使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激
2020年5月12日
硫代巴比妥酸反应物质测定的目的是通过使用可见光波长分光光度法在532nm处测量脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的产生来评估生物样品中的氧化应激。这里描述的方法可应用于人血清、细胞裂解物和低密度脂蛋白。
因此，TBARS 检测最适合用于生物样品中氧化应激的实验室内一般评估，其中直接比较一起储存和处理的样品之间的相对 TBARS 水平。与市售试剂盒相比，这些检测试剂盒的成本极低，约为 3 个样品，检测 96 个样品，成本约为 400，并且只允许分析单个批次样品。此处描述的方法可以进一步适用于特定应用，包括生物样本稳定性研究，以及在分析前添加抗氧化剂或其他类型的样品防腐剂是合适或强制性的。
为避免结果高度可变，请准备新鲜试剂，确保显色试剂的 pH 值不大于 4，并在测量吸光度之前去除 nidese 膨胀板中的任何气泡。首先制备 0.8% 硫代巴比妥酸水溶液。通过将 4 克氢氧化钠珠溶解在 20 毫升水中来制备 5 摩尔氢氧化钠溶液。
将溶液储存在塑料容器中。它应该是每批新鲜准备的。将 4 克硫代巴比妥酸加入 450 毫升去离子水中，并使用磁力搅拌棒轻轻溶解。
以 100 微升的增量缓慢加入约 4 毫升氢氧化钠溶液，在硫代巴比妥酸颗粒溶解时检查 pH 值。继续加入氢氧化钠，直到所有颗粒溶解。用 pH 试纸验证溶液的 pH 值不高于 4，然后用去离子水将最终体积调至 500 毫升，并将硫代巴比妥巴蛮酸水溶液储存在室温下。
在两毫升卡口盖聚丙烯管中制备 MDA 双二甲基缩醛标准曲线溶液。按照正文手稿中的说明，用水稀释 200 微摩尔的储备溶液。涡旋样品。
标记待分析样品的玻璃管，然后向每管中加入 100 微升制备的样品。向每个样品中加入 200 微升 8.1%SDS，并以圆周运动轻轻旋转玻璃管以混合。向每个样品中加入 1.5 毫升 3.5 摩尔乙酸钠缓冲液，然后加入 1.5 毫升 0.8% 硫代巴比妥酸水溶液。
加入 700 微升去离子水，使每管中的最终浓度达到 4 毫升。盖紧玻璃管，并在设置为 95 摄氏度的加热块中孵育 1 小时。用铝箔盖住试管以防止冷凝，然后从块中取出试管并在冰上孵育 30 分钟。
孵育后，将样品和标准品在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 G 离心 10 分钟。将每管中的 150 微升上清液转移到 96 孔板中的孔中，用移液器吸头去除任何气泡。测量样品在 532 纳米处的吸光度，然后从所有其他吸收剂读数中减去空白样品的平均吸收剂读数。
创建标准曲线并使用它来计算未知样品浓度。生成 MDA 双二甲基乙酰标准曲线，以确定三种不同生物样品中检测限、分析灵敏度和氧化水平。在不同日期对 3 个样品共进行了 9 次 TBARS 检测。
为了确定检测限，在三个不同的日期测量空白样品的吸光度。提供可检测的非噪声吸收信号所需的 TBARS 物质的最低浓度为 1.1 微摩尔。该测定的灵敏度约为每微摩尔浓度增加 0.0016 吸收剂单位。
TBARS 检测可用于检测各种生物基质的脂质过氧化变化。为了证明这种二氯化铜用于诱导人血清 HEPG2 细胞裂解物和低密度脂蛋白的体外氧化。对含有 EDTA 的 LDL 样品进行 TBARS 分析，铜、两种处理和未处理的 LDL 样品之间的 TBARS 水平没有变化。
然而，在通过旋转过滤去除 EDTA 后，LDL 经历了铜 2 介导的氧化。为了说明 TBARS 检测在人血清中的动态范围，向样品中加入浓度为 2 毫摩尔铜 2 离子的离子，导致 TBARS 增加 6 至 7 倍。尝试此方案时，请勿将样品在冰上放置超过 10 分钟，离心后将其置于室温下。
对于最初未一起收集、处理和存储的生物样本批次或子集，应统计评估批次效应数据，以确保人为氧化不会影响结果。有意识的可量化体外氧化去除低密度脂蛋白，可以了解氧化如何影响其功能生物学。
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概述
硫代巴比土酸反应物质（TBARS）测定是通过测量脂质过氧化产物来评估生物样本中氧化应激的一种经济有效的方法。该方法特别适用于比较同时处理的样本中相对TBARS水平。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 氧化应激评估
- 分析化学
背景
- TBARS测定测量丙二醛作为氧化应激的指标。
- 可以应用于各种生物样本，包括人类血清和细胞裂解物。
- 与商业试剂盒相比，该测定是低成本的。
- 新鲜试剂和特定pH条件对于准确结果至关重要。
研究目的
- 提供一种可靠的方法来评估氧化应激。
- 使得在相似条件下处理的样本之间的TBARS水平比较成为可能。
- 适应该方法用于特定应用，包括稳定性研究。
使用的方法
- 制备0.8%的硫代巴比土酸水溶液。
- 制备五摩尔氢氧化钠溶液。
- 使用可见波长分光光度法测量532 nm的吸光度。
- 确保试剂新鲜且pH保持在四以下。
主要结果
- TBARS测定提供了氧化应激水平的直接比较。
- 经济有效的测试允许分析多个样本。
- 适用于各种生物学应用。
- 新鲜试剂最大限度地减少结果的变异性。
结论
- TBARS测定是评估氧化应激的有价值工具。
- 它相比商业替代品提供了显著的成本节约。
- 适当的准备和处理对于可靠的结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
The TBARS assay provides a cost-effective, intra-laboratory method for relative oxidative stress assessment in biological samples, supporting early discovery workflows where comparative lipid peroxidation data informs target validation and mechanistic de-risking. Its low cost and adaptability enable reproducible screening of compound effects across sample sets, reducing false positives in lead identification. Proper reagent handling and pH control ensure data reliability for go/no-go decisions in preclinical prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lipid peroxidation changes in response to compound treatment.
- Operational Value: Supports pathway clarification through comparative TBARS levels in disease-relevant systems like human serum and cell lysates.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by identifying compounds that modulate oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing baseline oxidative stress metrics.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fresh reagent preparation and pH ≤4 control.
- Scalability Value: Enables high-throughput screening readiness with 96-sample processing at ~$3 per batch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detectable TBARS changes in LDL oxidation models upon EDTA removal.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying invitro oxidation effects on lipoprotein function.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions via dose-responsive TBARS increases (e.g., 6-7 fold with 2 mM Cu²⁺ in serum).
Pipeline & Workflow Integration
The TBARS assay fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, providing oxidative stress readouts that help prioritize compounds before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring lipid peroxidation as a functional readout of pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, low-cost processing of biospecimens stored and processed together.
- Analytics: Generates quantitative absorbance measurements at 532 nm, enabling LOD of 1.1 µM and sensitivity of 0.0016 AU/µM for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling LDL oxidation to understand functional biological impacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for batch-wise oxidative stress assessment across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct comparison of oxidative stress levels.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fresh reagent preparation and controlled incubation (95°C, 1 hr).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid peroxidation pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via detection of concentration-dependent TBARS changes in biological matrices.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reagent preparation, pH control, and spectrophotometric measurement.
- Needs heating block (95°C), centrifuge, and visible wavelength spectrophotometer.
- Demands cross-team standardization of sample storage and processing to avoid batch effects.
- Requires adaptation considerations for biospecimens with antioxidants or preservatives.
- Limited to relative comparisons; absolute quantification requires MDA-bis-acetal standard curves.
