细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

该方法可用于研究需要共表达才能有效获得测试样品的蛋白质复合物的形成，例如异源二聚体的形成。该方法的主要优势在于利用兼容性载体组合，共表达带有不同标签的目标蛋白质，从而促进蛋白质复合物的高效组装；同时具备高效的时间流程和可扩展性，可快速进行多种相互作用的初步测试。该方法还可用于快速筛选最佳的蛋白质表达与纯化条件。

可视化演示有助于正确执行实验方案中的关键步骤，例如共表达体系的建立、细胞破碎以及后续的下拉步骤。首先，在37摄氏度下，将大肠杆菌BL21(DE3)菌株在Luria-Bertani（即LB）培养基中培养至光密度（OD）为0.1至0.2。取1毫升细菌悬液，在4摄氏度、9,000 ×g条件下离心1分钟，弃去上清液。

然后，加入 0.5 毫升预冷的转化缓冲液（TB），在冰上孵育 10 分钟。孵育结束后，在 4°C、8,000 G 条件下离心 30 秒，弃去上清液。接着，加入 100 微升 TB 缓冲液和每种载体 100 纳克，在冰上孵育 30 分钟。

在 42 摄氏度下加热 150 秒，然后在冰上冷却 1 分钟。接下来，加入 1 毫升不含抗生素的 LB 培养基，在 37 摄氏度下培养 90 分钟。培养结束后，离心并用 100 微升 LB 培养基重悬沉淀，随后将菌液涂布于含有 0.5% 葡萄糖及相应抗生素的 LB 琼脂平板上。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。次日，用两毫升LB培养基将细胞从培养板中洗脱至含有相应抗生素的50毫升LB培养基中。在后续实验前，加入金属离子或其他已知辅因子，并将部分样品与20%甘油混合后于零下70摄氏度保存。

将细胞在37摄氏度、220转/分钟持续振荡条件下培养至OD值为0.5至0.7。将培养物冷却至室温，加入IPTG至终浓度为1毫摩尔。取20微升细胞悬液作为未诱导样品的对照，保存备用。

将细胞在18摄氏度、220 RPM条件下过夜培养。次日，将菌液分为两部分，并保存20微升等分试样以确认蛋白表达。将剩余的细胞悬液在4,000 G条件下离心15分钟。

进行下拉实验时，将沉淀重悬于1毫升预冷的裂解缓冲液中，缓冲液需在实验前立即加入蛋白酶抑制剂和还原剂。根据所检测的蛋白质调整缓冲液成分。在冰上通过超声处理裂解细胞，并保留20微升等分试样用于电泳。

在16,000 G条件下离心30分钟，收集20微升澄清裂解液用于电泳。用1毫升预冷的裂解缓冲液平衡树脂10分钟，然后在2,000 G条件下离心30秒，弃去上清液。将细胞裂解液加入树脂中，在15 RPM的恒定转速下孵育10分钟。

然后，离心并弃去上清液，再收集20微升未结合组分用于分析。接着，加入1毫升预冷的洗涤缓冲液，孵育1分钟。再次离心并弃去上清液。

然后，用预冷的洗涤缓冲液进行两次长时间洗涤。第二次洗涤后，在4°C条件下，将结合的蛋白质在50微升洗脱缓冲液中以1,200转/分钟（RPM）振荡10分钟进行洗脱。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱的蛋白质。

此处展示了锌指相关结构域（ZAD）在麦芽糖结合蛋白（MBP）和6x组氨酸下拉实验中同源二聚化的研究结果。MBP与硫氧还蛋白融合的6x组氨酸标记ZAD共表达时，表现出良好且可重复的同源二聚化活性，在MBP下拉实验的SDS-PAGE结果中呈现为额外的条带。此处还展示了利用该方法研究替代性复合物形成的另一个示例。

在共表达实验中，6xHis标签的ENY2既能与GST标签的Sgf11相互作用，也能与MBP标签的CTCF相互作用，但在MBP下拉实验中未检测到GST-Sgf11，反之亦然。此处展示了传统下拉实验与共表达偶联下拉实验在操作流程中所需时间间隔的逐步比较。此处还展示了利用这两种技术研究CP190蛋白的BTB结构域与果蝇CTCF蛋白C端结构域（GST标签）之间相互作用的结果。

正确选择亲和力和溶解度检测标签（硫氧还蛋白、GST 或 MBP）对于高效实施该检测至关重要。另一个关键步骤是快速且均匀地裂解细胞。强烈建议使用多尖端超声波探头。

该方法能够直接研究蛋白质结构域之间的异源二聚体形成，而这些结构域在常规的纯化蛋白共沉淀实验中通常会形成同源二聚体，并且在孵育过程中不会解离。