Name: 通过异位细胞系统中的蛋白质聚合测量跨细胞相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 学习使用荧光显微镜在HEK-293T细胞中快速测量跨细胞配体-受体相互作用的方法。该技术可半定量评估蛋白质粘附特性，有助于研究神经发育和神经精神疾病相关机制。

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本工作获得了美国国家心理健康研究所资助（J.A. 获得 R00MH103531 和 R01MH116901）、美国国家普通医学研究所研究生前培训资助（S.R. 获得 T32GM007635）以及 Lyda Hill Gilliam 高级研究奖学金（S.R. 获得 GT11021）的支持。我们感谢 Kevin Woolfrey 博士在显微镜使用方面的帮助，K. Ulrich Bayer 博士提供落射荧光显微镜，以及 Thomas Südhof（斯坦福大学）提供 LRRTM2 质粒。

1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>使用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，配制HEK细胞培养基 &amp;#38; 氯化钠、丙酮酸钠和10% FBS。无菌过滤。</li>
	<li>预先确定适用于聚集试验的合适配体和受体。 
	注意：本研究使用了Neurexin3α SS4+/-及其已知配体之一LRRTM2。感兴趣的配体和受体均通过克隆至pcDNA3.1载体中的cDNA进行表达。采用Gibson组装法将Neurexin3α插入pcDNA3.1载体中12. Neurexin3α F/R：TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/ 
	GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT</li>
	<li>准备HEK293T细胞。
	<ol>
		<li>在1个T-75培养瓶中将HEK293T细胞培养至汇合。</li>
		<li>待细胞融合后，加入2 mL胰蛋白酶，置于37 °C培养箱中消化2 min。向培养瓶中加入6 mL HEK培养基重悬细胞，并将全部8 mL细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>500 × g 离心沉淀 g 5分钟，然后重悬于HEK细胞培养基中，总体积为8 mL。</li>
		<li>计数细胞，并将735,000个细胞加入6孔板的每个孔中。用HEK细胞培养基将每孔终体积调整至2 mL。</li>
		<li>置于37 °C培养箱中，过夜培养或直至细胞达到50-60%汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用磷酸钙法转染HEK293T细胞13.
	<ol>
		<li>用3 µg目的蛋白质转染1号孔，并共转染1 µg荧光蛋白（3 µg pcDNA3.1-Neurexin3α）WT SS4- 和 1 µg mCherry。</li>
		<li>按照步骤1.4.1的方法转染第2孔，但使用目的突变蛋白（pcDNA3.1-Neurexin3α）A687T SS4-)</li>
		<li>用3 µg目的配体转染3号孔，并共转染1 µg另一种荧光蛋白（3 µg pcDNA3.1 LRRTM2 和1 µg GFP）。</li>
		<li>转染第4孔和第5孔作为阴性对照：第4孔加入1 µg GFP，第5孔加入1 µg mCherry。</li>
		<li>如果需要额外的条件或对照组（Neurexin3α），请准备另一块培养板（步骤同1.4.1–1.4.4）WT/A687T SS4+ 
		注意：转染效率在转染后24小时通过落射荧光显微镜进行分析，并以表达所转染荧光蛋白的细胞数量进行量化。更为优化的方法是使用编码荧光蛋白和目标配体的双顺反子载体对HEK细胞进行转染，该方法优于共转染，强烈推荐使用。但在本研究中，α-Neurexin长度约为4.3 kb，使用双顺反子系统时荧光强度较低，因此需采用共转染策略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后48小时，收集细胞用于聚集体实验。
	<ol>
		<li>用 PBS 洗涤每个孔两次。</li>
		<li>向每孔中加入1 mL PBS配制的10 mM EDTA，以轻柔解离细胞间相互作用，将培养板于37 °C孵育5 min。 
		注意：由于胰蛋白酶可能在研究中对黏附分子造成蛋白水解切割，因此不建议在步骤1.5.2中使用。此外，加入EDTA后，该方案必须连续进行直至完成，因为细胞此后将暴露于环境条件下。</li>
		<li>轻轻敲击培养板以脱离细胞，并将每孔的细胞分别收集到15 mL锥形管中。</li>
		<li>将锥形管以 500 x g 离心 g 室温孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞离心沉淀的同时，准备6个孵育管，通过在每个微量离心管顶部标记对应条件进行标识。 
	注意：GFP 和 mCherry 条件的每种组合均应使用，以涵盖所有实验条件及适当的对照。例如：1. GFP/mCherry，2. mCherry/LRRTM2-GFP，3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry，4. GFP/Neurexin3αA687T SS4– –mCherry，5. Neurexin3α野生型 SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP，6. Neurexin3αA687T SS4–mCherry/LRRTM2–GFP。根据需要制备额外的试管以容纳其他实验条件和对照组。</li>
	<li>移去上清液，将细胞重悬于 500 µL 含 10 mM CaCl 的 HEK 培养基中2 和 10 mM MgCl2 37 °C 预热。 
	注意：添加 CaCl2 和 MgCl2 允许黏附分子重新建立结合，且仅在所涉及的跨细胞相互作用伴侣需要二价阳离子进行黏附时才需要。</li>
	<li>使用血细胞计数板对每个15 mL锥形管中的细胞进行计数，并从步骤1.6.1中取出相应管，每种条件各取200,000个细胞，加入适当的管中，用500 µL总体积配制成1:1混合液。 
	注意：每种条件下计数和分装所需时间仅需5分钟。</li>
	<li>在室温下将试管置于慢速试管旋转仪中孵育。</li>
</ol>
2. 图像采集
<ol>
	<li>针对特定样本优化显微镜采集参数。本示例中，图像在宽场显微镜上采集。使用5倍空气物镜（NA：0.15；WD：20000 μm）以获得足够大的分析视野。</li>
	<li>在步骤1.8将两种HEK细胞条件混合后，立即评估基础聚集状态。这些图像即为“零时”图像。
	<ol>
		<li>将每种样本混合物各40 µL移液至带电荷的显微镜载玻片上，并在荧光下分别于488和561通道成像。</li>
		<li>每滴样本在同一个焦平面上采集三个不同的视野。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在60分钟时采集最终图像，作为“60分钟”图像。
	<ol>
		<li>为获得混合物经60分钟孵育后的“60分钟”图像，从旋转管中再次取每种条件的40 µL样本，移液至带电荷的载玻片上，并按步骤2.2.2进行成像。 
		注意：应每15分钟检查一次细胞聚集情况，直至达到饱和。聚集发生的时间取决于所测试的蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ImageJ/Fiji 分析
<ol>
	<li>使用 Fiji/ImageJ 量化聚集程度时，保存分析文件。
	<ol>
		<li>将提供的补充代码文件保存到计算机上的 imageJ 宏文件夹中。</li>
		<li>安装提供的聚集分析宏（Plugins, Macros, Install，并选择“AggregationAssay.txt”文件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定阈值。
	<ol>
		<li>将一个“零时间点”（time zero）的 .tif 文件载入 ImageJ，并拆分通道（Image | Color | Split Channels）。 
		注意：“零时间点”图像用于确定整个实验的阈值和最小斑点尺寸。</li>
		<li>对每个通道进行掩膜处理（Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask），将弹出“Make Mask From Image”窗口。勾选Determine Threshold for Image和Determine Cluster Params from Histogram旁边的复选框，然后点击OK。</li>
		<li>使用滑动条确定图像的阈值，记录滑动条右侧显示的数值，然后点击OK。</li>
		<li>将出现一个Histogram of Cluster Size（簇大小直方图）。从直方图中选择一个适合实验的簇大小，在Min Cluster Size:框中输入该数值，然后点击OK。小于该尺寸的簇将不会被分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行分析。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开条件1的“60分钟时间点”（time 60）图像，并按照步骤 3.2.1 的方法拆分通道。</li>
		<li>对每个通道进行掩膜处理（Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask）。使用步骤 3.2.3 和 3.2.4 中确定的相同阈值和尺寸，取消勾选Determine Threshold for Image和Determine Cluster Params from Histogram旁边的复选框，手动在相应字段中输入尺寸和阈值，然后点击OK。</li>
		<li>计算聚集指数（Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap）。选择要比较的掩膜通道，以及结果文件将保存的目录。</li>
		<li>对每种条件下的每个“60分钟时间点”图像重复步骤 3.3.1–3.3.3。 
		注意：聚集指数定义为总重叠面积除以两个通道面积之和减去重叠面积后的结果乘以100（聚集指数 = 重叠面积 / [通道1面积 + 通道2面积 – 重叠面积] × 100）。该归一化方法相当于对两个掩膜通道执行“或”（OR）操作，表示任一掩膜中包含的总像素数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

解析细胞黏附过程中发生的跨细胞（trans）蛋白质-蛋白质相互作用，有助于更好地理解基本细胞过程背后的分子机制，包括在成熟和重塑过程中突触的形成、功能及维持。细胞间相互作用的意义不仅限于神经生物学，还在信号转导、细胞迁移和组织发育中发挥更广泛的作用14。细胞黏附的异常可破坏对正常细胞功能至关重要的细胞过程，并可能导致多种疾病的发生，如癌症、关节炎、成瘾、自闭症和精神分裂症1,15,16。本文提供了一种经过优化的详细实验方案，涉及HEK细胞聚集，可用于检测跨细胞的细胞黏附相互作用。
通过该HEK细胞聚集实验方案，我们可以解析细胞聚集的差异，从而近似评估突触前蛋白与其突触后配体之间的结合能力。因此，我们可以提出如下问题：两个关键突触蛋白之间的相互作用是否受到点突变的影响？更具体而言，Neurexin3α与LRRTM2之间的跨细胞相互作用...

突触黏附分子介导的突触相互作用是突触发育、组织、特化、维持和功能以及神经网络形成的基础。目前发现的跨突触细胞黏附分子数量迅速增加，因此，鉴定这些新黏附分子的结合伴侣并理解它们之间的相互作用方式具有根本性的重要意义。此外，基因组测序已发现许多此类黏附分子基因中的突变，这些突变通常与多种神经发育障碍、神经精神疾病及成瘾性疾病相关1。编码突触细胞黏附分子的基因发生突变可能有害地改变跨突触相互作用，并可能导致突触形成和/或维持过程中的病理生理学改变。
目前已有多种定量检测蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法，例如等温滴定 calorimetry、圆二色光谱法、表面等离子共振2，这些方法虽然具有定量性，但仍存在若干局限性。首先，它们需要使用重组蛋白，有时还需进行耗时且繁琐的纯化步骤。其次，这些方法依赖复杂的专用设备和技术专长。第三，由于允许在体内天然锚定于膜上的蛋白质之间发生顺式（cis）和反式（trans）相互作用，可能导致对结合程度的高估。本文中，我们提出一种简单且相对快速的实验方法，专门用于检测反式（trans）相互作用。
为避免纯化蛋白检测中常见的诸多复杂问题，我们优化了一种基于细胞的蛋白质相互作用检测方法，可在简化的异源细胞系统中重现跨细胞相互作用。该方法此前已以多种形式被用于研究跨细胞相互作用。在此方法中，将候选的细胞黏附分子转染至 HEK293T 细胞中。在生理条件下，HEK293T 细胞不发生自聚集，因此非常适合作为该检测的模型。然而，当分别表达受体和配体的两群 HEK 细胞混合后，受体与配体的结合会促使 HEK 细胞发生聚集。这种聚集完全由跨细胞相互作用介导，通常在数十分钟内即可观察到。该方法无需蛋白纯化步骤，其检测效率依赖于以下实验范式：将表达对应黏附分子的 HEK 细胞群体混合后，仅在数十分钟后即进行成像观察。此外，该方法成本相对较低，无需使用抗体或昂贵设备。数据采集所需的唯一设备是一台标准的荧光显微镜。这种基于细胞的检测方法另一优势在于，能够快速筛选与疾病相关的点突变对跨细胞相互作用的影响。该操作可通过将目的蛋白的突变体 cDNA 转染至 HEK 细胞中来实现。
在本实验方案中，我们通过一个实例来研究在一名被诊断为重度智力障碍和癫痫的患者中发现的Neurexin3α（Neurexin3αA687T）错义突变是否会影响其与富含亮氨酸重复序列的跨膜蛋白2（LRRTM2）之间的跨细胞相互作用。Neurexin3α属于进化上保守的突触前细胞黏附分子家族，尽管近期研究已揭示其在突触中具有多种功能3,4,5,6,7，但目前对这种分子以及所有neurexin家族成员在突触层面的理解仍不完整。LRRTM2是一种兴奋性突触后细胞黏附蛋白，参与突触的形成与维持8,9,10。重要的是，LRRTM2仅与缺少剪接位点4可变外显子（SS4-）的neurexin异构体发生相互作用，而不与包含剪接位点4可变外显子（SS4+）的neurexin异构体相互作用。在Neurexin3α中发现的人类错义突变（A687T）位于一个尚未被研究的胞外区域，该区域在进化上高度保守，并且在所有α型neurexin之间也保持一致7。由于这两种分子之间的相互作用已被证实8,9,11，我们提出问题：Neurexin3α SS4-与LRRTM2之间的结合能力是否会因A687T点突变而发生改变？本实验结果显示，A687T点突变意外增强了Neurexin3α与LRRTM2的聚集，提示该点突变所处的胞外区域在介导突触间相互作用中发挥一定作用。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 一次性带盖离心管</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>HEK细胞混合群体的孵育</td></tr><tr><td>1000 mL 快速法&amp;mdash;0.2 微米 aPES 膜流动过滤单元</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>567-0020</td><td>HEK培养基的灭菌</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube 离心管</td><td>沃德&amp;rsquo;科学</td><td>470224-998</td><td>收获HEK细胞</td></tr><tr><td>6 孔无菌组织培养板</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>培养HEK细胞</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>磷酸钙转染，HEK细胞重悬</td></tr><tr><td>离心机 - Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>收获HEK细胞</td></tr><tr><td>CO2细胞培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HERACELL 150i</td><td>HEK细胞生长过程中的孵育</td></tr><tr><td>DMEM，1×（伊格尔培养基的达爾伯克改良型），含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺 &amp;和丙酮酸钠</td><td>康宁</td><td>10-013-CV</td><td>HEK细胞培养与维持</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液 PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>传代/收获HEK细胞</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>收获HEK细胞</td></tr><tr><td>Falcon 透气培养瓶，75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 生长区域</td><td>康宁</td><td>9381M26</td><td>培养HEK细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK细胞培养与维护</td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>模型系统</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>图像分析</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK 细胞重悬液</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>磷酸钙转染</td></tr><tr><td>0.25% (1X) 胰蛋白酶溶液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>传代培养HEK细胞</td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td></td><td></td><td>HEK细胞混合群体的孵育</td></tr><tr><td>UltraClear 显微镜载玻片。白色磨砂，正电荷</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>图像采集</td></tr><tr><td>宽场显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>图像采集</td></tr></tbody></table>

通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

细胞界面处的蛋白质相互作用决定了多种生物学结果，从组织发育和癌症进展到突触的形成与维持。许多这类基本相互作用以反式（trans）方式进行，通常由表达膜锚定结合配对的细胞之间发生异嗜性或同嗜性相互作用所引发。阐明与疾病相关的突变如何破坏这些基本的蛋白质相互作用，可为众多细胞生物学领域提供重要见解。目前许多蛋白质-蛋白质相互作用检测方法通常无法区分顺式（cis）与反式（trans）相互作用，可能导致对体内实际结合程度的高估，且往往涉及耗时的蛋白质纯化步骤和/或需要专门的监测设备。本文介绍一种经过优化的简便实验方案，可在无需 lengthy 蛋白质纯化或专用设备的情况下，特异性地观察和定量反式相互作用。该HEK细胞聚集实验包括混合两群独立的HEK细胞，每群细胞分别表达膜结合的对应配体。经过短暂孵育后，对样品进行成像并定量分析所形成的细胞聚集体。

A687T 突变增强 Neurexin3α SS4- 与 LRRTM2 的结合能力7 
为了研究在一位患有智力障碍和癫痫的患者中发现的点突变如何影响两种已知突触蛋白之间的细胞间相互作用，我们采用了上述 HEK 细胞聚集实验（图 1）。细胞根据方案第 1 节进行转染，并按照第 1 和第 2 节步骤准备成像。在基线条件下成像时，未观察到细胞聚集，结果符合预期（未展示）。在 60 分钟时采集的图像按照方案第 3 节进行分析。为尽量减少选择偏倚，实验条件进行了随机化处理，以对实验操作者设盲。出于类似原因，每张图像的整个视野均被选为感兴趣区域（ROI）。
在细胞不表达任何突触配体（GFP/mCherry）的条件下，经过60分钟孵育后仅观察到极少的细胞聚集（图2）。同样，在仅有一类细胞群体表达突触配体（mCherry/LRRTM2-GFP 或 GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4−—mCherry）的条...

本文介绍了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜在异源细胞系统中快速、半定量地检测反式配体-受体相互作用。

细胞界面处的蛋白质相互作用决定了多种生物学结果，从组织发育和癌症进展到突触功能等。

基于细胞的检测方法可实现对跨细胞黏附相互作用的观察与定量，无需进行耗时的蛋白质纯化或使用特殊设备。尽管此处检测的蛋白质相互作用与神经生物学相关，但该方法也可应用于任何涉及细胞间蛋白质黏附的研究领域。转染 HEK-293T 细胞 48 小时后，从六孔板中收集细胞用于聚集体实验。首先，用 PBS 每孔洗涤两次。接着，加入 1 毫升 10 毫摩尔 EDTA 至每孔，以轻柔地解离细胞，然后将培养板置于 37 摄氏度孵育。孵育 5 分钟后，轻轻敲击培养板使细胞脱落，并将每孔的细胞收集至各自的 15 毫升锥形管中。在室温下以 500 × g 离心试管 5 分钟。在细胞沉淀期间，通过在微量离心管管盖上标记实验条件，准备六个孵育管。应使用 GFP 和 mCherry 的每一种组合。从15毫升锥形管中移除上清液，并将细胞重悬于500微升培养基中。使用血细胞计数板对每个锥形管中的细胞进行计数。然后从每种条件下取200,000个细胞，加入相应的孵育管中，总体积为500微升，进行一对一混合。在评估下一节所述的基线聚集情况后，将孵育管置于室温下的慢速管旋转仪中。为评估聚集情况，分别在基线时间点以及60分钟后，从孵育管中吸取40微升液体至带电荷的显微镜载玻片上。在将细胞加入微量离心管后，应尽快完成基线数据的采集。在荧光显微镜下，使用绿色和红色通道对载玻片进行成像。每张载玻片需在同一焦平面上采集三个不同视野的图像。HEK-293T细胞被转染了目的蛋白、突变的目的蛋白或目的配体，并共转染了荧光蛋白。表达目标蛋白的细胞群体与表达目标配体的细胞群体混合后，在60分钟时评估其聚集情况。在绿色和红色通道图像的叠加图中，聚集表现为黄色斑点。未表达任何突触配体的细胞组别中，聚集现象极少。此外，当仅有两个细胞群中的一个表达突触配体时，仅表现出轻微的聚集。当两个细胞群表达不相容的黏附分子时，则未表现出聚集。在表达相容性黏附分子的条件下，经过60分钟孵育后表现出显著的聚集。令人意外的是，该突变目的蛋白的聚集程度显著高于其野生型对应物，表明该点突变增强了蛋白质的结合能力。许多黏附分子的突变通常与神经发育障碍、神经精神疾病及成瘾性疾病相关。利用该技术，可筛选与疾病相关的点突变对跨分子相互作用的影响。

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通过异位细胞系统中的蛋白质聚合测量跨细胞相互作用

在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。...

蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

在本视频中，我们演示了通过HEK细胞聚集实验来检测突触细胞黏附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该实验中，将表达目标突触前细胞黏附分子和一种荧光蛋白的HEK细胞，与表达突触后细胞黏附分子及另一种荧光蛋白的HEK细胞等量混合。细胞黏附分子之间的相互作用促使细胞发生聚集，可通过荧光显微镜进行观测和测量。...

检测细胞黏附分子间反式相互作用的细胞聚集实验

在本视频中，我们演示了细胞内核磁共振波谱技术，用于研究未标记的过表达蛋白质与小分子之间的蛋白质-配体相互作用。通过在目标谱峰区域出现一组新的峰并逐渐取代原有峰的现象，可直观地确认配体与蛋白质的成功结合。...

定量细胞内氢核磁共振波谱法监测蛋白质-配体相互作用

细胞存活能力依赖于对蛋白质错误折叠的及时且高效管理。本文介绍一种用于观察错误折叠蛋白质不同命运的方法：重折叠、降解或在包涵体中被隔离。我们展示了利用折叠传感器Ubc9ts，结合4D显微镜技术，在活细胞中监测蛋白质稳态及聚集质量控制的过程。...

活细胞中蛋白质聚集的4D成像

本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。...

用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验

雷诺丁受体的寡聚化，一种介导Ca²⁺释放的同源四聚体离子通道2+ 来自细胞内储存的释放，对骨骼肌和心肌收缩至关重要。本文中，我们介绍互补的 体内 和 体外...

遗传学与生物化学方法 体内 和 体外 蛋白质寡聚化的评估：以兰尼碱受体为例

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis...

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

学习使用荧光显微镜在HEK-293T细胞中快速测量跨细胞配体-受体相互作用的方法。该技术可半定量评估蛋白质粘附特性，有助于研究神经发育和神经精神疾病相关机制。

通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用

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