Name: 透射电镜的小型化样品制备方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习透射电镜的小型化样品制备方法，无需滤纸吸干步骤即可处理纳升级样本，实现单细胞裂解物的视觉蛋白质组学分析。该技术显著减少样品损失，适用于敏感蛋白质的高分辨率结构研究。

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作者感谢巴塞尔大学生物中心车间提供的支持，S. A. Müller 提出的宝贵讨论意见并仔细审阅了手稿，A. Fecteau-LeFebvre 在电镜技术方面的协助，以及 Ricardo Adaixo 和 Frank Lehmann（均来自巴塞尔大学生物中心C-CINA）提供的膜蛋白测试样品，同时感谢巴塞尔大学荣休教授 A. Engel 富有启发性的交流。测试样品由 P. Ringler、M.-A. Mahi 和 T. Schwede（巴塞尔大学生物中心）、P. Leiman（洛桑联邦理工学院结构生物学与生物物理学实验室）以及 R. Diaz-Avalos（美国纽约结构生物学中心）慷慨提供。本项目得到了瑞士纳米科学研究所（SNI，项目编号 P1401，ARGOVIA 项目 MiPIS）和瑞士国家科学基金会（SNF，项目编号 200021_162521）的资助。

后续方案需要使用&#34;cryoWriter&#34;（图2；详细信息见之前的研究24,26,27）或同等功能的仪器。主要部件和耗材的供应商列表见材料表。
1. 负染（NS）载网制备
<ol>
	<li>打开仪器并启动软件。初始化所有必要的模块（注射泵控制器、电机化载物台、监控摄像头和露点载物台）。</li>
	<li>冷却样品台和露点台。如有需要，确保露点台温度调节至高于露点温度1–2 °C。 
	&#8203;注意：载物台由带有 PID 控制器的商用帕尔帖装置冷却。</li>
	<li>用100–150 µL的NS填充一个100或200 µL的PCR管，以制备NS（生理盐水）例如，市售的2%甲胺钨酸盐）。将试管置于仪器的冷却样品支架上。</li>
	<li>放置样品。
	<ol>
		<li>将样品（0.5 – 1 µM）加入100或200 µL的PCR管中。若样品体积少于50 µL，可用剃刀片切去PCR管底部，将其用作样品孔，以确保微毛细管能够轻松接触到样品。 
		&#8203;注意：从 100 或 200 µL PCR 管中吸取样品最为方便，因为后续用于吸取样品的微毛细管呈轻微倾斜状态，且其在 z 轴方向上的移动高度受限。</li>
		<li>将PCR管/容器置于仪器的冷却样品台上，以防止蒸发。或者，也可在室温下从显微镜载物台顶部培养箱中的孔板中吸取样品；孔板不进行冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义位置。使用控制电动化XY载物台的cryoWriter操纵杆以及用于线性X、Y和Z轴载物台的软件控制按钮来定位微毛细管。通过摄像头检查毛细管的位置。
	<ol>
		<li>将微毛细管移至样品储液池，将管尖浸入样品液体中，并保存此位置为 &#34;样本&#34;.</li>
		<li>将微毛细管移至NS PCR管，将管尖浸入NS溶液中，并将此位置保存为 &#34;染色&#34;.</li>
		<li>将微毛细管置于电子显微镜载网将要放置的槽中心上方约100 µm处，并将此位置保存为 &#34;网格保存&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸弃样品并进行负染电镜（NS-EM）前处理。
	<ol>
		<li>若尚未安装，将一支10-µL注射器（内径0.46 mm）安装至精密注射泵上。</li>
		<li>将一根30 cm长的熔融石英毛细管（外径360 µm，内径150 µm）的一端粘接到注射器出口。</li>
		<li>将微毛细管的另一端通过压合连接器连接至一段短（5 cm）锥形微毛细管。该短锥形微毛细管的锥形末端构成 dispensing tip（ dispensing tip 指分液尖端）。</li>
		<li>用脱气的双蒸水（ddH₂O）填充注射器2O；系统液体）并避免产生气泡。</li>
		<li>分配数十纳升的系统液体，并用无绒布擦去微毛细管上的液滴。</li>
		<li>双击已保存的样品位置。这将使微毛细管定位在样品孔中。在毛细管移动过程中，于微毛细管尖端浸入样品前，先分三次、每次0.5 nL，释放系统液体，以防止气泡被困在其中（见下文注释2）。</li>
		<li>吸取 5 nL 样品。</li>
		<li>双击保存的NS位置。微毛细管将自动从样品容器中撤出并移至NS储液池。在毛细管移动过程中，于尖端浸入储液池前手动排出3次，每次0.5 nL的样品液体，以确保无气泡产生（见下文注释2）。 
		注意： 重要提示： (1) 从吸液模式切换至排液模式或反向切换时，由于注射泵齿轮存在齿隙，活塞行程会有微小损失。根据制造商提供的数据，新设备的齿隙范围为7至12 µm。对于筒径为0.46 mm的注射器，这相当于1–2 nL。因此，1–2 nL可能会 &#34;分配&#34;在实际分配样品之前。通常，在第三次0.5 nL分配步骤后，微毛细管尖端开始有微小液滴析出。（2）样品上方或下方 trapped 的气泡会降低分配的准确性，并阻碍样品通过扩散进行预平衡。</li>
		<li>根据样品缓冲液和喷嘴几何形状，将微毛细管浸入3-12分钟。 
		&#8203;注意：缓冲液中盐浓度和/或磷酸盐浓度越高，所需的浸润时间越长。纳米金溶液（NS）相对较快地扩散进入样品塞，而缓冲盐（相对较快）和蛋白质（慢得多）则向外扩散。这会降低样品中缓冲盐的浓度，防止载网干燥时盐结晶。此外，磷酸盐容易与NS形成沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备载网并滴加一滴处理后的样品。
	<ol>
		<li>在样品处理的同时，取一段胶带和一块PDMS块，通过反复粘贴和撕下胶带清洁PDMS的上表面，以确保无灰尘残留。将PDMS块放入培养皿中。 
		注意：新的PDMS块取自洁净室。</li>
		<li>小心拿起载网（例如，铜网，200 或 400 目，镀有 Parlodion/C 膜）。务必仅用镊子接触铜网边缘。将其放置于洁净的 PDMS 块上，碳膜面朝上。</li>
		<li>将带有网格的PDMS块放入空气辉光放电仪中，在0.4 mbar气压下以100 W功率进行20秒辉光放电处理。将网格存放于密闭的培养皿中。较长的辉光放电时间通常会导致样品液滴在网格上铺展面积增大，从而形成更薄的染色层（染色较弱）。</li>
		<li>在浸入时间到达前1分钟，用冷冻书写仪镊子夹住经辉光放电处理的载网。确保电磁铁已开启；若未开启，需在软件中将其打开。将镊子安装到电磁铁上，并使用手动显微操作螺钉将载网平整地放置于露点台表面，碳膜面朝上。确保露点台温度控制在露点以上1–2 °C，以降低样品加载后的蒸发速率。</li>
		<li>当浸入时间结束时，双击 &#34;网格保存&#34;微毛细管尖端将安全地置于网格表面之上。手动将微毛细管尖端与网格接触，随后将喷嘴抬升10 µm，并定位至中心上方。 
		注意： 一些含有去污剂的样品在液体分配时，由于表面张力较低，容易沿微毛细管外表面向上移动。因此，操作时必须尽量靠近网格表面，以防止此类样品损失。</li>
		<li>将5 nL样品滴加到载网上。在干燥天气下，当微毛细管尖端发生快速蒸发时，可先缓慢滴加至样品到达管尖末端，然后迅速滴加5 nL。</li>
		<li>撤出微量毛细管，让处理后的样品在露点台（DP台）上缓慢干燥。</li>
		<li>样品点干燥后，取下铜网，置于铜网盒或培养皿中，室温保存。</li>
		<li>从微毛细管中排出500 nL系统液体，并用无尘纸巾擦除。用乙醇、洗涤剂或1 M NaOH冲洗毛细管5次。此步骤可清洁微毛细管，使其可用于不同样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 冷冻电镜载网制备
<ol>
	<li>准备仪器和样品，请按照上述步骤1.1至1.5进行操作。若无需使用NS，则省略步骤1.3和1.5.2。如需通过透析更换样品缓冲液或为冷冻电镜分析制备样品， 例如，以降低缓冲盐的浓度或引入添加剂（例如，海藻糖，去垢剂）在步骤1.3和1.5.2中使用所需的缓冲液代替NS。</li>
	<li>在标准低温容器中制备液态乙烷。
	<ol>
		<li>组装乙烷杯、冷冻盒架和蜘蛛架，并将液氮加至冷源容器口，通常需要约 200 mL。静置数分钟，直至乙烷杯冷却且无残留液氮。</li>
		<li>打开乙烷气瓶，缓慢将气体通入乙烷杯中。待液态乙烷充满至液面距杯顶2-3 mm处即可，约需数分钟，所需液态乙烷体积约为5 mL。</li>
		<li>取一个冻存盒，放入液氮罐中的空位中。</li>
		<li>移除蜘蛛，将聚苯乙烯盖子盖上，然后将冷冻剂容器放置在cryoWriter的支架上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对电镜载网进行辉光放电处理。
	<ol>
		<li>取一段胶带和一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）块，用胶带反复按压PDMS块的上表面并撕下，以清除表面灰尘。将PDMS块放入培养皿中。</li>
		<li>小心地从网格盒中取出一个载网，确保仅用镊子接触载网边缘。将其放置在干净的PDMS块上，使有孔碳膜的一面朝上。</li>
		<li>将带有网格的PDMS块放入等离子清洗仪中，对网格表面进行等离子清洗（例如 使用75% Ar/25% H2, 功率50 W，压力25 mTorr。将带有辉光放电处理网格的PDMS块放入培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将网格放置在仪器中
	<ol>
		<li>用冷冻书写仪镊子夹住经辉光放电处理的载网。确保电磁铁已开启；若未开启，请在软件中打开。将镊子安装到电磁铁上，并使用手动显微操作螺钉调节，使载网平整地置于载物台上，碳膜面朝上。</li>
		<li>双击 &#34;grid_save&#34;调节微毛细管的位置，使其尖端位于网格表面约10 µm上方。确保微毛细管可在网格上方自由移动而不会接触网格任何部位；如有必要，可将微毛细管回撤数微米。</li>
		<li>返回网格中心并将新位置保存为 &#34;网格&#34;. 
		警告： 正确的命名是宏脚本正常运行的必要条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加样并投入液态乙烷中冷冻网格
	<ol>
		<li>用几十纳升的系统液体冲洗毛细管，并用无绒纸巾去除毛细管末端的液滴。</li>
		<li>启动宏脚本。该宏将执行以下步骤：
		<ol>
			<li>分配5 nL（以去除尖端处的任何气泡），然后移至样品位置。</li>
			<li>吸取 65 nL 样品。将 5 nL 回注至样品管中。此举可补偿系统回程误差，并实现同步写入。 即以确保分配和载物台移动同时开始。</li>
			<li>移动至 &#34;网格&#34; 位置</li>
			<li>启动“写入模式”，使微毛细管在网格上移动，同时分配45 nL样品。</li>
			<li>随后，将微毛细管移回网格中心，再下降10 µm，并吸除多余的样品液体。</li>
			<li>撤出微毛细管并关闭电磁铁。这将释放镊子并启动 plunge 冷冻。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子夹住，小心地将磁性适配器从柱塞上松开。迅速将载网从乙烷杯转移至装有冷冻盒的低温容器中，并将载网放入一个空置的卡槽内。</li>
</ol>
3. 单细胞裂解液制备
<ol>
	<li>准备用于电穿孔的微型毛细管。 
	&#8203;注意：拉制并检验后的锥形石英玻璃微毛细管外表面有聚酰亚胺保护涂层，但尖端除外，该处在拉锥过程中涂层已被烧除。
	<ol>
		<li>将微毛细管以45°角安装在金属支架上，管尖朝上，以在其表面镀上导电层。用铝箔遮蔽管尖末端2 cm部分，因未镀层的聚酰亚胺可与后续使用的压接连接器形成最佳密封。</li>
		<li>溅射沉积一层20 nm厚的Ti/W粘附层，然后沉积一层200 nm厚的Pt层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使微毛细管尖端具有疏水性。
	<ol>
		<li>配制1 M的1-十二硫醇EtOH溶液。</li>
		<li>在0.4 mbar气压下，以100 W功率在空气中对微毛细管进行1分钟的辉光放电处理。</li>
		<li>将微毛细管尖端浸入1 M的1-十二硫醇溶液中数小时（理想情况下为过夜）。 
		&#8203;注意：最好在使用前一天新鲜制备探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装一根新的微毛细管。
	<ol>
		<li>将微毛细管从1-十二硫醇溶液中取出，用乙醇冲洗外壁，并用注射器将乙醇注入管内进行冲洗。 
		注意：若无可用的功能化微毛细管，可快速对微毛细管尖端进行辉光放电处理，随后将其浸入一滴商用汽车玻璃涂层剂中（该涂层剂为聚二甲基硅氧烷与硫酸的混合物）。由此获得的疏水功能化效果虽不及1-十二烷硫醇处理，但通常已足够使用。</li>
		<li>用毛细管切割器切割其未包被的一端。 
		注意：使用压合式连接器时，干净的切口对于实现良好的密封至关重要。</li>
		<li>使用牙签将银浆涂抹在毛细管拉制过程中激光烧蚀去除聚酰亚胺涂层后形成的玻璃与聚酰亚胺交界处的锐利边缘上。 
		&#8203;注意：此区域的铂涂层非常薄弱，容易导致电导中断，因此必须进行加固。</li>
		<li>用丙酮清洗微毛细管的聚酰亚胺端。在末端留下少量丙酮液滴，将其插入压合式连接器的孔中。施加轻柔压力以形成良好的密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准微毛细管位置。
	<ol>
		<li>打开仪器并按照步骤1.1所述启动软件。此外，初始化显微镜相机和函数发生器。</li>
		<li>将玻璃显微镜载玻片放入显微镜的载物片夹中。</li>
		<li>将微毛细管缓慢降至载玻片附近，并使其位于显微镜物镜正上方，直至在显微镜相机视野中可见。利用x轴和y轴线性载物台，将微毛细管尖端调整至图像中心。然后缓慢降低尖端，直至其轻微接触载玻片表面。 
		警告： 向最终接近阶段移动时，应选择非常小的步长（5 µm）。否则，探针尖端可能受损。</li>
		<li>按压 &#34;校准喷嘴&#34; 按钮。这将使微毛细管回缩40 mm，并将此位置设为初始位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>stamped PDMS 片段和 ITO 载玻片的制备
	<ol>
		<li>将PDMS与交联剂按10:1的比例混合，倒入大培养皿中，厚度约为2-3 mm。在杂交孵育箱或类似装置中于60°C烘烤数小时。</li>
		<li>使用锤子和冲头（直径12 mm）在PDMS层上打孔。随后，用手术刀切割出包含孔洞的2 cm长方形或正方形，以获得可贴合显微镜载玻片的冲压片。通常，将两个冲压片固定在同一张显微镜载玻片上。</li>
		<li>先用洗涤剂清洗PDMS片和ITO载玻片，然后用70%乙醇冲洗。将它们保持湿润状态放入培养皿中，并置于60°C烘箱内，使乙醇完全蒸发。</li>
		<li>用 100 W 功率在 0.4 mbar 条件下对 ITO 载玻片进行 1 分钟辉光放电处理，然后加入 1 mL 涂膜溶液（例如，聚-L-赖氨酸（PLL）。孵育5分钟，用移液器吸除溶液，加入1 mL ddH₂O2O. 轻微振荡1分钟，然后移除ddH₂O2用移液器吸取 O。将载玻片在 60°C 下干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备细胞培养。遵循标准的贴壁细胞培养方案（例如阿诺德, 等24,25在常规传代/分步培养过程中，将种子细胞接种于ITO上。
	<ol>
		<li>取一块新近经PLL包被的ITO载玻片，放置一块PDMS材料，施加适当压力以形成防水密封，从而在载玻片表面形成以载玻片为底部的小型微孔。</li>
		<li>向PDMS孔中加入约300 µL用新鲜培养基悬浮的细胞，接种密度约为每孔75,000个细胞。</li>
		<li>将ITO载玻片在标准条件下孵育1-2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备细胞裂解实验：
	<ol>
		<li>预热几毫升电穿孔缓冲液（例如磷酸盐缓冲液（PBS）</li>
		<li>准备用于负染透射电镜网格的制备装置 
		&#8203;注意：有关设备准备的详细步骤，请参见1.1-1.5（用于负染，NS）或2.1-2.4（用于冷冻，cryo）。此处我们描述NS制备过程中最重要的步骤。
		<ol>
			<li>用100–150 µL的NS填充一个100或200 µL的PCR管，以制备NS（生理盐水）例如，市售的2%甲胺钨酸盐）。将试管置于仪器的冷却样品支架上。</li>
			<li>将微毛细管移至NS PCR管，将管尖浸入NS溶液中，并将此位置保存为 &#34;染色&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加载标准裂解参数， 例如裂解电压。</li>
		<li>从培养箱中取出ITO载玻片，并将其安装到显微镜插件上。使用两颗螺丝将载玻片固定在铝制插件上，确保载玻片的ITO涂层与接地的铝制框架之间形成良好的电接触。</li>
		<li>移除细胞培养基，用 300 µL 电穿孔缓冲液洗涤两次。将细胞保留在电穿孔缓冲液中。</li>
		<li>将装有ITO载玻片的铝制插件放置在装置的活细胞培养箱载物台上。</li>
		<li>在显微镜视野中定位细胞培养区域，选择一个无细胞的区域。将探针接近ITO表面并轻轻接触，随后将探针回撤100 µm，并保存该位置为 &#34;细胞&#34;.</li>
		<li>迅速离开细胞培养环境，用数十纳升的系统液体冲洗微毛细管尖端，然后再次将其放入细胞培养环境中。浸入PDMS微孔时，释放数纳升液体，以确保尖端无气泡滞留。</li>
		<li>轻轻接近ITO表面（最初，你必须位于位置 &#34;细胞&#34;, 即，距表面100 µm处）。接触后，将针尖回撤10 µm。</li>
		<li>选择一个邻近的细胞进行裂解。将微毛细管的尖端置于目标细胞上方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动单细胞裂解的宏脚本。
	<ol>
		<li>将微毛细管移至细胞成功裂解后应放置的位置命名。该位置为NS储液池（NS-EM）、脱盐缓冲液（cryo-EM）或EM载网（cryo-EM）。避免拼写错误并按下 &#34;好的&#34;.</li>
		<li>该宏在无需用户干预的情况下继续执行：
		<ol>
			<li>i) 将显微镜载物台和细胞培养皿向左移动100 µm，拍摄目标细胞的图像，并注入50 nL的ddH₂O2微毛细管释放出O系统液体，从而置换并稀释高盐缓冲液，同时对细胞施加渗透压。</li>
			<li>ii) 将载物台移回，再次将探针尖端定位在目标细胞上方。施加预定义的电压脉冲，500 ms后泵系统开始以2 µL/min的流速吸取3 nL样品。</li>
			<li>iii) 将载物台再次向左移动，以便观察细胞。此时会出现一个窗口，提示用户输入信息。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>说明裂解步骤是否成功。
		<ol>
			<li>如果答案为否，则接管操作，冲洗微毛细管，并重新定位新的细胞。</li>
			<li>如果答案为“是”，则拍摄被移除（裂解）细胞的快照，随后将微毛细管移至步骤 3.8.1 中指定的位置。如果该位置为 NS 或缓冲液储液池，则在微毛细管移动过程中，使用标准用户界面释放 3 次、每次 0.5 nL 的液体，以确保无气泡产生。微毛细管尖端由宏程序浸入储液池液体中。 
			注意：您可以继续按照1.6.9–1.7.9节所述步骤对样本进行处理并制备网格，用于负染电镜（NS-EM）；或按照2.2–2.6节所述步骤进行冷冻电镜（cryo-EM）的网格制备。以下将说明NS网格制备所需的步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据喷嘴几何形状，将微毛细管浸入8-12分钟 
		注意：缓冲液中的高磷酸盐浓度需要更长的浸泡时间进行平衡。</li>
		<li>将5 nL的条件处理细胞裂解液滴加到载网上。</li>
		<li>撤回微量毛细管，使处理后的样品在露点台（DP台）上缓慢干燥，DP台温度控制在露点温度以上1–2°C。</li>
		<li>移除网格，并将其在室温下存放于网格盒或培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者Stefan A. Arnold、Henning Stahlberg和Thomas Braun声明存在以下竞争性财务利益：cryoWriter概念属于专利申请PCT/EP2015/065398和EP16194230的一部分。

本文介绍了“cryoWriter”仪器及其所需的操作流程，该流程可用于从纳升级总样本体积制备负染透射电镜（NS-EM）和冷冻电镜（cryo-EM）样品载网，并完全避免传统滤纸 blotting 步骤。cryoWriter 通过结合微流控原理与微机械系统，实现了这一技术突破。
我们的经验表明，使用本文介绍的微型化方法时，电镜载网制备的参数空间比传统方法更宽广，且更易于用户控制。尤为重要的是，由此实现的更高重复性使得在正式实验前，可先利用样品缓冲体系并结合一种易得的测试蛋白进行预筛选，以确定最佳实验参数。这种方法可将目标样品的消耗量降至最低，强烈推荐使用。负染和冷冻电镜载网制备的关键步骤包括：（i）泵系统的预启动；在亚纳升级液体分配过程中，系统液体（水）必须经过脱气处理并确保无气泡。（ii）辉光放电或等离子清洗步骤的精确控制；电镜载网的表面特性对结果的可重复性至关重要。（iii）样品预处理；完成预处理所需的时间， 例如，其中NS取决于缓冲液类型、盐含量和浓度（图3），以及微毛细管喷嘴的几何形状24（iv）用于定量电镜分析的纳米颗粒-电镜（NS-EM）样品制备中的蒸发速率：咖啡环效应可能阻碍NS-EM样品的定量分析，必须通过DP载台控制缓慢的蒸发速率以抑制该效应。
所展示的载网制备方法的各个步骤可自由组合，从而为特定样品开发出多种多样的实验方案。典型的例子包括去除影响高分辨率电镜观察的物质， 例如，甘油，在冷冻电镜载网制备前通过预处理步骤引入；在载网制备前通过预处理引入介导分子（如配体）；或通过负染电镜或冷冻电镜检测单细胞裂解液图6).
采用微流控技术及微量样品的本方法完全避免了纸巾吸除步骤的需要。这是一个显著优势，因为纸巾吸除对蛋白质而言是一种较为剧烈的处理方式，可能引入不必要的离子污染，并不可避免地导致大量样品损失。然而，当使用cryoWriter制备冷冻电镜样品时，仍无法避免传统方法中因形成薄样品膜时所产生的气液界面所带来的潜在影响。通过cryoWriter可在样品施加与玻璃化之间实现小于0.2秒的等待时间（数据未显示）。尽管如此，由于蛋白质在数纳秒内即可通过扩散移动数十分之一纳米，因此在100 nm厚的样品膜中，它们仍有足够时间多次碰撞气液界面。然而，如此短暂的时间间隔可能显著减少吸附在气液界面上的蛋白质数量，从而有助于防止蛋白质变性或颗粒取向受限。另一种有望保护敏感蛋白质免受气液界面影响的方法是使用低分子量表面活性物质覆盖样品膜。这些化合物可在grid制备前通过cryoWriter中的预处理步骤快速引入。微流控系统较高的比表面积是cryoWriter的另一项局限性，因为样品可能因非特异性吸附至微毛细管表面而损失，进而干扰基于颗粒计数的定量分析。该问题通过两种方式加以解决：首先，样品在微毛细管内的传输距离很短；实际上，纳升级样品体积在整个处理过程中始终保留在毛细管尖端。其次，通过采用具有相对较大内径的微毛细管，进一步降低了比表面积。 例如，180 µm。第三，如有需要，微毛细管表面可轻松进行钝化处理， 例如，通过使用市售的聚赖氨酸乙二醇（PLL-PEG）进行处理。
利用电子显微镜中单颗粒方法对蛋白质进行高分辨率分析，仅需10万至数百万张单个蛋白质颗粒的图像。这意味着微流控技术能够提供足够的蛋白质复合物用于结构研究。此前已开发出一种微型化免疫沉淀方法，可从极少量细胞（约40,000个细胞）中快速分离蛋白质复合物（约1小时）28。该方法现将直接与cryoWriter的微型化样品制备阶段相连接。最终目标是建立一个集成化的微流控流程，实现超快速蛋白质分离与冷冻电镜载网制备，全过程耗时少于两小时。此外，如图6所示，由于样品制备所需材料的量和体积极小，且cryoWriter实现了近乎无损的样品处理和载网制备，因此有望对单个细胞的蛋白质复合物进行研究。结合微型化免疫沉淀方法与cryoWriter，我们奠定了一个名为&#34;单细胞可视化蛋白质组学&#34;的新型蛋白质组学方法的基础，我们最近在热激实验中已对此进行了验证24。目前，针对&#34;可视化蛋白质组学&#34;图像的数据分析算法正在测试中。

近年来，用于通过透射电子显微镜（TEM）进行蛋白质复合物结构分析的硬件和软件取得了巨大进展。这些改进推动了一场“分辨率革命”1,2，从根本上改变了结构生物学研究。这场革命始于冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的出现3,4，该技术使得生物样品能够在接近生理条件下制备，同时降低辐射敏感性，并防止样品在透射电子显微镜的高真空环境中蒸发5。在随后的几年中，持续的技术进步逐步提高了可达到的分辨率。其中的创新包括场发射电子枪的应用6,7，以及近年来更先进的数据分析算法，例如最大似然法8,9。直接电子探测器相机10,11,12,13、电影模式成像及其配套的软件发展14,15,16,17，最终实现了单颗粒分析方法对生物样品达到原子分辨率的关键突破（相关综述见 Cheng, Grigorieff, et al.18）。冷冻电镜的重要性最近得到了认可，三位先驱者因此荣获诺贝尔化学奖。
通过透射电子显微镜（TEM）对生物样品成像时，将样品加载到电镜载网上的方法（下文简称“载网制备”）必须确保最终形成的样品层满足以下条件：(i) 足够薄（&lt;100 nm），以避免因非弹性散射或多次散射电子引入大量噪声；(ii) 能够耐受电子显微镜的高真空环境；(iii) 能保护生物大分子免受辐射损伤。目前主要有两种方法可满足这些前提条件：负染色法(NS)19,20（图1A）将样品吸附至一层薄碳膜上，使生物大分子嵌入无定形的重金属盐中，随后在空气中干燥。该方法操作简便、快速，制备好的电镜载网（下文简称“样品载网”）易于储存，通常可长期保存（一般可达数年）。在TEM中，负染样品因重金属染色而具有高对比度，且可耐受较高电子剂量，优于冷冻样品，但其分辨率通常限制在约20 Å。冷冻电镜技术（Cryo-EM）（图1B）则采用带有微孔的碳支持膜，将样品溶液形成一层薄膜覆盖于微孔之上，随后将载网迅速浸入冷冻剂（通常为液态乙烷）中，使其在低于-150°C的条件下快速冷却。最终在支持膜的微孔中形成厚度为50至100 nm的无定形、玻璃态冰层。这种薄而无定形的冰层可耐受电子显微镜的高真空环境，并在理想情况下保持生物结构的天然状态，从而实现高分辨率成像。然而，样品载网必须始终维持在-150°C以下，以防止脱玻璃化。由于处于低温环境，样品可耐受相对较高的电子剂量，但其对比度和信噪比仍然较低。因此，通常采用图像平均技术来提高对比度，并在样品从不同角度成像的前提下，重构出高分辨率的三维（3D）结构图。目前最常用且高度成功的方法是单颗粒分析法。有关最新综述，请参见Cheng等人的研究18。
负染透射电镜（NS-EM）在需要高对比度或样品量有限时，对于筛选和质量控制具有重要意义（样品吸附到碳膜上通常可实现样品浓缩）。若目标是获得蛋白质结构的高分辨率三维重构，则单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）是目前的金标准方法。
<img alt="纳米技术工艺：液滴操控示意图、微加工步骤、实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1透射电镜载网制备原理及传统方法（图A、B）与微流控方法（图C、D）的比较。 A) 经典负染透射电镜载网制备：简介 3 µL 将样品手动移液至覆盖有连续碳膜的电镜载网上（后文简称“NS-EM载网”）(i)。室温孵育约10秒后，从侧面用滤纸吸去多余液体(ii)，使吸附的生物分子保留在一层薄水膜中。随后，将蛋白质与重金属盐溶液孵育， 例如，2%醋酸铀染色20秒（iii），再次用滤纸从侧面吸去液体（iv）。最后，将电镜载网置于空气中自然干燥。 B) 经典冷冻电镜载网制备：简介 3 µL 将样品用移液枪手动滴加到有孔碳膜上。为形成薄层样品膜，从一侧或两侧直接用滤纸 blot 去多余液体（ii）。最后，将载网迅速浸入液态乙烷中进行玻璃化冷冻（iii）。 C) 使用cryoWriter装置制备NS-EM载网：用微毛细管从样品储备液中吸取5 nL体积的样品（i）。进行样品预处理时，将微毛细管尖端浸入预处理溶液中， 例如，2% 乙酸铵。离子和小分子通过扩散进行交换（ii）。请注意，微毛细管的尺寸确保整个过程由扩散驱动。蛋白质的扩散系数远低于盐离子，因此不会发生显著损失24最后，将样品滴加到载网上，使其自然干燥（iii）。 D) 冷冻电镜载网制备的cryoWriter法基本原理：将覆盖有微孔碳膜的电镜载网置于温度可控的平台表面，并用镊子固定。平台温度被控制在载网环境露点温度的某一偏移值。载网相对于含有样品的微毛细管移动，同时将微毛细管下降至距离载网数微米处。随后，在载物台以螺旋轨迹移动的同时，从微毛细管中释放出数纳升样品，并将多余液体重新吸回（i）。完成电镜载网的预处理后，将微毛细管移开，载网继续留在温控平台（后文简称露点（DP）平台）上一段时间，以允许样品以受控方式蒸发少量液体。进行 plunge freezing（快速冷冻）时，用镊子迅速将载网从平台上取下，并翻转 90° 垂直放置，并迅速浸入冷冻剂浴（iii）（此后称为“夹取- plunge”机制）。 <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
遗憾的是，自负染电镜（NS）和冷冻电镜（cryo-EM）的载网制备方法被发明以来，其技术进展甚微。目前存在的主要问题是样品消耗量大（约 3 µL 浓度为 1 mg/mL 的蛋白质）以及样品损失严重（> 99%）（图 1A,B）。此外，传统的冷冻电镜载网制备方法对蛋白质而言是一种较为严苛的操作过程：首先，该方法包含长时间的正面滤纸吸滤步骤（图 1B, ii）；其次，蛋白质会暴露于气液界面较长时间21。本文介绍了一种用于负染电镜（图 1C）或冷冻电镜（图 1D）的样品预处理、载网制备及后续处理（载网干燥或玻璃化）的替代方法。该自制装置名为“cryoWriter”，采用微型化样品处理技术和微流控原理，可实现样品的吸取、预处理与分配，完全避免了滤纸吸滤步骤，并为冷冻电镜样品的减薄提供了新的方法。该方法显著降低了样品消耗量，同时整体提升了用户对样品制备过程的控制能力。此外，该方法还拓展了新的实验应用，例如在被称为“单细胞可视化蛋白质组学”的研究策略中，可用于制备单个细胞内分离的生物组分22,23,24,25。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;液体处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微毛细管尖端</td><td>New Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m 尖端内径，100 &amp;micro;m 内径，20 个/包</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m 尖端内径，150 &amp;micro;m 内径，20 个/包</td></tr><tr><td>导电套管</td><td>New Objective</td><td>CONGAS-1&amp;nbsp;</td><td>用于高压接触的导电弹性体，12&quot; 长</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP 标准熔融石英管，150 &amp;micro;m 内径，363 &amp;micro;m 外径，5 米</td></tr><tr><td>PressFit 连接器</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>去活化 PressFit 连接器，0.25 至 0.25 mm 内径，25 个/包&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l 注射器</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - 鲁尔接头（不含针头）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>注射泵控制器</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS 控制器</td></tr><tr><td>注射泵加样单元</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS 加样单元</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;温度控制&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>露点传感器</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>湿度/温度传感器，可计算露点，带 USB 接口和嵌入式 DLL</td></tr><tr><td>温度传感器</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>可表面安装的 Pt1000 温度传感器</td></tr><tr><td>帕尔贴控制器</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&amp;nbsp;</td><td>用于激活帕尔贴驱动系统的 PID 温度控制器，具有恒定电压输出</td></tr><tr><td>帕尔贴元件</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>水冷块</td><td>-</td><td>-</td><td>适用于 40x40 mm 帕尔贴元件的水冷块，铜基</td></tr><tr><td>水泵</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 双 5.25 英寸扩展槽储液泵 黑色 V4</td></tr><tr><td>水冷散热块</td><td>-</td><td>-</td><td>带两个风扇的水冷散热块，用于冷却循环水</td></tr><tr><td>小型水冷器</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX 内存铜版 2 件套</td></tr><tr><td>小型帕尔贴元件</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm，3.4 A，8.1 W，3.8 V，74 &amp;deg;C，2 件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;机械部件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Z 轴线性平台</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>高负载精密平移台，行程范围 50 mm，直流电机</td></tr><tr><td>平台控制器</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury 伺服控制器</td></tr><tr><td>显微镜 XY 轴平台</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>适用于 Zeiss Axiovert 200 倒置显微镜的电动平台</td></tr><tr><td>小型永磁体</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>圆柱形磁铁 &amp;Oslash; 5 mm，高度 8.47 mm，钕铁硼，N45，镍镀层，10 个/包</td></tr><tr><td>小型电磁铁</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>电磁铁 24V，220 N，150 N，2.5 W</td></tr><tr><td>电磁铁控制器</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>电磁铁控制 PCB 板</td></tr><tr><td>电磁阀轮毂</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke 电磁阀轮毂 30 mm，16 N，2 N，16 W</td></tr><tr><td>微型镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont 5 型微型镊子，超薄尖端</td></tr><tr><td>各种光学机械部件</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>各种机械部件</td><td>巴塞尔大学生物中心车间</td><td>-</td><td>定制设计的适配板、支架等，详见附带的 CAD 文件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;光学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光二极管</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm 激光二极管模块，2.5 mW</td></tr><tr><td>光电探测器</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>硅基可切换增益探测器，320–1100 nm，2.4 MHz 带宽，100 mm²</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电镜载网&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN 薄膜透射电镜载网</td><td>emsdiasum.com</td><td>DTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&amp;trade; 氮化硅薄膜透射电镜载网，5 个/包</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 目 R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 目 R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液 / 负染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&amp;nbsp;SIGMA</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>基于钒的负染试剂</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>基于钨的负染试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>openBEB 2 框架可应要求提供，版本 3 将可下载</td></tr><tr><td>CryoWriter 控制软件（openBEB 插件）</td><td></td><td>可应要求提供，第三方驱动软件可能需额外费用。</td><td></td></tr></tbody></table>

用于透射电子显微镜的微型化样品制备

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

由于近期的技术进步，冷冻电子显微镜（cryo-EM）正迅速成为以原子分辨率解析蛋白质复合物结构的标准方法。然而，用于电子显微镜的蛋白质分离技术和样品制备方法仍然是瓶颈。单颗粒电子显微镜方法对蛋白质进行高分辨率分析时，仅需对相对少量（10万至数百万个）的单个蛋白质颗粒进行成像，这使得微型化样品处理技术和微流控原理得以应用。
本文介绍了一种微型化、无需滤纸 blotting 的电镜载网（EM grid）制备方法，可用于样品预处理、电镜载网预处理及后续操作，且仅消耗纳升级体积的样品。该方法采用具有亚纳升级精度的液体分配系统，以控制液体吸取和电镜载网的上样；通过温控平台调节载网温度，从而控制载网上方的相对湿度；并配备“夹取- plunge”装置，实现样品的快速玻璃化冷冻。在冷冻电镜（cryo-EM）操作中，将电镜载网置于温控载物台上，样品被吸入毛细管中；将毛细管尖端定位至载网表面附近，将样品加载到载网上，过量液体则重新吸入微毛细管中。随后，通过调节平台温度与露点之间的温差，控制水分蒸发，使样品薄膜稳定并适度减薄。在设定时间点触发夹取- plunge 装置，迅速将预处理完成的电镜载网转移至液态乙烷中，实现样品的玻璃化。此外，还提供适用于负染电镜（NS EM）的样品处理方法，可制备纳升级体积的样品。
这些方法显著减少了样品消耗，并避免了可能对蛋白质造成损害的操作，例如传统方法中使用的滤纸印迹法。此外，由于所需样品量极微，可实现新的实验策略，例如快速样品处理，以及与单细胞裂解技术联用 &#34;视觉蛋白质组学&#34; 或 &#34;无损&#34; 复杂样品定量分析的总样品制备

“cryoWriter”装置的设置已开发（如图所示） 图2) 以测试所提出的微型化电子显微镜载网制备流程 图1C，D. 图2A 显示了安装在倒置荧光显微镜上的各个组件的概览。显微镜左侧安装有细胞培养模块，右侧为电镜载网制备模块。细胞培养模块（图2B) 可支持贴壁真核细胞的生长，并通过光学显微镜对活细胞培养进行实时成像。单个细胞通过渗透冲击、电穿孔以及将细胞内容物吸入微毛细管的联合作用实现裂解。图2B, 图6A)24,25. 吸取的裂解液样品可用于制备负染或冷冻电镜载网。或者，PCR管中的蛋白储备溶液也可作为样品来源。该微毛细管（图2B) 连接至一个高精度泵系统，可实现亚纳升级别（sub-nL）精度的样品吸取与分配。如实验方案中所述，所有样品处理均在此微毛细管内或直接在电镜载网（EM grid）上完成，无需进行显著的样品转移。例如，同一根微毛细管可用于裂解单个真核细胞、吸取裂解液、对裂解液进行处理，并最终将等分试样分配至电镜载网上。网格制备模块包含一个可移动的DP载台，可精确控制放置于其上的电镜载网的温度（图2C）。对于负染透射电镜（NS-TEM），制备好的样品载网可直接从冷台上取下，并在室温下空气中自然干燥。然而，在需要对蛋白质“颗粒”进行计数的定量透射电镜分析中，必须避免由此产生的所谓“咖啡环效应”。为避免该效应，可将载网置于DP载台上，通过逐步升高的温度梯度缓慢干燥，以减缓液体蒸发速度。对于冷冻电镜（cryo-EM），载网温度需保持接近露点，通常采用约正向偏移 8 °C 被选用，以实现样品液体的受控蒸发，从而进行薄膜的稳定与减薄，必要时可通过传感器进行监测26在选定的减薄时间后，启动夹取- plunge 冷冻机制，使样品玻璃化（图2C）。需要注意的是，NS-EM载网在室温下保存，无需使用此 plunge 冷冻机制。
<img alt="用于DNA分析的光谱学装置；包括光学组件和样品定位系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：cryoWriter装置的总体示意图。A) 安装在倒置光学显微镜（1）上的cryoWriter装置整体示意图。B) A图左侧区域的放大图。细胞培养室（2），其上方放置有用于样品操作和细胞裂解的微毛细管（3），位于微型化PDMS基细胞培养板（4）之上。C) A图右侧区域的放大图。“拾取- plunge”机制。将带孔碳膜电镜载网（5）固定在镊子尖端（6）之间，并水平放置于温度可控的载台（7）上，该载台在正文称为露点载台（DP-stage）。通过PID控制器和水冷式帕尔帖元件精确控制载台温度，使其保持在或接近环境条件下的露点温度。DP-stage（7）安装在电动化的xy轴平台上，可相对于微毛细管移动载网。微毛细管本身安装在z轴平台上，可向下移动至非常接近电镜载网表面的位置，用于将纳升级体积的液体样品点样到覆盖在其上的样品支撑层上（负染电镜使用连续薄碳膜，冷冻电镜使用带孔碳膜）。液体的吸取与点样由高精度泵系统（8）完成。通过将载网相对于微毛细管以螺旋轨迹移动，可实现所点样品的均匀分布。对于冷冻电镜样品制备，拾取- plunge冷冻机制（9）可迅速将加样后的载网转移至液态乙烷（10）中，实现快速冷却和样品玻璃化。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3 展示了使用cryoWriter装置制备的负染电镜载网（NS-EM grids）所获得的代表性结果。将微毛细管尖端从储备液中吸取5 nL样品，随后浸入含有负染溶液（2%甲胺钨酸）的储液池中数分钟，以允许负染剂与盐离子之间发生扩散交换（理论讨论参见Arnold, 等24随后，将处理后的样品滴加到NS-EM载网的薄碳膜上并干燥。 图3A 以相同方式使用槽型载网来观察完整液滴，满足定量透射电子显微镜（TEM）的要求。为避免咖啡环效应，将新近辉光放电处理的载网首先置于露点温度下（无水分蒸发），随后在露点台（DP-stage）上缓慢升温。注意，对于大多数应用（例如，样品的质量控制或结构分析）则无需此慢速干燥过程。如文中所示，高质量的负染样品制备可不经过此步骤即可获得 图3B，C磷酸盐-free低盐缓冲液的平衡时间约为3分钟， 例如，用低盐 Tris 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，含 50 mM NaCl）洗涤，如图所示 图3B 以烟草花叶病毒（TMV）为样品。 图3C 呈现了一种最坏情况，因为烟草花叶病毒（TMV）处于PBS缓冲液（2.7 mM KCl，1.5 mM KH）中2PO4，136.9 mM NaCl，8.9 mM Na2HPO4·7H₂O，pH 7.4）。磷酸根离子与NS中的重金属离子形成瞬时晶体（参见 图5C），延长了所需的处理时间（7 分钟）。其他重金属盐也可用于网格制备模块， 例如，2% 钒酸甲胺或钼酸铵（另见 Arnold， 等24）。然而，醋酸铀不适合使用；如果蛋白质样品在吸附到碳膜之前于溶液中进行处理，这种染色剂的交联效应会导致形成聚集体（参见 图5E)23.
<img alt="纳米结构的电子显微镜图像；A：颗粒，B-C：纳米管，结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：使用 cryoWriter 装置制备的 NS 载网的典型结果，载网制备条件如图1C所示。A) 经2%甲胺钨酸处理后，在方孔载网上点样3 nL液滴的概览图像。B) 在20 mM TRIS缓冲液中的烟草花叶病毒（TMV）。插图为指定区域的3倍放大图像。改编自Arnold等24（有关所摘录材料的进一步许可应联系美国化学会ACS）。C) 在PBS缓冲液中的烟草花叶病毒（TMV）。插图为指定区域的3倍放大图像。改编自Arnold等24（有关所摘录材料的进一步许可应联系美国化学会ACS）。比例尺：A，100 µm；B，50 nm；C，80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用 cryoWriter 装置制备的冷冻电镜载网所获得的典型结果如图4所示。图4A展示了玻璃态冰样品覆盖区域的载网图谱。图4B展示了选定载网狭缝中玻璃态冰的均一性。在这两种情况下，样品均处于含有0.05% Fos-14去垢剂的25 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、50 mM NaCl缓冲液中。已测试多种样品和缓冲液，均获得了类似高质量的玻璃态冰，但所需条件依赖于缓冲液（另见图5的讨论）。图4C展示了在Tris-HCl缓冲液（20 mM Tris-HCl，50 mM NaCl；pH 7.4）中的脱铁铁蛋白颗粒和一种噬菌体，采用高欠焦成像以增强对比度。图4D展示了一种由两亲性聚合物（amphipoles）稳定的200 kDa膜蛋白。
<img alt="冷冻电镜载网制备、电子显微镜分析、样品可视化、结构成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用如图 1D所示的cryoWriter装置制备的冷冻电镜载网的典型结果。图中所示示例的样品和缓冲液各不相同。所有样品均加载于有孔碳膜上。A) 含有150 kDa膜蛋白样品的概览图像拼接图（“载网图谱”），玻璃态冰的边缘由白色箭头指示。B) 使用相同缓冲液制备的载网上的一个网格孔区域放大图，显示带有玻璃态冰的有孔碳膜。部分孔洞未被样品缓冲液填充，如白色箭头所示。C) 含有脱铁铁蛋白蛋白复合物和噬菌体的玻璃化样品的碳孔。插图：两倍放大图，显示噬菌体的尾部。白色星号表示碳膜。请注意，该图像以高欠焦状态采集以增强对比度。D) 重建于两亲聚合物（amphipols）中的200 kDa膜蛋白。插图：所示区域的2倍放大图像，并增强对比度。比例尺：A，100 µm；B，10 µm；C 和 D，80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
cryoWriter 装置可用于系统性筛选最优的电镜载网制备条件；图5A 展示了一个示例（脱铁铁蛋白溶于含 0.05% Fos 14 的 25 mM HEPES-KOH 缓冲液，pH 7.5，50 mM NaCl）。在该实验中，玻璃态冰“减薄”温度被改变，而减薄时间（即样品施加与 plunge freezing 之间的间隔）保持恒定（1 s）。在较低的偏移温度（例如，8 K）下，样品层过厚；随着偏移温度升高，孔洞中的玻璃态冰逐渐变薄（10 K，12 K），直至某一阶段（高于 18 K）载网完全干燥（未显示）。在本研究展示的结果中，12 K 的偏移温度产生了大面积均一的玻璃态冰区域，如黑色箭头所示。此类优化实验可使用目标样品的缓冲液并结合“测试”蛋白（如脱铁铁蛋白）进行。找到的最佳条件随后可应用于目标样品。此外，在制备过程中，参数明显偏离最优条件的载网通常可被识别，无需在电子显微镜下进行筛选，从而显著节省时间。图5 还展示了一系列与 cryoWriter 装置相关的典型冷冻电镜（cryo-EM，图B）和负染电镜（NS-EM，图C至E）伪影。图5B所示的 cryo-EM 载网中，TMV 溶于含 0.1% 十烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷（0.1% DM）的 PBS 缓冲液（2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4，136.9 mM NaCl，8.9 mM Na2HPO4·7H2O，pH 7.4）中，但冰层过度减薄。图像背景呈现颗粒状，原因是盐浓度变得过高。通常，样品的视觉外观似乎并非盐浓度的线性函数；在减薄过程中，当盐浓度达到某一阈值时，颗粒会突然变得明显。请注意，可在载网制备前通过预处理步骤去除不需要的物质，NS-EM 的该操作已在方案第1.6节中描述。NS 还可能引起其他伪影。图5C所示示例中，未含样品的 PBS 缓冲液（2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4，136.9 mM NaCl，8.9 mM Na2HPO4·7H2O，pH 7.4）经 2% 甲胺钨酸处理 3 分钟，可见沉淀物和晶体，其对碳膜表面施加显著作用力，导致裂纹。此类沉淀物仅在特定的 PBS 与 NS 浓度范围内形成，可通过延长样品预处理时间避免（参见 图3C）。图5D 显示了施加的 NS 样品液滴边缘出现“咖啡环”现象。这会干扰定量的全样品分析，可通过减缓干燥过程避免，即在样品施加期间将电镜载网保持在露点温度，随后逐步升温使其干燥（见 图3A）。图5E（脱铁铁蛋白溶于 20 mM HEPES，pH 7.0，预处理 3 分钟）显示了 2% 醋酸铀酰染色剂的交联活性，该染色剂不可用于蛋白样品在吸附至碳膜支持膜前的预处理。
<img alt="冷冻电子显微镜载网制备与分析；示意图显示载网、颗粒分布及结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5使用cryoWriter装置制备负染和冷冻电镜样品载网时观察到的系统性变化与伪影 A) 系统性改变玻璃态冰层厚度；优化冷冻电镜载网制备。保持减薄时间恒定（1 s），改变DP-stage的偏移温度（8 K至12 K）。箭头指示样品层的边缘。 B) 盐效应；浓度过高 即，减薄步骤时间过长。插图显示了所示区域的2倍放大图像。 C) PBS缓冲液在存在重金属盐时会形成盐沉淀。含有PBS缓冲液的样品必须比其他缓冲液中的样品进行更长时间的负染处理。此处，不含样品的PBS缓冲液用2%甲基胺钨酸处理3分钟，这是其他样品缓冲液的典型处理时间。注意碳膜上的裂纹，这很可能是由于干燥过程中沉淀物对薄支撑膜施加的强大力量所致。 D) “咖啡环”效应 E) 脱铁铁蛋白经2%醋酸铀酰染色3分钟。铀酰离子表现出显著的交联活性，导致脱铁铁蛋白聚集成大块聚集体。比例尺：A， 80 µm；B，80 nm；C， 12 µm；D， 80 µm；E，200 nm。 <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
使用 cryoWriter 装置制备电镜载网所需的样品量和体积较小，可实现新型实验。例如，可收集单个细胞的全部内容物，并用于负染电镜（NS-EM）和冷冻电镜（cryo-EM）制样。该操作流程如图所示 图6A贴壁的真核细胞（HEK 293）通过同时进行电穿孔和样本抽吸而裂解（图6A）25总共吸取3 nL体积，其中包含细胞裂解物，并保留在微毛细管中以进行后续处理。对于图6B所示的NS-EM，细胞培养基被替换为PBS缓冲液（2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4，136.9 mM NaCl，8.9 mM Na2HPO4·7H₂O，pH 7.4）中，然后进行细胞裂解。细胞内容物以3 nL缓冲液吸取，并按所示置于NS储液池中进行预处理。 图1C 10分钟。随后，将5 nL体积的样品滴加至NS-EM载网的连续碳膜上。单个蛋白质， 例如，细丝状肌动蛋白以及带有附着蛋白的膜片可在图像中被识别。对于所示的冷冻电镜（cryo-EM）， 图6C，将3 nL体积的样品 dispensing 至带有孔状碳膜的电镜载网上，未进行重新吸液以去除液体。所形成的相对较厚的样品液膜在玻璃化之前进行了充分的减薄。为此，DP-stage温度从露点温度开始逐步升高。通过实时传感器系统监测减薄过程，直至达到预设阈值，触发“拾取- plunge”机制并实现样品的玻璃化（详见 Arnold, 等26）。图像中可识别出膜结构和蛋白质。
<img alt="电泳过程示意图，包含电子显微镜图像和电荷分离分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：使用cryoWriter装置进行单细胞可视化蛋白质组学分析。A) 单个贴壁真核细胞的裂解。该细胞（1，绿色）培养在微型培养皿（3）内的一块经功能化修饰、镀有氧化铟锡（ITO）（红色）的玻璃载片（2）上25。ITO层接地。微毛细管（4）表面镀铂，逐渐接近细胞。首先施加初始渗透压冲击（图中未标出），以促进裂解；随后通过一系列电脉冲以及在吸取细胞裂解物过程中产生的剪切力完成裂解。该过程可通过光学显微镜实时监测；图中所示为显微镜物镜（5）。详细信息请参见我们之前的研究工作24,25。B) 来自单个HEK 293细胞的裂解物的负染电镜（NS-EM）图像。可见丝状肌动蛋白及附着蛋白的膜碎片。本图改编自Arnold等人的研究24（有关所摘录材料的进一步许可应联系美国化学会ACS）。C) 来自单个HEK 293细胞的裂解物的冷冻电镜（Cryo-EM）图像。插图为指定区域的2倍放大图像，可见典型的带有相关蛋白的膜结构。图C改编自Arnold等人的研究26。比例尺：B，50 nm；C，80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种用于制备纳升级样品体积以进行透射电子显微镜观察的仪器及方法。该方法无需滤纸吸 blotting 步骤，从而避免了此类操作对蛋白质可能造成的不利影响，显著减少了样品损失，并实现了对单个细胞裂解液的可视化蛋白质组学分析。

由于近期技术进步，冷冻电子显微镜（cryo-EM）正迅速成为蛋白质结构分析的标准方法……

该方法有助于解答结构生物学领域的关键问题，例如在蛋白样品有限的情况下对敏感性蛋白进行制备。该技术的主要优势在于，与常规样品制备方法相比，仅需极微量的样品，且无需进行剧烈的滤纸吸干步骤。该技术的应用前景涵盖通过可视化蛋白质组学实现单细胞分析，以及蛋白质相关疾病的诊断。我们最初产生这一方法的想法是在技术条件允许仅用约 100,000 个单独粒子即可解析高分辨率结构时。首先，按照随附的文字实验方案制备样品。接着，组装乙烷杯、冷冻盒支架和载网架。然后用液氮将冷冻剂容器完全装满。数分钟后，杯子将冷却且内部的液氮会完全蒸发。接着打开乙烷气瓶，缓慢将气体通入乙烷杯中。让液态乙烷充满杯子，直至液面低于杯口两到三毫米。此过程需要几分钟，约需五毫升液态乙烷。取下蜘蛛夹具，盖上聚苯乙烯盖子，将低温容器放置于冷冻写入仪的支架上。使用冷冻书写仪镊子夹住发出辉光的EM载网，将镊子固定在电磁铁上，然后调节显微操作器，使载网平整地置于载物台上，碳膜面朝上。返回软件界面，双击 grid_save。随后调整微毛细管的位置，使其尖端位于载网表面上方约10微米处。确保微毛细管能够在网格上自由移动，且任何位置均不与网格接触。如有必要，将微毛细管回撤数微米。然后将其重新移回网格中心位置，并将该新位置保存为网格位置。将微毛细管移回初始位置。接着，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管，并使用无绒纸巾擦去微毛细管上的任何液滴。一切准备就绪后，启动宏脚本。该宏程序首先移动到指定位置，并注入5纳升系统液体以清除针尖处的任何气泡，然后移动至样品位置。接着，吸取65纳升样品，再将5纳升回注到样品管中。此操作可补偿系统回程误差，并实现同步书写。移动到网格位置后，启动写入模式，使微毛细管在网格上移动，同时分配 45 纳升样品。随后，将微毛细管移回网格中心，再下降 10 微米，并吸除多余的样品液体。最后，宏程序收回微毛细管并关闭电磁铁，从而触发 plunge freeze 机制。从磁铁上释放后，小心地将磁性适配器从柱塞上松开，并迅速将载网从乙烷杯转移至装有冷冻盒的低温容器中，将载网放入一个空闲的卡槽内。首先，按照随附的文字实验方案制备细胞，并将氧化铟锡载玻片安装到显微镜插入件上。使用两颗螺丝将载玻片固定在铝制插入件上，以确保载玻片的氧化铟锡涂层与接地的铝制框架之间形成良好的电接触。然后从孔中移除细胞培养基，并用 300 微升电穿孔缓冲液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞保留在电穿孔缓冲液中。接下来，将固定着氧化铟锡载玻片的铝制插入件放置在活细胞培养箱载物台上，置于已准备好的装置中。使用显微镜定位细胞培养区域，并选择一个无细胞的区域。将微毛细管尖端移至载玻片表面并轻轻接触，然后将尖端回撤100微米，并将该位置保存为细胞位置。现在迅速离开细胞培养环境，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管尖端，然后再次将其放入细胞培养环境中。浸入PDMS孔时，释放几纳升液体，以确保尖端无气泡滞留。双击细胞位置，轻柔地接近氧化铟锡载玻片表面，接触后将尖端回撤10微米。此时，选择一个邻近的细胞进行裂解，并将微毛细管的尖端置于目标细胞上方。然后启动单细胞裂解的宏脚本程序。程序启动后，系统将提示输入微毛细管在成功裂解细胞后应移动到的位置。请输入期望的位置，例如用于电镜载网的“grid”。随后，宏程序将在无需用户干预的情况下继续运行，首先将显微镜载物台在细胞培养区域向左移动100微米，并对目标细胞拍摄一张快照。然后，微毛细管移液管释放出15纳升双蒸水，置换并稀释高盐缓冲液，从而对细胞施加渗透压。接着，载物台移动，再次将移液管尖端定位在目标细胞上方。在此位置，施加预设的电压脉冲，500毫秒后，泵系统开始以每分钟2微升的流速吸取3纳升样品。最后，载物台再次向左移动，以便对细胞进行观察。此时会弹出一个窗口，提示用户输入信息。如果细胞处理成功，则输入“是”以拍摄裂解后细胞的快照。随后，将微毛细管移至内侧位置，浸入储液池的液体中。根据喷嘴的几何形状，使微毛细管在液体中浸没8到12分钟。接着，将五纳升经处理的细胞裂解液滴加到载网上。取出微毛细管，让已处理的样品在露点台上缓慢干燥。最后，将载网从台上取下，并置于室温下的载网盒中保存。此处展示的是使用所述 CryoWriter 装置制备的冷冻样品的典型冷冻电镜图像。在网格概览图中，可以清楚地看到玻璃态冰的边缘区域。仔细观察含有玻璃态冰的带孔碳膜网格孔洞时，可见一些白色孔洞，表明并非所有孔洞都充满了样品缓冲液。在其中一个含有样品的碳膜孔洞中，可清晰地观察到噬菌体尾部的细节结构。使用CryoWriter进行单细胞可视化蛋白质组学分析时，可以观察到诸如单个蛋白质（例如丝状肌动蛋白）以及带有附着蛋白的膜片段等结构。图6b所示图像采用基于有机钨化合物的2%负染剂进行负染。图c显示的是为冷冻电镜制备的单细胞裂解液。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从纳升级总体积的蛋白质样品或单细胞提取物中制备负染或冷冻电镜载网。请注意，操作液态乙烷和氮气可能具有极高危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如佩戴护目镜和实验服。

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