通过测量活细胞中的 eIF4E-eIF4G 交互来监控 eIF4F 装配

eIF4F 复合物信号转导的调节与参与癌症增殖和存活的 mRNA 亚群的翻译增加有关。在这里，我们描述了一种基于 eIF4E-eIF4G 细胞的蛋白质-蛋白质相互作用测定，使我们能够评估活细胞中 eIF4F 复合物完整性的药物诱导扰动。人们对开发有效靶向蛋白质-蛋白质界面的方式越来越感兴趣。

我们设想我们的 eIF4E-eIF4G PPI 检测将有助于培养这些策略并对其进行验证。该测定将为其提供最佳的主要方案，以引导 eIF4E-eIF4G 抑制剂的优化。正确接种细胞和进行转染转染是该产品最具挑战性的方面，因为它们可能直接反映在 PPI 报告系统的抑制上。

解冻和计数细胞后，用 HEK 293 细胞接种 6 孔板，每孔使用 2 mL 标准生长培养基。第 2 天早上，对于每次计划转染，在含有 125 μL 不含酚红的还原血清培养基的试管中稀释 9 μL 基于脂质体的溶液。当稀释的脂质体在室温下孵育 5 分钟时，为每个转染管将 3 μg 每个质粒稀释在 125 μL 减血清培养基中，制备 DNA 预混液。

向 DNA 预混液 2 中加入 12 μL 增强剂试剂，然后充分混合。立即将此混合物以 1 比 1 的比例添加到每管稀释的脂质体中。在室温下孵育该 DNA 脂质复合物 15 分钟后，将复合物添加到 6 孔板的每个孔中。

将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 24 小时。第 3 天早上，用 1 毫升 PBS 冲洗每个孔，并加入 0.3 毫升胰蛋白酶。将板在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

孵育后，向不含酚红的还原血清培养基的每个孔中加入 2 mL 来中和胰蛋白酶。将转染的细胞转移到 15 mL 试管中。接下来，将细胞以 290x G 离心 5 分钟。

吸出培养基，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 还原血清培养基中。将转染的 HEK 293 细胞接种在 96 孔不透明板中，密度为每孔 30， 000 个细胞，溶于 90 微升培养基中。为了在同一实验中获得 3 种不同化合物的 3 个技术重复，请接种 60 个孔。

排除边缘的孔。接种转染细胞后，立即向每个孔中加入 10 μL 10% DMSO 化合物溶液。通过将每种感兴趣的化合物溶解在 100% DMSO 中来制备 1 毫摩尔化合物储备溶液。

为了对每个化合物滴定进行 3 次重复，请使用 8 μL 的 1 毫摩尔化合物储备液。将 4 微升 1 毫摩尔原液移液到 4 微升 100% DMSO 中，在每个滴定点，在 96 孔 PCR 板的 8 个孔中对每种储备化合物溶液进行两倍连续稀释。在两次连续稀释的最后一个点后丢弃多余的 4 μL。

向每管中加入 36 μL HPLC 级无菌水，以制备 40 μL 的 10x 化合物连续稀释溶液，溶于 10% DMSO。此外，准备一个控件。HPLC 级无菌水中含 10% DMS 的储备液。

向 96 孔不透明板中的细胞中加入 10 微升 10x 工作溶液，以产生预期的最终浓度，残留 DMSO 浓度为 1%在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育板 3 小时。3 小时后，将 1 体积的底物与 19 体积的稀释试剂混合，开始制备荧光素酶底物试剂。使用多通道移液器立即将 25 μL 底物试剂加入装有细胞的 96 孔板的每个孔中。

在轨道摇床上以 350 RPM 的转速摇动板，在室温下摇动 50 分钟。要评估发光，请将板放在读板器上。将镜像读取器设置为发光，将发射滤镜设置为 455。

使用 6.5 毫米的测量高度，测量时间为 1 秒。为了评估细胞活力，向每个孔中加入 33 μL 活力检测试剂。在室温下放置 15 分钟后，使用读板器评估发光，将读光镜设置为发光，将发射滤光片设置为 600。

使用 6.5 毫米的测量高度和 1 秒的测量时间。使用读板器中的数据来确定每种化合物的 IC 50 值，方法是将数据曲线拟合到手稿中描述的 4 参数拟合曲线方程。用 eIF4E-eIF4G 互补系统转染 HEK 293 细胞，然后退去并用 mTOR 抑制剂处理。

当治疗后 4 小时评估发光时，PP242 和雷帕霉素均产生剂量依赖性信号抑制。PP242 和雷帕霉素均未显著降低细胞活力，表明 eIF4E-eIF4G 互补系统中发光的降低不是由于非特异性细胞死亡，而是由于 EIF4E-4G 相互作用的破坏。在 m7GTP 下拉实验之后，Western blot 分析表明，4EBP1 介导的内源性 eIF4E-eIF4G 相互作用的破坏与测量的 eIF4E-eIF4G 检测信号相关。

PP242 是比雷帕霉素更有效的 4EBP1 总磷酸化抑制剂。两种抑制剂均显示对 mTOR 信号转导正常影响，雷帕霉素对 mTORC1 底物更活跃，而 PP242 同时靶向 mTORC1 和 mTORC2。该产品最关键的方面是在交易当天接种细胞，在不含酚红的培养基中重新接种细胞，评估 eIF4E-eIF4G 互补测定的发光，并在同一平板上运行活力测定。

可以进行二次活力测定以评估任何靶标药物和已知的特异性作用。