下拉测定与细菌细胞共表达相结合，作为测试具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用的省时工具
2022年12月23日
在这里，我们描述了一种使用一组兼容载体对差异标记蛋白质进行细菌共表达的方法，然后使用传统的下拉技术来研究无法 在体外组装的蛋白质复合物。
该方法允许研究需要共表达的蛋白质复合物的形成，以实现有效的测试样品，例如异二聚体的形成。该方法的主要最终潜力是利用差异标记研究蛋白质的共表达，使用兼容载体的组合来促进高效的复杂组装，以及节省时间的工作流程和可扩展性，允许对多种相互作用进行快速斑贴测试。该方法还可用于快速筛选最佳蛋白表达和纯化条件。
可视化演示有助于正确执行实验方案的关键步骤，例如共表达设置、细胞破碎和后续下拉步骤。首先，在 37 摄氏度的 Luria-Bertani（LB）培养基中培养大肠杆菌 BL21（DE3）菌株，使其光密度或 OD 为 0.1 至 0.2。在4摄氏度下以9， 000g离心一毫升细菌悬浮液一分钟，弃去上清液。
然后，加入0.5毫升冰冷的转化缓冲液或TB，并在冰上孵育10分钟。孵育结束时，在4摄氏度下以8， 000G离心30秒，弃去上清液。然后，加入100微升TB缓冲液，每种载体100纳克，并在冰上孵育30分钟。
在 42 摄氏度下加热 150 秒，然后在冰上冷却一分钟。接下来，加入一毫升不含抗生素的LB培养基，并在37摄氏度下孵育90分钟。孵育后，将沉淀离心并重悬于100微升LB培养基中，然后将悬浮液接种在含有0.5%葡萄糖和相应抗生素的LB琼脂平板上。
将板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用两毫升LB培养基将平板上的细胞冲洗到含有相应抗生素的50毫升LB培养基中。在将含有20%甘油的等分试样储存在零下70摄氏度之前，加入金属离子或其他已知的辅助因子，以进行后续实验。
在 220 摄氏度下以 37 RPM 的恒定旋转培养细胞，以 0.5 至 0.7 的 OD 培养细胞。将培养物冷却至室温，并加入IPTG至终浓度为1毫摩尔。储存20微升等分试样的细胞悬液作为未诱导样品的对照。
将细胞在 220 RPM 和 18 摄氏度下孵育过夜。第二天，将细菌悬浮液分成两部分并储存20微升等分试样以确认蛋白质表达。将剩余的细胞悬液以4， 000 G离心15分钟。
对于下拉测定，将沉淀重悬于一毫升冰冷的裂解缓冲液中，并在实验前立即加入蛋白酶抑制剂和还原剂。调整测试蛋白质的缓冲液组成。通过在冰上超声处理破坏细胞，并储存20微升等分试样用于电泳。
以16， 000G离心30分钟，收集20微升澄清裂解物用于电泳。用一毫升冰冷的裂解缓冲液平衡树脂10分钟，然后以2， 000g离心30秒并弃去上清液。将细胞裂解物添加到树脂中，并以15RPM的恒定旋转孵育10分钟。
然后，离心并弃去上清液，然后收集20微升未结合的馏分进行分析。接下来，加入一毫升冰冷的洗涤缓冲液并孵育一分钟。再次，离心并丢弃上清液。
然后，用冰冷的洗涤缓冲液进行两次长时间洗涤。第二次洗涤后，用50微升洗脱缓冲液在摇床中以1， 200 RPM在4摄氏度下洗脱结合的蛋白质10分钟。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱的蛋白质。
本文显示了锌指相关结构域（ZAD）、麦芽糖结合蛋白（MBP）中的同源二聚化和6x组氨酸下拉测定的研究。MBP和硫氧还蛋白6x组氨酸融合ZADs的共表达显示出良好且可重现的同源二聚化活性，在MBP下拉测定的SDS-PAGE结果中显示为附加条带。这里显示了使用该方法研究替代复合物形成的另一个示例。
在共表达测定中，6x组氨酸标记的ENY2与GST标记的Sgf11和MBP-CTCF相互作用，但在MBP下拉中不存在GST-Sgf11，反之亦然。此处显示了传统下拉测定工作流程中所需时间间隔与下拉与共表达耦合的分步比较。此处显示了利用这两种技术研究CP190蛋白的BTB结构域与果蝇CTCF蛋白的GST标记C末端结构域之间相同相互作用的结果。
正确选择亲和力和溶解度测试、硫氧还蛋白、GST 或 MBP 对于有效执行测定至关重要。另一个关键步骤是快速均匀的细胞破碎。强烈建议使用多尖端超声探头。
该方法允许直接研究蛋白质结构域之间的异二聚体形成，否则形成在常规下拉测定中纯化蛋白质孵育期间不会解离的同源二聚体。
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概述
本文介绍了一种使用兼容载体进行细菌共表达差异标记蛋白的方法。该方法有助于研究不能在体外组装的蛋白复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 蛋白质相互作用研究
背景
- 蛋白复合物通常需要共表达以实现高效组装。
- 异二聚体的形成是这种方法的一个关键重点。
- 传统的下拉技术被用来分析这些复合物。
- 视觉演示增强了对协议的理解。
研究目的
- 利用差异标记蛋白的共表达。
- 促进高效的复合物组装。
- 使得快速筛选蛋白表达条件成为可能。
使用的方法
- 在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中共表达蛋白。
- 在37摄氏度的Luria-Bertani（LB）培养基中生长。
- 离心细菌悬液以分离细胞。
- 随后的下拉步骤用于分析蛋白相互作用。
主要结果
- 实现了蛋白复合物的高效组装。
- 时间高效的工作流程允许快速测试相互作用。
- 确定了最佳蛋白表达条件。
- 协议的关键步骤成功演示。
结论
- 该方法提供了一种研究蛋白复合物的稳健方法。
- 它增强了对细胞环境中蛋白相互作用的理解。
- 未来的应用可能包括更广泛的蛋白相互作用研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible interrogation of protein-protein interactions is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The pulldown assay coupled with bacterial co-expression enables rapid, scalable assessment of challenging complexes that cannot be reconstituted in vitro, directly impacting predictive confidence at the discovery inflection point. This workflow supports portfolio triage by enabling batch testing of interaction hypotheses with reduced time and technical variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of protein complexes requiring co-translational assembly or chaperone support.
- Facilitates functional validation of interaction partners that are unstable or non-reconstitutable in vitro.
- Supports mechanistic de-risking by confirming biologically relevant interactions under near-native conditions.
- Accelerates hypothesis-driven triage of candidate targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream screening and assay development workflows.
- Improves reproducibility and standardization by minimizing proteolysis and oxidation during sample handling.
- Enables rapid, parallelized batch testing of multiple protein-protein interactions.
- Supports optimization of expression and purification conditions for challenging targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interaction studies with disease-relevant protein complexes when in vitro reconstitution is not feasible.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust mechanistic insights.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected interaction dependencies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional validation of protein interactions prior to downstream screening or preclinical modeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling direct assessment of complex assembly requirements.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides SDS-PAGE and affinity-based readouts for robust measurement of interaction strength and specificity.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems when standard in vitro approaches are insufficient.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for batch testing diverse protein-protein interactions across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through time-efficient, reproducible protocols and minimized sample handling.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by rapidly de-risking interaction hypotheses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated interaction dependencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial co-expression systems and affinity purification techniques.
- Needs access to compatible expression vectors, multi-tip sonicators, and analytical infrastructure for SDS-PAGE.
- Demands cross-team standardization of tagging strategies and buffer compositions for reproducibility.
- May require adaptation for different protein classes or interaction types based on solubility and stability.
- Limited to interactions amenable to bacterial expression and compatible with available affinity tags.
