的蛋白质相互作用的合作伙伴在哺乳动物细胞中使用SILAC-免疫定量蛋白质组学鉴定

该程序的总体目标是确定给定目标蛋白质的蛋白质相互作用伴侣。这是通过首先在含有用碳和氮的不同稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的细胞培养基中培养细胞来实现的。第二步是转染、质粒并将目标蛋白或对照质粒包被到标记的细胞中。

接下来，裂解细胞并从裂解物中免疫沉淀样品。然后合并等体积的对照和样品免疫沉淀物，并提交进行 LC MS MS 分析。最后一步是分析质谱数据，以鉴定与目标蛋白质相互作用的蛋白质。

最终，细胞培养物或硅烷氨基酸沉淀中氨基酸的稳定同位素标记能够识别与组织培养细胞中目标蛋白质的大量直接和间接相互作用。与现有方法（如抽头标记）相比，该技术的主要优点是，研究人员无需从质谱分析中发送单个条带。这消除了一个重要的偏差来源，同时提高了灵敏度。

虽然这种方法可用于深入了解细胞蛋白质，但蛋白质相互作用也可以应用于其他系统，例如研究病原体宿主相互作用。首先刮取 SLAC 标记的 HEK 2 93 T 细胞，将目标 GFP 标记蛋白或 GFP 对照从细胞培养皿中表达到冰冷的 PBS 中，然后在 4 摄氏度下以 220 倍 G 离心细胞悬液 5 分钟，在 10 毫升冰冷的 PBS 中再洗涤细胞 3 次，将细胞沉淀重悬于 200 微升含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中3 次，浓度为 1 X，每毫升裂解缓冲液加入 5 μL RNA 混合物，在冰上孵育 5 分钟。然后将细胞裂解液在 4 摄氏度下以 13， 000 倍 G 离心 10 分钟，并保留上清液作为可溶性细胞裂解液。

使用 A BCA 测定法测量细胞裂解物的蛋白质浓度。然后使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液对最终体积为 500 μL 的每种样品裂解物中的蛋白质浓度进行标准化。向每种标准化的细胞裂解物中加入 500 微升含有 1 x 蛋白酶抑制剂混合物 3 的稀释缓冲液，以将总体积调节至 1 毫升。

在制备抗 GFP 微珠时将裂解物保存在冰上，并保留每个样品的 50 μL 等分试样，用于样品输入。涡旋珠浆液以重新悬浮珠子。然后使用带有末端截止口的 200 μL 移液器吸头将每个样品的 25 μL 微珠转移到新试管中。

对于每 25 μL 微珠浆液，加入 20 体积的稀释缓冲液进行洗涤，以 2， 700 倍 G 离心珠子 5 分钟。用 20 体积的稀释缓冲液将磁珠洗涤至更多次。接下来，每 25 μL 微珠浆液添加 100 μL 稀释缓冲液。

然后使用末端截止的 200 微升移液器吸头将 85 微升重悬的微珠浆液转移到每个 SLAC 标记的样品裂解物中。样品与磁珠一起在旋转器上于 4 摄氏度下孵育 2 小时，样品与磁珠一起孵育后，将样品在 4 摄氏度下以 2， 700 倍 G 离心 5 分钟。保留 50 μL 上清液作为未结合的样品，并丢弃剩余的上清液。

将每管中的微珠重悬于 1 mL 稀释缓冲液中，然后在 4 摄氏度下以 2， 700 倍 G 离心 5 分钟。重复此洗涤步骤两次，以从珠子中洗脱蛋白质。向每个样品中加入 50 μL 两种 XSDS 上样缓冲液，并在 95 摄氏度下加热 10 分钟。

加热完成后，将每个样品在 4 摄氏度下以 2， 700 倍 G 离心 5 分钟。将上清液转移到预润滑的试管中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到准备好提交进行 MS 分析。然后混合等体积的对照和样品氨基沉淀物，并将合并后的样品送至质谱机构进行 LC MS MS 分析。

在分析质谱数据之前，请将原始数据复制到新的电子表格中。然后，在此电子表格中，删除除包含登录号、独特肽比数、比较样品、比值变异性和蛋白质描述的列之外的所有列。使用 Excel 排序功能按肽段数量对数据进行排序，并删除缺少多个肽段的蛋白质的条目。

然后按比率排序并去除缺乏 SLAC 比率的蛋白质。接下来，将 slac 比率转换为对 log 两个值。使用公式等于对数括号、SLAC 比率 2 和括号，其中 SLAC 比率代替信元标识符。

然后在 Excel 文件中创建一个新列，并计算所有样本模拟列的对数两个 SLAC 比率，以便将模拟样本比率转换为样本模拟比率。使用公式等于 1 除以 ratio。打开 GraphPad 棱镜。

选择 new data table and graph 从窗口左侧的列表中选择 select column，然后选择输入导入数据。输入 stacked into columns （堆叠到列中的副本值） 选项。按 create。

然后从 Excel 电子表格中选择给定的对数两个样本模拟 SLAC 比率列并将其复制到新的 Prism 文件中。接下来，单击下拉插入菜单并选择 New analysis。在 column analysis （列分析） 下，选择 frequency distribution （频率分布）。

保留默认选项，然后单击 Ok.在 results 文件夹中，将生成一个新的直方图部分。选择 frequency distribution 部分，然后单击下拉插入菜单并选择 New analysis XY non-linear regression curve fit。

单击 Gaussian distribution（高斯分布），然后单击 okay（确定）。在显示的结果窗口中，给出了平均值和标准差。通过将 1.96 个标准差添加到 Excel 文件的平均回报来生成阈值。

创建一个名为 combined label column A accession 的新选项卡，并将每个单独实验中的所有入藏号复制到此单个列中。接下来，选择 data 选项卡，然后选择 remove duplicates 选项。然后为每个实验的 SLAC 比率和比率变异性以及蛋白质名称描述列创建列。

在描述选项卡中，使用 VLOOKUP 公式收集每个入藏号的描述。将公式向下拖动列以填写蛋白质描述，然后使用此公式从各个实验中获取比率和变异性数据。要突出显示组合数据集中的相互作用蛋白质，请记下特定实验的阈值。

选择 ratio 列，然后单击 主页 选项卡。后跟条件格式，突出显示单元格规则更多规则，然后选择 样式 经典格式 仅包含大于或等于 的销售价值 的销售。在该框中，键入 1.96 标准差值，然后单击 "确定"。

评估每个正交互作用的比率变异性。如果减去百分比可变性，则会使命中低于阈值。应谨慎对待。

对每个结果列重复此作，并在实验中比较在两个或多个实验中鉴定出的蛋白质代表高置信度交互作用。Western blot 分析证实了 GFP 标记的目标蛋白的纯化。结合样品中缺少间隙 DH 条带表明免疫沉淀步骤从样品中去除了非相互作用的蛋白质，而这些样品中存在 EIF 4G 条带表明保留了已知的相互作用结合伴侣。

鉴定的几种 EIF 4 A 结合蛋白在两种亚型之间是保守的。与 EIF 4 A 相互作用的蛋白质通过高 LAC 比率来识别，而本实验中的非特异性结合蛋白质的比率低于 0.96。在起始因子复合物的图中，在 SLAC 氨基沉淀实验中鉴定的 EIF 四个 A 结合蛋白以红色到白色着色。

根据对数 2 SLAC 比率，EIF 4 A 1 和 2 复合物的直接和间接结合伴侣的高覆盖率说明了这种方法在识别蛋白质相互作用方面的有效性在尝试此过程时，重要的是要记住，虽然蛋白质水平的一些变化可以在数据分析阶段得到补偿， 最好通过确保蛋白质输入水平的准确标准化并避免在洗涤步骤中丢失 AROS 珠子来避免这种情况。