通过异位细胞系统中的蛋白质聚合测量跨细胞相互作用

基于细胞的分析允许观察和定量反式粘附相互作用，而无需冗长的蛋白质纯化或专用设备。尽管此处测试的蛋白质相互作用与神经生物学相关，但该方法可应用于细胞间发生蛋白质粘附的任何研究领域。转染 HEK-293T 细胞 48 小时后，从 6 孔板中收获细胞进行聚集。

首先，用 PBS 洗涤每个孔两次。接下来，为了轻轻解离细胞，向每个孔中加入 1 毫升 10 毫摩尔 EDTA，然后在 37 摄氏度下孵育板。孵育 5 分钟后，轻轻敲击板以分离细胞，并将每个孔收获到单独的 15 mL 锥形管中。

在室温下以 500 x g 离心试管 5 分钟。当细胞沉淀时，通过用实验条件标记微量离心管的顶部来准备六个孵育管。应使用 GFP 和 mCherry 的每种排列。

从 15 毫升锥形管中取出上清液，并将细胞重悬于 500 微升培养基中。使用血细胞计数器，对每个锥形管中的细胞进行计数。然后将来自每种条件的 200， 000 个细胞分装到适当的孵育管中，进行总体积为 500 微升的一对一混合。

在评估下一节中描述的基线聚集后，将孵育管置于室温下的慢管旋转器中。为了评估聚集，在基线和 60 分钟后再次，从孵育管中吸取 40 μL 移液到带电的显微镜载玻片上。将细胞添加到微量离心管中后，应尽快进行基线采集。

在绿色和红色通道的荧光下对载玻片进行成像。对于每张幻灯片，在一个焦平面上捕获三个不同视野的图像。用目标蛋白、目标突变蛋白或目标配体转染 HEK-293T 细胞，并与荧光蛋白共转染。

将表达目标蛋白的细胞群与表达目标配体的细胞群混合，并在 60 分钟后评估聚集。在绿色和红色通道中捕获的图像叠加中，聚集显示为黄色点。细胞不表达任何突触配体的条件显示最小的聚集。

此外，当两个群体中只有一个表达突触配体时，表现出最小的聚集。当两个细胞群表达不相容的粘附分子时，未表现出聚集。具有相容粘附分子的条件在孵育 60 分钟后表现出明显的聚集。

令人惊讶的是，目标突变蛋白比野生型蛋白表现出明显更多的聚集，这表明点突变增强了蛋白质结合能力。许多粘附分子的突变通常与神经发育、神经精神和成瘾障碍有关。通过这种技术，人们可以筛选疾病相关点突变对反式相互作用的影响。