使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

本实验的总体目标是鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。首先，在含有稳定同位素标记的碳和氮的精氨酸和赖氨酸的细胞培养基中培养细胞，以实现这一目的。第二步是将目标蛋白的质粒或对照质粒转染到已标记的细胞中。

接下来，裂解细胞并从裂解液中进行免疫沉淀。然后将等体积的对照和样品免疫沉淀物混合，进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。最后一步是分析质谱数据，以鉴定与目标蛋白相互作用的蛋白质。

最终，细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记（SILAC）或氨基酸沉淀技术能够从组织培养细胞中鉴定出大量与目标蛋白直接或间接相互作用的分子。与现有的方法（如TAP标签技术）相比，该技术的主要优势在于无需研究者将质谱分析中单独的条带逐一送检，从而消除了一个重要偏倚来源，同时提高了检测灵敏度。

尽管该方法可用于研究细胞内蛋白质，但蛋白质相互作用技术也可应用于其他系统，例如病原体与宿主相互作用的研究。首先，用刮棒将表达GFP标记的目标蛋白或GFP对照蛋白的SLAC标记的HEK 293T细胞从细胞培养皿中刮下，收集至预冷的PBS中，随后在4°C条件下以220 × g离心5分钟。用10毫升预冷PBS再洗涤细胞三次，将细胞沉淀重悬于200微升细胞裂解缓冲液中，裂解缓冲液需新鲜加入1×浓度的蛋白酶抑制剂混合物Cocktail III，并每毫升裂解缓冲液中加入5微升RNase抑制剂混合物（RNase cocktail）。冰上孵育5分钟后，在4°C条件下以13,000 × g离心10分钟，收集上清液作为可溶性细胞裂解物。

使用BCA法测定细胞裂解液的蛋白浓度。然后用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液将各样品裂解液的蛋白浓度归一化至终体积500微升。向每份归一化的细胞裂解液中加入500微升稀释缓冲液，其中含1×蛋白酶抑制剂混合物，使总体积调整至1毫升。

在准备抗GFP磁珠的同时，将裂解液置于冰上。每个样品保留50微升等分试样，用于后续的上样对照。涡旋振荡磁珠悬液以重新悬浮磁珠。然后使用剪去末端的200微升移液枪头，将每份样品25微升磁珠转移至新的离心管中。

每 25 微升珠子悬液，加入 20 倍体积的稀释缓冲液进行洗涤，以 2,700 × g 离心 5 分钟。再用 20 倍体积的稀释缓冲液将珠子洗涤数次。随后，每 25 微升珠子悬液中加入 100 微升稀释缓冲液。

然后使用末端切去的200微升移液枪头，将重悬的磁珠悬液各85微升转移至标记为SLAC的样品裂解液中。将样品与磁珠在4°C下于旋转仪上孵育2小时。样品与磁珠孵育结束后，在4°C下以2,700 × g离心5分钟。保留50微升上清液作为未结合样品，弃去其余上清液。

将每管中的珠子重悬于1毫升稀释缓冲液中，然后在4摄氏度下以2,700 ×g离心5分钟。重复此洗涤步骤两次，以从珠子中洗脱蛋白。向每个样品中加入50微升2×SDS上样缓冲液，并在95摄氏度下加热10分钟。

加热完成后，将每个样品在 4°C 条件下以 2,700 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至预先润滑的离心管中，并在 -80°C 下保存，直至准备提交进行质谱分析。随后，取等体积的对照组和样品氨基酸沉淀物混合，并将合并后的样品送至质谱平台进行 LC-MS/MS 分析。

在分析质谱数据之前，将原始数据复制到一个新的电子表格中。然后在此电子表格中，保留包含登录号、唯一肽段数量、比较样本、比值变异性以及蛋白质描述的列，删除其余所有列。使用 Excel 的排序功能，按照肽段数量对数据进行排序，并删除仅含有一个或更少肽段的蛋白质条目。

然后按比值排序，并移除缺乏 SLAC 比值的蛋白质。接着，将 SLAC 比值转换为以 2 为底的对数值。使用公式：等于 log(括号内为 SLAC 比值，括号)，其中将 SLAC 比值替换为对应的单元格标识符。

然后在 Excel 文件中创建一个新列，计算所有样本对照列的 Log2 SLAC 比值，以将对照样本比值转换为样本对照比值。使用公式：等于 1 除以比值。打开 GraphPad Prism。

选择新的数据表和图表，在窗口左侧的列表中选择列，然后选择“输入导入数据”。选择将重复值堆叠成列的选项，然后按“创建”。

然后从 Excel 电子表格中选择并复制指定的两样本模拟 SLAC 比值的 log 值列，并粘贴到新的 Prism 文件中。接着，点击下拉的“插入”菜单，选择“新建分析”。在列分析下，选择“频率分布”。

保留默认选项，然后点击确定。在结果文件夹中，将生成一个新的直方图部分。选择频数分布部分，然后点击插入下拉菜单，选择“新建分析 XY 非线性回归曲线拟合”。

点击高斯分布，然后点击确定。在出现的结果窗口中，会显示均值和标准差。通过将1.96倍的标准差加到均值上生成一个阈值，然后返回到Excel文件。

创建一个名为“合并标签列A登录号”的新选项卡，并将各个独立实验中的所有登录号复制到此单一列中。接下来，选择“数据”选项卡，然后选择“删除重复项”选项。随后，为每个实验的SLAC比值、比值变异性以及蛋白质名称描述列创建相应的列。

在“描述”选项卡中，使用 VLOOKUP 公式收集每个登录号的描述信息。将公式向下拖动以填充各蛋白质的描述，然后使用该公式从各个实验中获取比值和变异性数据。为了在整合数据集中突出显示相互作用的蛋白质，请记录特定实验的阈值。

选择比值列，然后点击“开始”选项卡。接着选择“条件格式”，“突出显示单元格规则”，“更多规则”，然后选择“经典格式”，仅对包含单元格值大于或等于的单元格进行格式设置。在输入框中键入 1.96 倍标准差的数值，然后点击“确定”。

评估每个阳性相互作用的比值变异性。如果减去百分比变异性后导致某个命中值低于阈值，则应谨慎对待。

对每个结果列重复此操作，并比较不同实验中的结果；在两个或更多实验中均被鉴定出的蛋白质代表具有高可信度的相互作用。Western blot 分析证实了目标GFP标签蛋白的成功纯化。结合样品中未出现GAPDH条带，表明通过免疫沉淀步骤去除了非相互作用的蛋白质；而这些样品中EIF4G条带的存在，则表明已知的相互作用结合蛋白被保留了下来。

在两种同工型之间，多个已鉴定的真核起始因子4A（EIF4A）结合蛋白具有保守性。与EIF4A相互作用的蛋白质具有较高的LAC比值，而本实验中非特异性结合的蛋白质比值则低于0.96。在此起始因子复合物示意图中，通过SLAC氨基酸沉淀实验鉴定出的EIF4A结合蛋白以红色至白色渐变方式标示。

根据对数二 SLAC 比值，EIF4A1 和 EIF4A2 复合物的直接与间接结合伴侣蛋白均具有高覆盖度，这说明该方法在鉴定蛋白质相互作用方面具有高效性。在进行该实验操作时，需注意：尽管在数据分析阶段可对部分蛋白表达水平的差异进行一定补偿，但最好通过准确归一化蛋白上样量，并避免在洗涤步骤中丢失磁珠，从而从源头上避免此类差异的发生。