通过异位细胞系统中的蛋白质聚合测量跨细胞相互作用
2020年5月22日
在这里，我们提出了一个优化的协议，使用荧光显微镜快速和半定量测量异质细胞系统中跨体中的配体受体相互作用。
基于细胞的分析允许观察和定量反式粘附相互作用，而无需冗长的蛋白质纯化或专用设备。尽管此处测试的蛋白质相互作用与神经生物学相关，但该方法可应用于细胞间发生蛋白质粘附的任何研究领域。转染 HEK-293T 细胞 48 小时后，从 6 孔板中收获细胞进行聚集。
首先，用 PBS 洗涤每个孔两次。接下来，为了轻轻解离细胞，向每个孔中加入 1 毫升 10 毫摩尔 EDTA，然后在 37 摄氏度下孵育板。孵育 5 分钟后，轻轻敲击板以分离细胞，并将每个孔收获到单独的 15 mL 锥形管中。
在室温下以 500 x g 离心试管 5 分钟。当细胞沉淀时，通过用实验条件标记微量离心管的顶部来准备六个孵育管。应使用 GFP 和 mCherry 的每种排列。
从 15 毫升锥形管中取出上清液，并将细胞重悬于 500 微升培养基中。使用血细胞计数器，对每个锥形管中的细胞进行计数。然后将来自每种条件的 200， 000 个细胞分装到适当的孵育管中，进行总体积为 500 微升的一对一混合。
在评估下一节中描述的基线聚集后，将孵育管置于室温下的慢管旋转器中。为了评估聚集，在基线和 60 分钟后再次，从孵育管中吸取 40 μL 移液到带电的显微镜载玻片上。将细胞添加到微量离心管中后，应尽快进行基线采集。
在绿色和红色通道的荧光下对载玻片进行成像。对于每张幻灯片，在一个焦平面上捕获三个不同视野的图像。用目标蛋白、目标突变蛋白或目标配体转染 HEK-293T 细胞，并与荧光蛋白共转染。
将表达目标蛋白的细胞群与表达目标配体的细胞群混合，并在 60 分钟后评估聚集。在绿色和红色通道中捕获的图像叠加中，聚集显示为黄色点。细胞不表达任何突触配体的条件显示最小的聚集。
此外，当两个群体中只有一个表达突触配体时，表现出最小的聚集。当两个细胞群表达不相容的粘附分子时，未表现出聚集。具有相容粘附分子的条件在孵育 60 分钟后表现出明显的聚集。
令人惊讶的是，目标突变蛋白比野生型蛋白表现出明显更多的聚集，这表明点突变增强了蛋白质结合能力。许多粘附分子的突变通常与神经发育、神经精神和成瘾障碍有关。通过这种技术，人们可以筛选疾病相关点突变对反式相互作用的影响。
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概述
本研究提出了一种优化的协议，用于在HEK-293T细胞中通过荧光显微镜法快速且半定量地测量反式配体-受体相互作用。该方法允许量化与神经生物学相关的蛋白质粘附相互作用，并可能适用于其他研究领域。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经生物学
- 细胞粘附
- 蛋白质相互作用
背景
- 配体-受体相互作用对于细胞通信至关重要。
- 理解这些相互作用有助于阐明神经发育和神经精神疾病的机制。
- 传统方法可能需要大量的蛋白质纯化或专门的设备。
- 本研究提出了一种使用荧光显微镜的更高效的方法。
研究目的
- 开发一种快速有效的协议，用于在细胞基础的检测中研究蛋白质粘附。
- 评估蛋白质中的点突变如何影响反式相互作用。
- 将这种方法广泛应用于神经生物学以外的蛋白质粘附研究中。
使用的方法
- 荧光显微镜用于成像细胞相互作用。
- 使用HEK-293T细胞作为生物模型，重点关注转染的蛋白质和配体。
- 实验时间线包括在转染后60分钟进行细胞聚集评估。
- 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后细胞重悬和混合用于成像。
主要结果
- 在60分钟后，表达兼容性粘附分子的细胞聚集显著增强。
- 突变蛋白与野生型对比显示出更大的聚集，表明结合能力得到改善。
- 当没有或只有一个种群表达突触配体时，观察到的聚集最少。
结论
- 本研究展示了一种评估细胞间粘附相互作用的简化方法。
- 研究结果突出了该技术在探索突变对蛋白质相互作用影响方面的潜力。
- 这种方法的见解对于理解各种神经发育和心理疾病的潜在机制具有价值。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
