通过测量活细胞中的 eIF4E-eIF4G 交互来监控 eIF4F 装配
May 1st, 2020
在这里，我们提出了一个协议，以测量eIF4E-eIF4G在活细胞中的相互作用，使用户能够评估药物引起的扰动eIF4F复杂动态的筛选格式。
eIF4F 复合物信号转导的调节与参与癌症增殖和存活的 mRNA 亚群的翻译增加有关。在这里，我们描述了一种基于 eIF4E-eIF4G 细胞的蛋白质-蛋白质相互作用测定，使我们能够评估活细胞中 eIF4F 复合物完整性的药物诱导扰动。人们对开发有效靶向蛋白质-蛋白质界面的方式越来越感兴趣。
我们设想我们的 eIF4E-eIF4G PPI 检测将有助于培养这些策略并对其进行验证。该测定将为其提供最佳的主要方案，以引导 eIF4E-eIF4G 抑制剂的优化。正确接种细胞和进行转染转染是该产品最具挑战性的方面，因为它们可能直接反映在 PPI 报告系统的抑制上。
解冻和计数细胞后，用 HEK 293 细胞接种 6 孔板，每孔使用 2 mL 标准生长培养基。第 2 天早上，对于每次计划转染，在含有 125 μL 不含酚红的还原血清培养基的试管中稀释 9 μL 基于脂质体的溶液。当稀释的脂质体在室温下孵育 5 分钟时，为每个转染管将 3 μg 每个质粒稀释在 125 μL 减血清培养基中，制备 DNA 预混液。
向 DNA 预混液 2 中加入 12 μL 增强剂试剂，然后充分混合。立即将此混合物以 1 比 1 的比例添加到每管稀释的脂质体中。在室温下孵育该 DNA 脂质复合物 15 分钟后，将复合物添加到 6 孔板的每个孔中。
将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 24 小时。第 3 天早上，用 1 毫升 PBS 冲洗每个孔，并加入 0.3 毫升胰蛋白酶。将板在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。
孵育后，向不含酚红的还原血清培养基的每个孔中加入 2 mL 来中和胰蛋白酶。将转染的细胞转移到 15 mL 试管中。接下来，将细胞以 290x G 离心 5 分钟。
吸出培养基，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 还原血清培养基中。将转染的 HEK 293 细胞接种在 96 孔不透明板中，密度为每孔 30， 000 个细胞，溶于 90 微升培养基中。为了在同一实验中获得 3 种不同化合物的 3 个技术重复，请接种 60 个孔。
排除边缘的孔。接种转染细胞后，立即向每个孔中加入 10 μL 10% DMSO 化合物溶液。通过将每种感兴趣的化合物溶解在 100% DMSO 中来制备 1 毫摩尔化合物储备溶液。
为了对每个化合物滴定进行 3 次重复，请使用 8 μL 的 1 毫摩尔化合物储备液。将 4 微升 1 毫摩尔原液移液到 4 微升 100% DMSO 中，在每个滴定点，在 96 孔 PCR 板的 8 个孔中对每种储备化合物溶液进行两倍连续稀释。在两次连续稀释的最后一个点后丢弃多余的 4 μL。
向每管中加入 36 μL HPLC 级无菌水，以制备 40 μL 的 10x 化合物连续稀释溶液，溶于 10% DMSO。此外，准备一个控件。HPLC 级无菌水中含 10% DMS 的储备液。
向 96 孔不透明板中的细胞中加入 10 微升 10x 工作溶液，以产生预期的最终浓度，残留 DMSO 浓度为 1%在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育板 3 小时。3 小时后，将 1 体积的底物与 19 体积的稀释试剂混合，开始制备荧光素酶底物试剂。使用多通道移液器立即将 25 μL 底物试剂加入装有细胞的 96 孔板的每个孔中。
在轨道摇床上以 350 RPM 的转速摇动板，在室温下摇动 50 分钟。要评估发光，请将板放在读板器上。将镜像读取器设置为发光，将发射滤镜设置为 455。
使用 6.5 毫米的测量高度，测量时间为 1 秒。为了评估细胞活力，向每个孔中加入 33 μL 活力检测试剂。在室温下放置 15 分钟后，使用读板器评估发光，将读光镜设置为发光，将发射滤光片设置为 600。
使用 6.5 毫米的测量高度和 1 秒的测量时间。使用读板器中的数据来确定每种化合物的 IC 50 值，方法是将数据曲线拟合到手稿中描述的 4 参数拟合曲线方程。用 eIF4E-eIF4G 互补系统转染 HEK 293 细胞，然后退去并用 mTOR 抑制剂处理。
当治疗后 4 小时评估发光时，PP242 和雷帕霉素均产生剂量依赖性信号抑制。PP242 和雷帕霉素均未显著降低细胞活力，表明 eIF4E-eIF4G 互补系统中发光的降低不是由于非特异性细胞死亡，而是由于 EIF4E-4G 相互作用的破坏。在 m7GTP 下拉实验之后，Western blot 分析表明，4EBP1 介导的内源性 eIF4E-eIF4G 相互作用的破坏与测量的 eIF4E-eIF4G 检测信号相关。
PP242 是比雷帕霉素更有效的 4EBP1 总磷酸化抑制剂。两种抑制剂均显示对 mTOR 信号转导正常影响，雷帕霉素对 mTORC1 底物更活跃，而 PP242 同时靶向 mTORC1 和 mTORC2。该产品最关键的方面是在交易当天接种细胞，在不含酚红的培养基中重新接种细胞，评估 eIF4E-eIF4G 互补测定的发光，并在同一平板上运行活力测定。
可以进行二次活力测定以评估任何靶标药物和已知的特异性作用。
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概述
本文介绍了一种在活细胞中测量eIF4E-eIF4G相互作用的协议，便于评估药物诱导的eIF4F复合物动态扰动。该测定旨在支持靶向这种蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂的开发。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质-蛋白质相互作用
- 癌症研究
背景
- eIF4F复合物对mRNA翻译调控至关重要。
- 其信号传导与癌细胞增殖和存活相关。
- 靶向蛋白质-蛋白质界面是一个日益增长的兴趣领域。
- 评估eIF4E-eIF4G相互作用可以帮助药物发现。
研究目的
- 开发用于eIF4E-eIF4G相互作用的细胞测定。
- 评估药物对eIF4F复合物完整性的影响。
- 为优化eIF4E-eIF4G抑制剂提供框架。
使用的方法
- 细胞接种和转移转染技术。
- 活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用测定。
- 评估药物诱导的扰动。
- 优化测定条件以获得可靠结果。
主要结果
- 该测定成功测量了eIF4E-eIF4G相互作用。
- 药物处理可以改变eIF4F复合物的动态。
- 细胞处理中的挑战可能影响测定结果。
- 该方法支持潜在抑制剂的验证。
结论
- eIF4E-eIF4G测定是癌症研究的宝贵工具。
- 它能够评估药物对蛋白质相互作用的影响。
- 这种方法可以促进靶向治疗的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring eIF4F assembly via eIF4E-eIF4G interaction provides a live-cell readout of a key oncogenic signaling node, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking of translation initiation inhibitors. This assay supports predictive confidence in compound screening by linking target engagement to functional disruption of cancer-relevant mRNA translation, informing portfolio decisions in oncology drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the eIF4E-eIF4G protein-protein interaction as a functional readout of eIF4F complex assembly in live cells.
- Operational Value: Enables assessment of drug-induced perturbations in target engagement without relying on cell death confounders.
- Strategic Value: Supports target validation by correlating compound effects with known pathway inhibitors like PP242 and rapamycin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative luminescence-based readout amenable to dose-response profiling and IC50 determination.
- Operational Value: Compatible with 96-well format and dual-readout design (target engagement and viability) for assay robustness.
- Strategic Value: Enables primary screening and lead optimization of eIF4E-eIF4G disruptors in a physiologically relevant cellular context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures target modulation in a disease-relevant system where eIF4F dysregulation drives oncogenic translation.
- Operational Value: Demonstrates correlation with biochemical validation (e.g., 4EBP1-mediated disruption via m7GTP pull-down), supporting translational continuity.
- Strategic Value: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing specific target effects from cytotoxic artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling quantitative lead optimization prior to preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of the eIF4F node and pathway clarification in oncogenic signaling contexts.
- Screening: Enables reproducible, quantitative compound evaluation with built-in viability counterscreening.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values via 4-parameter curve fitting for compound prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical validity through correlation with orthogonal validation of eIF4E-eIF4G disruption.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing PPI-targeted modalities across oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation and reduces mechanistic ambiguity in PPI-directed screening.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts with internal viability controls to ensure data quality.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by isolating specific target effects from cytotoxic confounders.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of eIF4E-eIF4G inhibitors based on target engagement and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell transfection and protein-protein interaction assay design.
- Dependent on luminescence detection infrastructure and orbital shaking for signal development.
- Necessitates standardization of cell seeding density and transfection efficiency across wells.
- Involves optimization of compound dilution series in DMSO to maintain consistent solvent exposure.
- Limited by the need for careful cell handling to avoid artifacts in PPI reporting, particularly during transfer and re-seeding steps.
