Name: 使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学习使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激水平。该方法成本低廉，适用于人血清和细胞裂解液等多种样本类型，通过测量532纳米吸光度实现脂质过氧化产物的定量分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究部分得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助号 R33 CA217702 以及学生发展最大化倡议（IMSD）项目的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

人血清样本是在获得机构审查委员会批准并遵循《赫尔辛基宣言》原则的前提下，从知情同意的志愿者处采集的。样本在转移至分析实验室之前已进行编码并去除了个人身份信息。
1. 样品制备
<ol>
	<li>HepG2 细胞裂解液
	<ol>
		<li>在 16 个 T75 培养瓶中，每瓶接种约 10 × 106 个 HepG2 细胞，每瓶加入 14 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养基，培养 2 天。</li>
		<li>配制 RIPA 裂解缓冲液：取一个 50 mL 离心管，加入 1.5 mL 5 M NaCl、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH = 7）、500 μL NP-40 试剂，然后用去离子水定容至 50 mL。</li>
		<li>配制裂解缓冲液：将 20 mL RIPA 缓冲液分装至一个 50 mL 离心管中，加入 200 μL 100× 蛋白酶抑制剂溶液，以抑制蛋白质和脂质降解。4 °C 保存。 
		注意：该裂解缓冲液与 TBARS 试剂兼容，不会干扰 532 nm 处的吸光度。若计划使用其他裂解缓冲液或向其中添加额外成分，需先进行预实验验证其组分与 TBARS 检测的兼容性。</li>
		<li>吸除含 10% FBS 的培养基，用 5 mL 冷的无菌 1× PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
		<li>向含细胞的 T75 培养瓶中加入 1 mL 裂解缓冲液，室温（RT）孵育 10 分钟，期间持续轻柔摇晃，确保缓冲液均匀分布。</li>
		<li>将裂解液收集至适当标记的 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>在室温下以 5,000 × g 离心 10 分钟，收集细胞碎片，将上清液转移至一个 15 mL 离心管中。</li>
		<li>使用真空浓缩仪（Speed Vac）在 50 °C 和 3 mbar 条件下将细胞裂解液上清浓缩 4 倍，并将 94 μL 每份分装至 2 mL 带盖聚丙烯离心管中。样品保存于 -80 °C，待用于体外氧化实验和/或 TBARS 检测。 
		注意：为避免浓缩细胞裂解&#160;上清液，也可使用 3 mL 1× 胰蛋白酶消化细胞，用 6 mL 培养基中和，再用 5 mL 冷 PBS 洗涤 2 次。将细胞沉淀重悬于 250 μL 裂解缓冲液中，然后执行步骤 1.1.6 和 1.1.7。</li>
		<li>在乙酸溶液（pH = 4）中配制 35 mM CuCl2 储存液。
		<ol>
			<li>配制乙酸溶液（pH = 4）：将 1 μL 冰乙酸加入 100 mL 去离子水中（pH 应约为 4，需用 pH 计确认），根据需要添加水或乙酸调节 pH 至 4。</li>
			<li>称取约 0.1936 g 二氯化铜（CuCl2），溶于 10 mL 乙酸溶液（pH = 4）中，配制成 144 mM CuCl2 储存液。从中取出 490 μL，加入 1,510 μL 乙酸溶液（pH = 4）中，得到 35 mM CuCl2 溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从 35 mM CuCl2 储存液中取 6 μL，加入 6 份含 94 μL 细胞裂解液的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 2 mM。另取 6 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 94 μL 细胞裂解液的样品中作为对照。最终细胞裂解液体积应为 100 μL，用于 TBARS 检测。 
		注意：将 35 mM CuCl2 储存液配制于乙酸（pH = 4）中，可防止氢氧化铜沉淀。</li>
		<li>将样品在 37 °C 烤箱中孵育 24 小时，对每份最终体积为 100 μL 的样品进行 TBARS 检测。</li>
		<li>在不同日期重复步骤 1.1.9 和 1.1.11 两次，以验证 HepG2 细胞裂解液 TBARS 检测的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低密度脂蛋白 
	注意：通常，预纯化的低密度脂蛋白（LDL）含有一定量的 EDTA。本实验所用 LDL 样品含 0.01% EDTA。EDTA 可抑制体外 Cu(II) 介导的 LDL 氧化，因此在实验或分析前可能需要去除 LDL 样品中的 EDTA。步骤 1.2.1–1.2.5 描述了该过程。 
	警告：氢氧化钠具有腐蚀性，可引起皮肤和眼睛刺激。请使用适当的个人防护装备。
	<ol>
		<li>从 5.51 mg/mL 的 LDL 储存液（蛋白浓度通过改良 Lowry 法测定，以 BSA 为标准）中取 24 μL，分装至适当标记的 1 mL 带盖聚丙烯离心管中。根据需要制备足够份数，4 °C 保存，待用于氧化实验和/或 TBARS 检测。</li>
		<li>配制 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，用 NaOH 颗粒调节 pH 至 7）：将 4.39 g NaCl 溶于 0.49 L 水中，加入 1.19 g HEPES，用磁力搅拌器充分溶解。加入氢氧化钠颗粒调节 pH 至 7，再加水定容至 0.5 L。4 °C 保存，3 个月内使用。</li>
		<li>向分装的 LDL 样品中加入 476 μL 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7），使总体积达 500 μL。将稀释后的 LDL 样品加入 0.5 mL 离心超滤装置（截留分子量 100K）中。</li>
		<li>在室温下以 14,000 × g 离心 10 分钟，保留约 30 μL 滤留液体积。用 480 μL 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7）重悬样品，再次以 14,000 × g 离心 10 分钟。重复此步骤共 4 次（即共进行 4 次超滤）。</li>
		<li>将滤膜装置倒置放入新的 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，以 1,000 × g 离心 2 分钟，收集 LDL 样品（最终体积约 30 μL）。</li>
		<li>将样品分装至适当标记的 1 mL 离心管中，每管加入 20 μL 水，使最终体积为 50 μL。</li>
		<li>在乙酸溶液（pH = 4）中配制 200 μM CuCl2 储存液
		<ol>
			<li>配制乙酸溶液（pH = 4）：参见步骤 1.1.9.1。</li>
			<li>配制 144 mM CuCl2 储存液（参见步骤 1.1.9.2），从中取 5.5 μL，溶于 4 mL 乙酸溶液（pH = 4）中，定容至 4 mL，得到 200 μM 溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从 200 μM CuCl2 储存液中取 2.7 μL，加入 6 份含 50 μL LDL 的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 10 μM。另取 2.7 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 50 μL LDL 的样品中作为对照。</li>
		<li>将 LDL 样品在 37 °C 烤箱中孵育 2 小时。孵育结束后，用 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7）将每份样品补至 100 μL，立即进行 TBARS 检测。</li>
		<li>在两个不同日期重复步骤 1.2.3–1.2.9 两次，以验证 TBARS 检测的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人血清
	<ol>
		<li>从人血清样品中取 94 μL 每份，分装至 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，-80 °C 保存。</li>
		<li>在乙酸溶液（pH = 4）中配制 35 mM CuCl2 储存液：参见步骤 1.1.9。</li>
		<li>从 CuCl2 储存液中取 6 μL，加入 6 份含 94 μL 人血清的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 2 mM。另取 6 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 94 μL 人血清的样品中作为对照。</li>
		<li>将人血清样品在 37 °C 烤箱中孵育 24 小时，通过 TBARS 检测（第 4 节）测定氧化水平。</li>
		<li>在两个不同日期重复步骤 1.3.2–1.3.4 两次，以确定 TBARS 检测的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 试剂准备
警告：硫代巴比妥酸会引起皮肤和眼睛刺激，吸入或经皮肤吸收可能有害。吸入乙酸可能损伤内脏器官。所有酸溶液均须在通风橱中配制。
<ol>
	<li>8.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液的制备
	<ol>
		<li>称取 32.4 g SDS，加入 350 mL 去离子水中，于烧杯中溶解。使用磁力搅拌子轻轻搅拌以溶解 SDS，避免产生气泡。用去离子水定容至 400 mL，将 SDS 溶液在室温下储存。 
		注意：此处制备了过量的 8.1% SDS 溶液；然而，对于 96 个样品，仅需约 20 mL 的 8.1% SDS 溶液。请根据待分析样品的数量配制相应体积的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3.5 M 醋酸钠缓冲液 (pH = 4) 的制备
	<ol>
		<li>在烧杯中将 100 mL 冰醋酸稀释于 350 mL 去离子水中。使用磁力搅拌子轻轻搅拌溶解。</li>
		<li>使用氢氧化钠颗粒与水配制 6.5 M NaOH 溶液：将 13 g NaOH 颗粒溶解于 40 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 50 mL。</li>
		<li>在磁力搅拌下，缓慢向醋酸溶液中加入约 46 mL 的 6.5 M NaOH 溶液（应使 pH 升至 4，但需使用 pH 计边测量边缓慢添加 NaOH 溶液以确认 pH 值）。</li>
		<li>用去离子水定容至 500 mL，将醋酸钠缓冲液在室温下储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.8% 硫代巴比妥酸水溶液 (调节至 pH = 4) 的制备 
	注意：此步骤中硫代巴比妥酸溶液的配制针对大体积进行了优化，因为将要分析大量样品（108 个样品，不包括标准品）。请根据计划分析的样品数量配制相应体积的溶液。
	<ol>
		<li>使用氢氧化钠颗粒和水配制 5 M 氢氧化钠溶液：将 4 g 氢氧化钠颗粒溶于 20 mL 水中定容。储存于塑料容器中。该溶液应每次使用前新鲜配制。</li>
		<li>称取 4 g 硫代巴比妥酸，加入 450 mL 去离子水。使用磁力搅拌子轻轻搅拌溶解。 
		注意：该溶液最终将定容至 500 mL。</li>
		<li>在磁力搅拌下溶解硫代巴比妥酸的过程中，以 100 μL 为增量，缓慢逐滴加入约 3 mL 的 5 M NaOH 溶液。加入 NaOH 溶液后，硫代巴比妥酸颗粒将开始溶解。</li>
		<li>若硫代巴比妥酸颗粒仍未完全溶解，继续以 100 μL 为增量添加 5 M NaOH 溶液，直至所有硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。对于此特定体积的溶液，共需加入 4 mL 的 5 M NaOH 溶液才能使硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。 
		注意：在此浓度下，除非 pH 接近 4，否则硫代巴比妥酸不会完全溶解。</li>
		<li>当所有硫代巴比妥酸&#160;颗粒完全溶解后，停止添加 NaOH。避免 pH 超过 4。可通过从正在搅拌的硫代巴比妥酸&#160;溶液中取 1 μL 滴于 pH 试纸上，以验证最终 pH 值。</li>
		<li>用去离子水定容至 500 mL，将 0.8% 硫代巴比妥酸水溶液在室温下储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 丙二醛二（二甲基缩醛）标准样品制备
注意：丙二醛（MDA）不稳定，无法直接购买获得。然而，存在多种可商业获取的 MDA 化学形式，例如丙二醛四丁基铵盐、丙二醛双（二甲基缩醛）和丙二醛双（二乙基缩醛）。在这三种化学形式中，本文采用丙二醛双（二甲基缩醛），因为大多数研究均使用这一标准21,22。若选择使用另外两种 MDA 化学形式，应事先验证其适用性。
<ol>
	<li>通过将92 μL纯MDA bis(dimethyl acetal)溶于1 L去离子水中，配制550 μM MDA bis(dimethyl acetal)储备液。使用磁力搅拌器彻底混匀溶液10分钟。将溶液储存于4 °C，且在1个月内使用。</li>
	<li>取726 μL的550 μM MDA bis(dimethyl acetal)储备液，加入1274 μL去离子水中，稀释配制200 μM MDA bis(dimethyl acetal)溶液。每次进行TBARS检测时，均应新鲜配制该200 μM MDA bis(dimethyl acetal)溶液。</li>
	<li>标准曲线制备：取八个2 mL带盖聚丙烯管，标记为A至H。根据表1所述，从200 μM储备液中加入相应体积的MDA bis(dimethyl acetal)，并用水稀释。</li>
	<li>取八支玻璃管（13 mm × 100 mm），标记为A–H，然后向对应管中加入100 μL标准品溶液。对空白标准品（样品A）进行六次重复测定，以计算TBARS检测的检出限。 
	注意：此步骤可暂停，但不超过1小时。</li>
</ol>
4. TBARS 测定
注意：一旦开始TBARS检测，应连续完成，不得中断。
<ol>
	<li>根据待分析样品的数量取相应数量的玻璃管，并用样品名称进行标记。然后，向每根玻璃管中加入100 μL的各已制备样品（如上所述）。</li>
	<li>向每个样品和标准品中加入200 μL的8.1% SDS溶液，并轻轻旋转摇动玻璃管，使样品充分混匀。</li>
	<li>向每个样品和标准品中加入1.5 mL的3.5 M乙酸钠缓冲液（pH = 4）。</li>
	<li>向每个样品和标准品中加入1.5 mL的0.8%硫代巴比妥酸水溶液（pH = 4）。</li>
	<li>通过加入700 μL去离子水，将每个样品和标准品的终体积调整至4 mL。</li>
	<li>将每根玻璃管盖紧，置于设定为95 °C的加热块中孵育1小时。用铝箔包裹玻璃管顶部，以防止冷凝水形成。</li>
	<li>从加热块中取出玻璃管，置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1500 × g离心样品和标准品10分钟。离心后，将含有样品和标准品的玻璃管置于室温下保存。 
	注意：若将样品保持在冰上或4 °C条件下，会导致样品或标准品完全沉淀。</li>
	<li>离心后立即从每根管中取出150 μL上清液，转移至96孔板的各个独立孔中。</li>
	<li>使用移液器吸头去除每个孔中的气泡。 
	注意：孔中存在气泡会导致吸光度读数不一致，从而引起检测结果精密度降低。</li>
	<li>在532 nm波长下测定吸光度。用所有其他样品的吸光度值减去空白样品的平均吸光度值。</li>
	<li>通过绘制532 nm处扣除空白后的吸光度值与各标准品已知浓度的关系图，建立标准曲线。采用线性回归拟合数据点。根据标准曲线所得线性回归方程，计算未知样品的浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+%28MDA%29+and+relatives+in+biological+samples%3A+Analytical+and+biological+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li>
<li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li>
<li>Morales, M., Munné-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malondialdehyde%3A+Facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li>
<li>Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+estimating+lipid+peroxidation%3A+An+analysis+of+merits+and+demerits%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits.</a> Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).</li>
<li>Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDasgupta%2C+A+%22Antioxidants+in+Food%2C+Vitamins+and+Supplements%22">Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements</a>. , 19-40 (2014).</li>
<li>Wade, C. R., van Rij, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+malondialdehyde%2C+lipid+peroxides%2C+and+the+thiobarbituric+acid+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction.</a> Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+malondialdehyde+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+in+psychological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders.</a> BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+Concerning+%22Comparison+of+Airway+and+Systemic+Malondialdehyde+Levels+for+Assessment+of+Oxidative+Stress+in+Cystic+Fibrosis%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis".</a> Lung. 193 (5), 867-868 (2015).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+%22Salivary+8-hydroxy-2-deoxyguanosine%2C+malondialdehyde%2C+vitamin+C%2C+and+vitamin+E+in+oral+pre-cancer+and+cancer%3A+diagnostic+value+and+free+radical+mechanism+of+action%22%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oral+Investigations%22%5BJournal%5D)">Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action".</a> Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+%22An+Investigation+into+the+Serum+Thioredoxin+Superoxide+Dismutase%2C+Malondialdehyde%2C+and+Advanced+Oxidation+Protein+Products+in+Patients+with+Breast+Cancer%22%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer".</a> Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).</li>
<li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+analytical+procedures+on+the+repeatability+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).</li>
<li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+reason+for+the+low+reproducibility+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).</li>
<li>Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+steps+in+fluorometric+determination+of+thiobarbituric+acid-+reactive+substances+in+serum%3A+Importance+of+extraction+pH+and+influence+of+sample+preservation+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage.</a> Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).</li>
<li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li>
<li>Buege, J. A., Aust, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsomal+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microsomal lipid peroxidation.</a> Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-Radical+Damage+to+Lipids%2C+Amino-Acids%2C+Carbohydrates+and+Nucleic-Acids+Determined+by+Thiobarbituric+Acid+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity.</a> International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+malondialdehyde+as+an+oxidative+stress+biomarker+in+oral+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res+Dent+Clin+Dent+Prospects%22%5BJournal%5D)">Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases.</a> J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).</li>
<li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture%3A+How+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li>
<li>Lee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+oxidative+stress+in+human+cardiovascular+disease%3A+methodological+aspects+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations.</a> Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).</li>
<li>Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li>
<li>Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-thiobarbituric+acid+test+for+lipid+oxidation+in+food%3A+Synthesis+and+spectroscopic+study+of+2-thiobarbituric+acid-malonaldehyde+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Oil+Chemists+Society%22%5BJournal%5D)">2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).</li>
<li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipid+peroxidation+product+as+a+potential+trigger+of+the+p53+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).</li>
<li>Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Fundamentals+of+Analytical+Chemistry.+9th+ed%22">Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed</a>. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Principles+of+Instrumental+Analysis.+6th+ed%22">Principles of Instrumental Analysis. 6th ed</a>. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).</li>
<li>Seibig, S., Van Eldik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+%5BFeII%28edta%29%5D+Oxidation+by+Molecular+Oxygen+Revisited.+New+Evidence+for+a+Multistep+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li>
<li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-S-Cys-Albumin%3A+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li>
<li>Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYagi%2C+K+%22Free+Radical+and+Antioxidant+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).</li>
<li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li>
<li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li>
<li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li>
<li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal%2C+malonaldehyde+and+related+aldehydes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li>
<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li>
<li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li>
<li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS%2FMS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+%28MDA%29+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization%3A+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15%28S%29-8-iso-prostaglandin+F2%CE%B1+and+nitric+oxide+%28NO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li>
<li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+%28F+2-isoprostanes%29+in+plasma+during+collection+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li>
<li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin%3A+A+role+for+autoxidative+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li>
<li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malondialdehyde+in+Stored+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li>
<li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+GC-MS%2FMS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma%3A+Effects+of+long-term+L-arginine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益或其他利益冲突。

尽管存在诸多局限性1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19，且不适合在不同实验室之间进行比较，TBARS 检测仍是测定生物样本中氧化应激的最古老29,</su...

脂质过氧化是一种自由基（如活性氧和活性氮）攻击脂质中碳-碳双键的过程，该过程涉及从碳原子上夺取一个氢原子并插入一个氧分子。这一过程产生一系列复杂的产物，主要包括脂质过氧自由基和氢过氧化物等初级产物，以及丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛等主要的次级产物1。
由于丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）反应迅速，它已被广泛用作生物医学研究中脂质过氧化的标志物。该反应生成MDA-TBA2复合物，在可见光谱532 nm处有吸收峰，并产生红粉色2。除MDA外，脂质过氧化产生的其他分子也可与TBA反应，并在532 nm处吸收光，从而贡献于所测得的总吸收信号。类似地，MDA还可与大多数其他主要类别的生物分子发生反应，可能限制其与TBA反应的可及性3,4。因此，这种传统检测方法通常被认为仅用于测定“硫代巴比妥酸反应性物质”（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）5。
当正确实施和解读时，TBARS 检测通常被认为是反映生物样本中氧化应激总体水平的良好指标6。然而，正如 Khoubnasabjafari 及其他研究者所记录，TBARS 检测常以容易导致不可靠结论的方式进行和解读3,4,7,8,9,10,11。造成这一问题的主要原因在于与样本相关的分析前变量，以及该检测方法缺乏稳健性，即实验方案中看似微小的变动就可能导致检测结果发生显著变化1,7,12,13。
与生物样本处理和储存相关的分析前变量（例如，血液血浆暂时保存在 -20 °C）14,15 可能对 TBARS 检测结果产生重大影响16,17；影响程度之大，以至于除非有明确的实验室间分析验证数据支持，否则不应在不同实验室之间比较 TBARS 检测结果。这一建议类似于 Western blot 的常规使用和解读方式：条带密度的比较仅在同一次印迹内，或可能在同一实验室内部的研究中有效，而在不同实验室之间比较条带密度通常被视为无效的做法。
一些研究者指出，通过TBARS法测定的MDA水平根本无法满足可接受生物标志物所需的分析或临床标准3,9,10,18,19。事实上，如果该检测方法不是在50多年前开发出来的，它很可能不会获得如今如此广泛的应用和默认的认可。尽管目前已有其他在分析灵敏度、特异性和稳健性方面更优的检测方法用于评估氧化应激，但基于532 nm处吸光度测定的TBARS法仍然是迄今为止最常用的脂质过氧化检测方法之一20，从而用于评估氧化应激水平。
TBARS 检测目前仅能以价格昂贵的试剂盒形式获得（超过 400 美元），且试剂盒说明书并未提供所用试剂大多数浓度的详细信息。此外，试剂盒所提供的试剂仅够进行一次实验，因为每个试剂盒只能制作一条比色标准曲线。这对于需要在不同时间点测定少量样品氧化水平的研究人员而言可能存在问题，因为同一标准曲线无法在多个时间点重复使用，因此必须为多次实验分别购买多个试剂盒。目前，除非购买昂贵的试剂盒，否则文献中尚无详细的 TBARS 检测操作方案可供参考。过去虽有部分研究人员粗略描述过 TBARS 检测的操作方法21,22，但尚未有完整详尽的操作流程或全面的视频教程，介绍如何在不依赖昂贵试剂盒的情况下完成 TBARS 检测。
本文报道了一种详细且经过分析验证的专用方法，用于以简单、可重复且经济的方式进行TBARS测定。通过Cu(II)离子处理人血清、HepG2细胞裂解物和低密度脂蛋白后其脂质过氧化水平的变化，展示了TBARS测定的典型应用实例。结果表明，该TBARS测定方法在不同日期间具有良好的一致性和可重复性。

<table><tbody><tr><td>1x 无菌 PBS，pH 7.4，1 L</td><td>VWR, PA</td><td>101642--262</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>50 mL 自立式离心管</td><td>Corning, NY</td><td>CLS430897</td><td>通用材料</td></tr><tr><td>96 孔板，未处理，透明，带盖，非无菌</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>280895</td><td>用于测定吸光度</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心过滤装置</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>UFC510024</td><td>LDL 纯化</td></tr><tr><td>玻璃管帽</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>14-930-15D</td><td>用于 TBARS 测定</td></tr><tr><td>氯化铜 II（Copper II Chloride）</td><td>SIGMA, MO</td><td>222011-250G</td><td>用于诱导氧化</td></tr><tr><td>培养管，一次性，带螺旋盖，硼硅酸盐玻璃（13 x 100 mm）</td><td>VWR, PA</td><td>53283-800</td><td>用于 TBARS 测定</td></tr><tr><td>伊格尔最低必需培养基（EMEM）</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>HepG2 细胞培养基</td></tr><tr><td>Eppendorf 安全锁扣管，1.5 mL</td><td>eppendorf, NY</td><td>22363204</td><td>通用材料</td></tr><tr><td>Eppendorf 安全锁扣管，2.0 mL</td><td>Genesee Scientific, CA</td><td>22363352</td><td>通用材料</td></tr><tr><td>胎牛血清，美国来源</td><td>Omega Scientific, CA</td><td>FB-11</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>SIGMA, MO</td><td>27225-1L-R</td><td>TBARS 试剂</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100x）</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>87786</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA, MO</td><td>H3375-250G</td><td>LDL 溶剂</td></tr><tr><td>HepG2 细胞</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>生物基质原型</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>A144-212</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>Legend Micro 17 离心机</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>75002431</td><td>通用材料</td></tr><tr><td>低密度脂蛋白，人血浆来源</td><td>Athens Research &amp; Technology, GA</td><td>12-16-120412</td><td>生物基质原型</td></tr><tr><td>磁力搅拌子，八角形 6 件装组合</td><td>VWR, PA</td><td>58948-025</td><td>通用材料</td></tr><tr><td>丙二醛双（二甲基缩醛）</td><td>SIGMA, MO</td><td>8207560250</td><td>TBARS 标准品</td></tr><tr><td>Multiskan Go 微孔板分光光度计</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>51119200</td><td>用于测定吸光度</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>EMD Millipore Corp, MA</td><td>492016-100ML</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>SIGMA, MO</td><td>S7653-1KG</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>SIGMA, MO</td><td>436143-100G</td><td>TBARS 试剂</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>SIGMA, MO</td><td>367176-2.5KG</td><td>TBARS 试剂</td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩仪</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>SC250EXP</td><td>用于浓缩细胞裂解液</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶，组织培养处理，250 mL，带滤膜瓶盖</td><td>USA Scientific, FL</td><td>658175</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>硫代巴比妥酸</td><td>SIGMA, MO</td><td>T5500-100G</td><td>TBARS 试剂</td></tr><tr><td>TRIS 碱</td><td>Fluka, GA</td><td>93362</td><td>细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（1x）</td><td>VWR, PA</td><td>16777-166</td><td>用于解离 HepG2 细胞</td></tr></tbody></table>

使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激

Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

尽管硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法在分析特异性和稳健性方面存在局限性，但它仍被广泛用作生物流体中脂质过氧化的通用指标。只要样本得到妥善处理和储存，该方法通常被认为是反映生物样本中氧化应激水平的良好指标。该检测基于脂质过氧化产物（主要是丙二醛，MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应，生成称为TBARS的MDA-TBA2加合物。TBARS呈现红色至粉红色，可在532 nm波长下通过分光光度法进行测定。TBARS测定在酸性条件（pH = 4）和95 °C下进行。纯MDA不稳定，但在上述条件下可从用作本方法分析标准品的MDA双（二甲基缩醛）中释放出MDA。TBARS测定是一种操作简便的方法，约需2小时即可完成。本文详细描述了测定试剂的配制方法。注重预算的研究人员可使用这些试剂以较低成本开展多次实验，而不必购买昂贵的TBARS测定试剂盒（此类试剂盒通常仅能构建一条标准曲线，因而只能用于一次实验）。本TBARS测定方法已成功应用于人血清、低密度脂蛋白及细胞裂解液。该方法结果稳定且可重复，检测限可达1.1 μM。本文还提供了分光光度法TBARS测定的使用与结果解读建议。

在酸性条件（pH = 4）下且在 95 °C，丙二醛（MDA）双（二甲基缩醛）可生成丙二醛（MDA）23MDA 及其密切相关的化学同系物与两分子硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成称为硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS）的化合物，呈现红粉色，并具有吸收波长 λ最大 在 532 nm 处（图1, 图2）。以 MDA 双（二甲基缩醛）为标准品，绘制标准曲线（图3, 表1) 以确定该检测方法的检出限、灵敏度以及三种不同生物样本中的氧化水平。为测定这三个不同样本在不同日期的氧化水平，共进行了九次TBARS检测。因此，共生成了九条标准曲线，如图所示。 图3最小二乘法24 用于确定斜率和 y 轴截距的标准偏差，分别为 8.67 x 10-6 和 ...

硫代巴比妥酸反应性物质检测的目的是通过在532 nm可见光波长下使用分光光度法测定脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的生成量，来评估生物样本中的氧化应激水平。此处所述方法可应用于人血清、细胞裂解液和低密度脂蛋白。

尽管其分析特异性和稳定性有限，硫代巴比妥酸反应物（TBARS）检测法仍被广泛用作一种通用的……

因此，TBARS 检测法最适合用于实验室内部对生物样本氧化应激水平进行一般性评估，其中直接比较的是经相同储存和处理条件下的样本之间的相对 TBARS 水平。该检测方法的成本极低，检测 96 个样本约需 3 美元，而商业试剂盒的成本约为 400 美元，且仅允许分析单一批次的样本。本文所述方法可进一步适用于特定应用，包括生物样本稳定性研究，以及在分析前需添加抗氧化剂或其他类型样本保护剂的研究。为避免结果出现高度变异，需配制新鲜试剂，并确保显色试剂的 pH 值不超过 4，在测定吸光度前去除微孔板中的气泡。首先配制 0.8% 的硫代巴比妥酸水溶液。通过将 4 克氢氧化钠颗粒溶解于 20 毫升水中，配制 5 摩尔的氢氧化钠溶液。将溶液储存于塑料容器中。每次使用时应 freshly prepared（新鲜配制）。将四克硫代巴比妥酸加入450毫升去离子水中，并使用磁力搅拌子轻轻溶解。以每100微升为增量，缓慢加入约四毫升氢氧化钠溶液，同时监测pH值，直至硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。持续添加氢氧化钠溶液，直至所有颗粒完全溶解。使用pH试纸确认溶液的pH值不超过4，然后用去离子水定容至500毫升，并将硫代巴比妥酸水溶液于室温下保存。在2毫升带盖聚丙烯管中配制丙二醛双甲缩醛标准曲线溶液。按照文本稿件中的描述，用水稀释200微摩尔的储备液。涡旋混匀样品。标记待分析样品的玻璃管，然后向每根管中加入100 µL制备好的样品。向每个样品中加入200 µL 8.1% SDS，轻轻旋转混匀玻璃管。向每个样品中加入1.5 mL 3.5 mol/L醋酸钠缓冲液，然后加入1.5 mL 0.8%硫代巴比妥酸水溶液。通过加入700微升去离子水，将各管中的终体积调至4毫升。盖紧玻璃试管，置于设定为95°C的加热块中孵育1小时。用铝箔纸覆盖试管以防止冷凝，然后将试管从加热块中取出，置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，在4°C条件下，以1,500 × g离心10分钟。用移液器从每根离心管中转移150 µL上清液至96孔板的孔中，并用移液器吸头去除任何气泡。在532 nm波长下测定各样品的吸光度，然后从所有其他样品的吸光度读数中减去空白样品的平均吸光度值。创建标准曲线并利用其计算未知样品的浓度。通过生成丙二醛双二甲基丙酮（MDA bis dimethyl acetol）标准曲线，以确定该检测方法的检出限、灵敏度以及三种不同生物样品中的氧化水平。在不同日期对这三个样品共进行了9次TBARS检测。为确定检测限，需在三个不同的日期测定空白样品的吸光度。产生可检测的非噪声吸光信号所需的TBARS物质最低浓度为1.1微摩尔。该检测方法的灵敏度约为每微摩尔浓度增加0.0016吸光度单位。TBARS 检测可用于检测各种生物基质中脂质过氧化的变化。为了验证这一点，使用氯化铜（copper two chloride）在体外诱导人血清、HEPG2 细胞裂解物和低密度脂蛋白（LDL）的氧化。对含有 EDTA 的 LDL 样品进行 TBARS 检测，结果显示，经氯化铜处理与未处理的 LDL 样品之间的 TBARS 水平无显著变化。然而，在通过离心过滤去除EDTA后，LDL发生了铜离子介导的氧化。为了说明TBARS检测法在人血清中的动态范围，向样品中加入了2毫摩尔的铜离子，结果TBARS值升高了6至7倍。在进行该实验方案时，样品在冰上放置的时间不得超过10分钟，离心后应置于室温下。对于那些最初未同时采集、处理和储存的生物样本批次或子集，应通过统计学方法评估数据中是否存在批次效应，以确保人为氧化未对结果产生影响。对低密度脂蛋白进行可控的体外氧化定量，有助于理解氧化如何影响其生物学功能。

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas...

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

本视频演示了使用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）检测法评估生物样品中的氧化应激水平。...

硫代巴比妥酸反应物测定法评估人血清中的氧化应激

本视频展示了一种用于评估细菌菌株氧化应激反应的斑点平板实验方法。某些菌株能够产生一种抗氧化色素——吡咯黑素。相反，经测试试剂处理后导致吡咯黑素生成减少的菌株，对氧化应激的敏感性增加，与能够产生吡咯黑素的菌株相比，其细胞活力下降。...

一种用于评估细菌菌株氧化应激反应的斑点平板实验方法

本论文描述了在活细胞成像中应用基因编码的荧光生成报告系统，用于检测外源性物质诱导的氧化应激。该实验方法具有无与伦比的空间-时间分辨率、灵敏度和特异性，同时避免了传统毒理学氧化应激检测方法的诸多局限性。...

利用基因编码的荧光传感器成像评估毒理学氧化应激的方法

本文介绍了一种利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪对活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便、高效且成本较低。...

通过2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧物种

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

本文介绍了用于评估新热带蛙类物种生物标志物的标准化生态毒理学方法。具体而言，本文详细阐述了在不同尺度上的多种生态毒理学评价方法，包括基因水平、细胞-组织学水平、生物化学水平、形态学水平以及个体水平。...

评估新热带无尾两栖类不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

通过使用邻苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde,...

快速定量测定谷胱甘肽氧化态与还原态的方法 正交 -在体外培养的哺乳动物细胞中使用邻苯二甲醛

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

本文描述了一种合成对空气敏感的钛和钒类抗癌药物的方法，并通过MTT法评估了这些药物对人癌细胞系的细胞毒性活性。...

抗癌金属配合物：合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

学习使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激水平。该方法成本低廉，适用于人血清和细胞裂解液等多种样本类型，通过测量532纳米吸光度实现脂质过氧化产物的定量分析。

使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激

探索更多视频