透射电镜的小型化样品制备方法

该方法可以帮助回答结构生物学领域的关键问题，例如敏感蛋白质的制备，其中可用的蛋白质量有限。该技术的主要优点是，与标准样品制备方法相比，只需要微量的样品，并且不涉及苛刻的纸张印迹步骤。该技术的意义延伸到通过视觉蛋白质组学进行的单细胞分析或蛋白质相关疾病的诊断。

当我们拥有解决仅约 100， 000 个单个颗粒的高分辨率结构的技术时，我们第一次想到了这种方法。首先，按照随附的文本协议中的说明准备样品。接下来，组装乙烷杯、冷冻盒支架和蜘蛛网。

并将制冷剂容器装满液氮。几分钟后，杯子会冷却并且不含液氮。然后打开乙烷气瓶，慢慢让气体流入乙烷杯中。

让杯子装满液态乙烷，直到液位低于顶部 2 到 3 毫米。这将需要几分钟，大约需要 5 毫升液态乙烷。取下蜘蛛，将聚苯乙烯盖放在顶部，然后将制冷剂容器放在冷冻写入器的支架上。

用冷冻写入器镊子抓住辉光放电的 EM 网格，将镊子打结在电磁铁上，然后拧紧显微作器，使网格平放在载物台上，碳膜面朝上。返回软件，双击 grid_save。然后调整微毛细管位置，使尖端位于网格表面上方约 10 微米处。

确保微毛细管可以在网格上自由移动，而不会接触到任何地方。如有必要，将微毛细管撤回几微米。然后将其调整回网格中心的位置，并将新位置保存为网格。

将微毛细管移回初始位置。接下来，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管，并使用无绒纸巾去除微毛细管上的任何液滴。现在一切都准备好了，启动宏脚本。

宏压管首先移动到位，分配 5 ng 系统液体以去除吸头处的任何气泡，然后移动到样品位置。接下来，它吸出 65 纳升样品，然后将 5 纳升样品注入样品管中。这解释了系统反冲，并允许同步写入。

移动到网格位置后，它启动写入模式，这将导致微毛细管穿过网格并同时分配 45 纳升样品。然后，它将微毛细管移回网格中心，将其再降低 10 微米，并吸出多余的样品液体。最后，宏观提取微毛细管并关闭电磁铁，从而启动跳入冻结机制。

从磁体上松开后，小心地从柱塞上松开磁性适配器，然后快速将载网从乙烷杯转移到装有冷冻盒的制冷剂容器中，将载极放入自由插槽中。首先，按照随附文本方案中的说明准备细胞，并将氧化铟锡载玻片安装在显微镜插件上。使用两个螺钉将滑轨固定在铝嵌件上，并确保滑轨的氧化铟锡涂层与电接地的铝框架之间的电接触。

然后从孔中取出细胞培养基，并用 300 μL 电穿孔缓冲液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞保存在电穿孔缓冲液中。接下来，将固定氧化铟锡载玻片的铝插件放在活细胞培养台的设置上。

使用显微镜，找到细胞培养物并选择没有细胞的区域。接近载玻片表面的微毛细管尖端并轻轻触摸它。然后将尖端抽出 100 微米，并将位置保存为单元格。

现在快速离开细胞培养物，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管尖端，然后再次将其放入细胞培养物中。在浸入 PDMS 期间，将几纳升分液充分，以确保尖端没有气泡。双击样品池的位置，轻轻接近氧化铟锡玻片的表面，接触后，将尖端缩回 10 微米。

此时，选择附近的细胞进行裂解。并将微毛细管的尖端放在目标细胞上方。然后启动用于单细胞裂解的宏脚本。

一旦启动，该脚本将询问在细胞成功裂解后应将微毛细管移动到的位置。为 EM 网格输入所需的位置，例如 grid。然后，宏观作将在没有用户干预的情况下进行，首先将细胞培养物中的显微镜载物台向左移动 100 微米，在那里拍摄目标细胞的快照。

然后从微毛细管中分配 15 纳升双蒸水，置换并稀释高盐缓冲液，对细胞施加渗透压。接下来，舞台向后移动，以再次将尖端定位在目标单元格上方。在那里，施加预定义的电压突发，500 毫秒后，泵系统开始以每分钟 2 微升的流速吸取 3 纳升样品。

最后，载物台再次向左移动，从而可以检查单元。此时将显示一个窗口，要求用户输入。如果细胞成功，输入 yes 以拍摄裂解细胞的快照。

之后，微毛细管移动到 endo 位置，浸没在储液槽液中。将微毛细管浸入水中 8 到 12 分钟，具体取决于喷嘴的几何形状。接下来，将 5 纳升条件细胞裂解物分配到网格上。

取出微毛细管，让调节后的样品在露点台上缓慢干燥。最后，从载物台上取下网格，并在室温下将其存放在网格盒中。此处显示的是采用所述 CryoWriter 设置的冷冻样品的典型冷冻图像。

在网格概览中，可以清楚地看到玻璃体冰的外围。在仔细检查带有含有玻璃体冰的孔碳膜的网格槽时，可以发现白孔，这表明并非所有孔都充满了样品缓冲液。在其中一个含有碳孔的样品中，可以清楚地看到噬菌体的尾部细节。

使用用于执行单细胞视觉蛋白质组学的 CryoWriter 设置，可以看到单个蛋白质等内容，例如丝状肌动蛋白和带有附着蛋白质的膜贴片。您在图 6b 中看到的图像是用 2% 负染色剂（基于有机钨化合物）进行负染的。图 c 显示了为冷冻电镜制备的单细胞裂解物。观看此视频后，您应该对如何从纳升总体积的蛋白质样品或单细胞提取物制备负染剂或冷冻电镜网格有很好的了解。

不要忘记，使用液态乙烷和氮气可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴安全眼镜和穿实验服。