱中过夜孵育。</li>
	<li>弃去血清，每孔加入 200 µL PBST 快速洗涤一次（轻轻震荡后弃去）。随后在摇床上用 200 µL PBST 缓慢洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的针对总 IgG、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c 的二抗（用 PBST 按 1:5000 稀释），室温孵育 1 小时。按步骤 9.4 所述方法用 PBST 洗涤酶标板。</li>
	<li>从 4 °C 保存条件下取出等体积的缓冲液 A 和缓冲液 B（TMB），在室温下预热至少 30 分钟后使用。将 A 和 B 混合后，每孔加入 100 µL TMB 显色液，在室温下轻轻震荡孵育 10–30 分钟。 
	注意：此为 TMB 底物试剂盒（BD,555214）说明书的简要描述。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 2M H2SO4 终止反应，使用仪器测定 OD450 值。</li>
	<li>数据分析：通过减去空白孔的背景信号（空白孔的 OD450 值）获得最终 OD450 值。以稀释倍数为 X 轴，OD450 值为 Y 轴，绘制各样本对应抗体亚型的曲线。</li>
</ol>
10. 组织学
<ol>
	<li>在感染后第10天（d.p.i.）分离脾脏。用3.7%甲醛溶液在室温下固定1小时。弃去固定液，用PBS在摇床上洗涤5分钟，重复三次。</li>
	<li>将脾脏置于含10%蔗糖的PBS中，4°C下脱水1小时；随后转移至含30%蔗糖的PBS中，4°C轻轻振荡脱水，直至脾脏沉入15 mL离心管底部。</li>
	<li>取出已脱水的脾脏，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并进行冷冻切片。</li>
	<li>将丙酮预冷至-20°C。用预冷的丙酮孵育组织切片10分钟。用PBS洗涤组织切片三次。</li>
	<li>用含0.2% Triton X-100的PBS对组织切片进行通透处理20分钟，并用PBS洗涤三次。</li>
	<li>用含10%正常山羊血清（封闭缓冲液）的PBS在室温下封闭非特异性结合位点1小时，随后用PBS洗涤一次。</li>
	<li>使用链霉亲和素/生物素封闭试剂盒进行进一步封闭。 
	注意：从本步骤开始，切勿让样品干燥。</li>
	<li>一抗染色：小心地将用封闭缓冲液稀释的生物素化PNA（25 µg/mL）和大鼠抗小鼠IgD抗体（2.5 µg/mL）加至组织切片上。将切片置于湿盒中，在4°C冰箱中孵育过夜。</li>
	<li>用PBST快速洗涤组织切片一次，随后在PBST中缓慢振荡洗涤5分钟。重复洗涤三次。</li>
	<li>用封闭缓冲液将Alexa Fluor 488标记的链霉亲和素（1:500）和Alexa Fluor 555标记的山羊抗大鼠IgG抗体（1:500）稀释后，小心地加至组织切片上。</li>
	<li>在室温下孵育1小时。</li>
	<li>按照步骤10.8的方法洗涤组织切片，小心地用Prolong封片液封片。轻轻加盖盖玻片，避光保存于4°C，直至进行共聚焦显微镜分析。</li>
	<li>通过计数单位面积内的生发中心（GC）数量来评估GC反应的强度。</li>
</ol>

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

由于Tfh细胞在辅助B细胞产生高亲和力抗体方面具有特殊作用，其分化机制及调控方法已被广泛研究，以期为疫苗设计提供新策略。流感病毒感染可诱导强烈的Tfh细胞和生发中心B细胞应答，因此是该研究领域的合适模型。本文描述了通过鼻内接种进行流感病毒感染、利用流式细胞术、免疫荧光和ELISA检测Tfh相关应答的实验方案。这些检测方法将有助于研究人员观察Tfh细胞分化、生发中心B细胞发育以及流感病毒特异性抗体的产生，并进一步探索和鉴定免疫应答中的关键分子。
在流感病毒感染小鼠模型的研究中，体重下降是衡量小鼠发病情况的常用指标。流感病毒感染小鼠后预期的体重变化动力学如图1a所示，反映了小鼠体内诱导出的正常免疫应答。然而，实验中常会出现异常情况，例如小鼠体重持续下降或在整个观察期内均未出现体重减轻。根据我们的经验，这些小鼠通常存在异常偏低或偏高的免疫反应，从而干扰实验结果。为避免此类变异，首先应确保实验所用小鼠性别和年龄一致，以保证其对病毒的反应能力相似。每只小鼠接种的病毒滴度保持一致也至关重要21</s...

近十年来，大量研究聚焦于新发现的CD4+ T细胞亚群——Tfh细胞亚群，因其在生发中心（GC）B细胞发育中发挥关键作用。B细胞淋巴瘤6（Bcl6）主要被视为一种基因抑制因子，是Tfh细胞谱系决定的关键因子，证据表明Bcl6的异位表达足以驱动Tfh细胞分化，而Bcl6缺失则导致Tfh细胞分化消失1,2,3。与其他通过迁移至炎症部位发挥效应功能的CD4+辅助性T细胞亚群不同，Tfh细胞主要在脾脏和淋巴结的B细胞滤泡区为B细胞提供辅助作用。共刺激分子ICOS和CD40L在Tfh细胞与生发中心B细胞的相互作用中发挥重要作用。在Tfh细胞分化过程中，ICOS传递来自同源B细胞的必要信号，同时也作为受体接收旁观者B细胞的迁移信号，从而介导Tfh细胞定位于B细胞区4,5。CD40L是Tfh细胞向B细胞传递增殖和存活信号的重要介质6。另一种功能类似于CD40L的因子是细胞因子IL21，主要由Tfh细胞分泌。IL21直接调控生发中心B细胞的发育及高亲和力抗体的产生，但其在Tfh细胞分化中的作用仍存在争议7,8。PD-1和CXCR5目前是流式细胞术分析中鉴定Tfh细胞最常用的标志物，同时也在该细胞亚群的分化与功能中发挥重要作用。CXCR5是B细胞滤泡趋化因子的受体，介导Tfh细胞向B细胞滤泡的定位9。PD-1目前被发现不仅具有引导滤泡定位的功能，还在生发中心B细胞亲和力成熟过程中传递关键信号10。基于上述发现，检测这些分子的表达水平基本可以反映Tfh细胞的成熟状态及其功能。
生发中心（GC）是继发性淋巴器官中一种由Tfh细胞诱导形成的短暂性微解剖结构，因此是评估Tfh细胞应答的理想指标。在生发中心内，B细胞在接受由细胞因子和共刺激分子介导的信号刺激后，会发生类别转换和体细胞高频突变，从而产生高亲和力抗体11。不同细胞因子微环境诱导不同的抗体类别转换，其中IL-4和IL-21促进IgG1类别的转换，而IFNγ则诱导IgG2类别的转换12。浆细胞是分泌型抗体的产生细胞，属于终末分化的细胞类型。与Tfh细胞类似，B细胞在生发中心中的发育过程伴随着多种重要分子的动态表达变化。根据现有研究，生发中心B细胞可通过B220+PNA+Fas+或B220+GL7+Fas+表型进行鉴定；与前体细胞相比，浆细胞下调B220的表达，并上调CD138的表达13。此外，上述特征均可通过流式细胞术和免疫荧光分析进行检测，因此适用于对生发中心应答的评估。
流感病毒感染可诱导强烈的细胞和体液免疫应答，其中滤泡辅助性T细胞（Tfh）和Th1细胞在CD4+ T细胞应答中占主导地位14，这使得该模型成为研究Tfh细胞分化的理想体系。甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）是一种常用的小鼠适应株，常被用于此类研究14,15,16。本文描述了在流感病毒感染背景下与Tfh细胞研究相关的一些基本实验方法：1）PR8病毒的鼻内接种；2）利用流式细胞术检测抗原特异性Tfh细胞、生发中心B细胞（GC B）、浆细胞及IL-21的表达；3）生发中心的组织学可视化观察；4）通过ELISA检测血清中抗原特异性抗体滴度。这些实验方案为从事Tfh相关研究的新进科研人员提供了必要的技术基础。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tfh细胞、NP特异性Tfh细胞及Bcl-6的免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD16/32抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的IAbNP311-325 MHC II类四聚体</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>克隆号: 7D1</td></tr><tr><td>生物素标记的CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>克隆号: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>克隆号: GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>克隆号: IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>克隆号: IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>克隆号: MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>克隆号: 7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>克隆号: 29F.1A12</td></tr><tr><td>链霉亲和素 BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;IL21的胞内染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>抗人IgG抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>人Fcγ IL-21受体</td><td>R&amp;D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活死细胞染色试剂盒（Aqua）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生发中心B细胞和浆细胞染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>克隆号: RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>克隆号: 281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>克隆号: Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>克隆号: 11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;采用ELISA检测HA特异性抗体滴度&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠Ig（SBA克隆分型系统-HRP）</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠IgM（SBA克隆分型系统-HRP）</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠IgG1（SBA克隆分型系统-HRP）</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠IgG2b（SBA克隆分型系统-HRP）</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠IgG2c（SBA克隆分型系统-HRP）</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB底物试剂盒</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555标记的羊抗大鼠IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgD抗体</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>生物素化PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>稀释的Alexa Fluor 488标记的链霉亲和素</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性t细胞与生发中心反应的评估

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是一类独立的CD4+&#160;T细胞亚群，其主要功能是促进生发中心（GC）的形成以及高亲和力抗体的产生。在流感病毒感染过程中，会诱导产生强烈的Tfh细胞和GC B细胞应答，从而有效清除病毒，因此该模型为研究Tfh细胞相关功能提供了理想的实验小鼠模型。本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中检测Tfh细胞相关基础免疫应答的实验方案，包括：流感病毒的经鼻接种；多克隆及抗原特异性Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的流式细胞术染色与分析；生发中心的免疫荧光检测；血清中流感病毒特异性抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。这些检测方法可基本量化流感病毒感染中Tfh细胞的分化状态与功能，从而为深入研究Tfh细胞的分化机制及调控策略提供技术支持。

流感病毒感染中鼠类发病特征的表征 
流感病毒感染后，小鼠因患病而活动减少且食欲减退，表现为明显的体重下降，这是监测小鼠发病情况的常用指标19如图所示 图1aPR8病毒感染的小鼠从第6天开始体重下降，第8天达到最低水平，第10天恢复至初始水平。正如预期，PBS处理的对照组小鼠在整个观察期间未出现体重下降。在体内症状方面，病毒感染可导致引流淋巴结（本实验中为mLN）中淋巴细胞显著扩增。因此，与对照组小鼠相比，PR8病毒感染小鼠的mLN体积显著增大（图 1b综上所述，这些小鼠均表现出预期的症状，符合后续Tfh相关免疫反应研究的条件。
Tfh 细胞分化及功能相关分子的检测 
为分析Tfh细胞分化，分别在感染后第5、7、10和14天...

本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和生发中心B细胞反应的实验方案。

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估

滤泡辅助性T（Tfh）细胞是一类独立的CD4+ T细胞亚群，专门负责为生发中心（GC）的发育提供辅助作用……

T滤泡辅助细胞是一类新近发现的CD4 T细胞亚群，可为B细胞产生高亲和力抗体提供帮助。通过展示在流感病毒感染中鉴定Tfh细胞的方法，有助于新研究人员掌握开展Tfh相关研究所需的实验技术。由于病毒滴度过高可能导致动物死亡，过低则可能引起免疫反应过弱，因此我们建议在开展实验前先确定合适的病毒滴度。对于8周龄雄性C57黑6小鼠接种PR8病毒。在生物安全二级条件下，将保存于负80摄氏度的PR8病毒原液置于冰上融化。涡旋振荡病毒液以获得均一溶液。将病毒在预冷的1.5毫升离心管中用PBS稀释至每微升含两个平台单位，并确认麻醉动物对捏压无反应。再次涡旋混匀病毒。用20微升移液枪头吸取10微升病毒液。将病毒液滴小心地接种至最多三只已麻醉动物的一侧鼻孔，随后在另一侧重复接种操作。然后将所有小鼠置于温暖的笼子中，保持胸卧位，并进行监测直至完全恢复，每天称重一次，持续10天。实验结束时，将小鼠放入生物安全二级水平的层流罩内，并将第一只动物固定在覆盖有吸水纸的泡沫解剖板上。使用解剖剪沿腹部中线剪开皮肤，用镊子拉伸皮肤，并用大头针将皮肤固定在解剖板上。切开腹膜以取出脾脏，并将脾脏放入含有5毫升DMEM（添加1% FBS）的6厘米培养皿中的70微米滤膜上。剪开膈肌和肋骨直至胸腺，将肋骨向两侧固定，以暴露胸腔。移动肺和心脏，以找到位于气管腹侧附近的纵隔淋巴结。然后，将淋巴结放入第二个含有5毫升培养基的6厘米培养皿中的独立滤网内，并使用3毫升注射器的推杆轻轻将两种组织分别通过各自滤网的网孔研磨。用1毫升新鲜DMEM加FBS冲洗每个滤网，并将细胞悬液分别转移至15毫升离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀物充分重悬于每管1毫升新鲜DMEM加FBS中。然后向脾细胞悬液中再加入4毫升培养基，并将两管均置于冰上。为检测CXCR5表达，将管颠倒数次以混匀，并将每份样品中的2 × 10⁶个细胞分装至各自的FACS管中。向每管中加入 2 毫升染色缓冲液，通过涡旋混合细胞。离心沉淀细胞后弃去上清液。将每管轻轻在吸水纸上轻敲两次，并轻轻弹击管底两次，使细胞在残留的上清液中重悬。每管加入 0.2 µL Fc 受体阻断剂以封闭非特异性结合，轻轻弹击管壁混匀，然后将各管置于冰上孵育 10 分钟。孵育结束后，每管加入 0.3 µL 生物素标记的抗小鼠 CXCR5 抗体，通过轻轻弹击管壁混匀。将各管置于冰上孵育 1 小时，在 30 分钟时再次轻轻弹击混匀。孵育结束后，向各管中加入 2 毫升染色缓冲液，涡旋混匀，然后通过离心沉降细胞。弃去上清液，轻弹管底以将细胞重悬于残留的缓冲液中。随后将管置于冰上，按照上表中刚刚演示的方法，使用针对目标表面标志物的抗体对细胞进行标记。孵育结束后，用 2 毫升染色缓冲液洗涤细胞，并将每份细胞沉淀重悬于 400 微升新鲜染色缓冲液中，用于流式细胞术分析。PR8 病毒感染的小鼠从第 6 天开始出现体重下降，第 8 天达到最低值，第 10 天恢复至初始体重水平。与预期一致，PBS 处理的对照小鼠未出现体重下降。病毒感染还会导致引流淋巴结内淋巴细胞显著扩增。流式细胞分析结果显示，滤泡辅助性T细胞的分化在感染后第5天开始，并在第10天达到高峰，与对照组动物相比，感染流感病毒的小鼠体内诱导出大量滤泡辅助性T细胞。此外，在纵隔淋巴结和脾脏中，与对照组小鼠相比，PR8病毒感染小鼠体内流感抗原特异性的CD4阳性T细胞数量显著增加，且PD-1阳性CXCR5阳性细胞群体也增多。此外，细胞内IL-21染色显示，PR8感染在病毒攻击后可显著诱导该细胞因子的产生。免疫荧光染色表明，PR8感染小鼠体内出现了诱导性生发中心反应，ELISA证实病毒感染动物体内产生了流感病毒特异性抗体。CXCR5染色必须在冰上进行一小时，因为染色效果会受到染色温度和时间的影响。尽管我们展示了CXCR5和IL-21染色，但该方法还可用于评估其他表面标志物、转录因子和细胞因子，从而提供大量有关Tfh细胞分化和功能的信息。

evaluation-t-follicular-helper-cells-germinal-center-response-during

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠感染甲型流感病毒期间T卵泡帮助细胞和胚芽中心反应的评价

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

来源：Wang, M., 等，小鼠流感病毒A感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估。 J. Vis. Exp.

小鼠鼻腔感染致病性流感病毒

两种基于流式细胞术的方法 – 一种 体外...

体外分析Myd88介导的细胞免疫应答对西尼罗病毒突变株感染的反应

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。...

在嵌合小鼠模型中通过鼻内给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。...

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。...

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

本文描述了一种用于评估Zika病毒（ZIKV）感染的Ifnar1-/-小鼠模型中免疫豁免器官内抗原特异性T细胞反应的实验方案。该方法对于研究ZIKV疫苗的细胞保护机制和免疫病理发生机制至关重要，同时也可用于评估疫苗的有效性。...

评估感染寨卡病毒的Ifnar1-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

本研究中，我们介绍了一种在流感病毒感染后对小鼠气管黏膜进行双光子活体成像及细胞相互作用分析的实验方案。该方案对于研究呼吸道感染过程中免疫细胞动态变化的研究人员具有重要意义。...

利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用

本文描述了一种新型小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型可轻松适用于研究疾病进展不同阶段以及多种宿主中多微生物与宿主-病原体之间的相互作用。...

小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

本研究展示了评估病毒特异性TFH细胞早期命运决定的方案，以及对这些细胞中基因表达进行操控的方法。...

获取急性 LCMV 感染小鼠中病毒特异性滤泡辅助性 CD4+ T 细胞早期分化的研究方法

本方案提供了流感病毒（IAV）鼻内接种小鼠以及对小鼠肺组织损伤和肺细胞类型相关转录变化进行后续分析的操作说明。...

模拟流感感染后肺泡的发育异常与功能性修复

了解甲型流感病毒感染小鼠模型中T卵泡帮助细胞和胚芽中心B细胞反应的评估方法。本研究使用C57BL/6小鼠和PR8病毒，为免疫学研究提供关键实验方案。

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估

探索更多视频