Name: 培养胚胎高级宫颈神经群中的大鼠交感神经元进行形态学和蛋白质学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: 学习从大鼠胚胎高级宫颈神经群分离和培养交感神经元的方法，用于形态学和蛋白质组学分析。该方案支持免疫荧光染色和质谱分析，助力神经发育与功能机制研究。

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本研究得到了加州圣玛丽学院教师发展基金和暑期研究项目资助。作者还感谢加州大学戴维斯分校的 Pamela Lein 博士以及加州大学伯克利分校质谱设施的 Anthony Iavarone 博士在本实验方案开发过程中提供的建议。作者同时感谢加州圣玛丽学院学院传播办公室的 Haley Nelson 在视频制作与编辑方面提供的帮助。

所有涉及动物的研究操作均经加州圣玛丽学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。圣玛丽学院的动物照护与使用指南基于美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室提供的指导文件制定（https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf 和 https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf）。
1. 培养基（也称为对照培养基）的制备
<ol>
	<li>按以下顺序将下列成分加入一个无菌的 500 mL 锥形瓶中：190 mL 1x 低糖 DMEM，10 mL 含 FAF-BSA（无脂肪酸牛血清白蛋白，20 mg/mL）的 DMEM，2.8 mL 200 mM L-谷氨酰胺，4 mL 100x 胰岛素-硒-转铁蛋白混合液，0.4 mL 含神经生长因子（125 µg/mL，溶于含 0.2% 惰性蛋白稳定剂的 DMEM 中），以及 200 mL Ham’s F-12 培养基。</li>
	<li>在添加含蛋白质的溶液（如胰岛素-硒-转铁蛋白混合液和 NGF）之前，务必先用含有 FAF-BSA 的培养基润洗移液管，以防止蛋白质粘附在移液管壁上。</li>
	<li>每次加入成分后轻轻摇动锥形瓶以混匀；在加入 F-12 培养基后，使用 25 mL 移液管充分吹打混匀。</li>
	<li>将培养基分装为每份 10 mL，于 -80 °C 保存。分装后的培养基可在六个月内保持活性，不会显著损失。</li>
</ol>
2. 神经元培养用培养板的制备
<ol>
	<li>用无菌蒸馏水将聚-D-赖氨酸储备液（1 mg/mL，溶于0.5 M Tris缓冲液，pH 8）稀释至100 µg/mL。</li>
	<li>用于蛋白质组学或基因组学分析时，在解剖前一至两天，用约2 mL无菌的100 µg/mL聚-D-赖氨酸（PDL）包被6孔板。此步骤可确保细胞在孔板中的黏附。用保鲜膜包裹孔板，并在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>用于形态学分析和显微镜观察时，将12 mm2经预处理的德国玻璃盖玻片（可通过之前所述的硝酸处理法清洗18，或直接购买成品）放入24孔板的各孔中。
	<ol>
		<li>每孔加入0.3 mL无菌的100 µg/mL聚-D-赖氨酸（PDL）包被盖玻片。4 °C下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖当天，在开始解剖前，从各孔中移除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗孔板五次，再用低糖DMEM冲洗一次。</li>
	<li>在神经节进行酶消化过程中（细胞接种前约一小时），吸除孔板中的DMEM，替换为0.3 mL对照培养基。将孔板置于35.5 °C、5% CO2的加湿培养箱中保存。</li>
</ol>
3. 解剖设置
<ol>
	<li>制备 200 mL 用于解剖的培养基（以下简称解剖培养基）
	<ol>
		<li>在 193 mL 无菌 Leibovitz's L-15 培养基（或任何空气缓冲培养基）中加入 8 mL 的 20 mg/mL 无脂肪酸牛血清白蛋白（FAF-BSA）（含 1 mg/mL 葡萄糖）以及 2 mL 的 100 倍青霉素-链霉素溶液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净台内，准备以下解剖所需物品：四个装有约 20 mL 解剖培养基的无菌 50 mL 锥形离心管，四个装有 1.5 mL 解剖培养基的无菌 35 mm 培养皿，一个装有 20 mL 解剖培养基用于离心的无菌 50 mL 锥形离心管，一个用于离心神经节的无菌 15 mL 锥形离心管，以及一个用于收集解离细胞的无菌 10 mL 离心管。</li>
	<li>使用干珠灭菌器对一把精细镊子（4 号或 5 号镊子）灭菌至少一分钟。</li>
</ol>
4. 从胚胎大鼠幼崽中分离上颈交感神经节
<ol>
	<li>从妊娠大鼠体内取出E21胚胎 
	注意：如果周围区域已彻底灭菌，子宫角的切除可在超净台外进行。
	<ol>
		<li>使用 CO 处死怀孕大鼠2 吸入。剪除腹部区域的毛发，并用70%酒精擦拭该区域皮肤以消毒。</li>
		<li>使用一套新的无菌剪刀和镊子，剪开皮肤，然后剪开肌肉层，以暴露含有胚胎的子宫角。使用另一套新的剪刀和镊子，小心取出带有胚胎的子宫角，注意避免在此过程中损伤肠道。</li>
		<li>将带有胚胎的子宫角转移至150 mm2 无菌培养皿并转移至超净台内。</li>
		<li>使用一套新的镊子和剪刀，将胚胎从子宫角中取出，并分离胚胎与羊膜及胎盘。</li>
		<li>为处死胚胎，需在右臂下方沿中线剪断胚胎的脊髓。此操作还可减少摘取颈上神经节（SCG）过程中颈动脉的出血。</li>
		<li>将这些胚胎转移至已准备好的含有解剖培养基的50 mL锥形管中，确保胚胎完全浸没在培养基内。每管最多可容纳3个胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从胚胎中分离颈上神经节
	<ol>
		<li>将一只幼鼠从解剖液转移至无菌的150 mm培养皿中2 培养皿中装入半满的固体基质（石蜡或硅胶聚合物），将蛹的背侧置于基质上。使用三根无菌的23号针头，将蛹固定在培养皿中：两根针分别穿过双臂下方，第三根针穿过口腔，以小心地使颈部过度伸展。</li>
		<li>使用无菌精细镊子（4号或5号镊子）切开颈部区域的皮肤，暴露下方的唾液腺。用精细镊子将这些腺体移除。</li>
		<li>在锁骨附近定位胸锁乳突肌，在气管附近定位肩胛舌骨肌。首先剪断横行的胸锁乳突肌，然后使用精细镊子小心剪断较薄的肩胛舌骨肌。去除这些肌肉后，可在气管两侧看到颈动脉前端的分叉处，颈上神经节（SCG）位于颈动脉分叉的下方。</li>
		<li>使用闭合的镊子轻轻提起颈动脉以暴露颈上神经节（SCG）。用两把镊子分别夹住SCG两侧，将颈动脉连同组织一起拉出，并转移至预先准备好的无菌35 mm培养皿中2 培养皿。该组织很可能包含颈上神经节（SCG）及其伴行的颈动脉、迷走神经及其颈节，以及该区域的其他肌肉或脂肪组织片段。</li>
		<li>在另一侧重复解剖过程。在进行下述剩余解剖步骤之前，从所有胚胎中取出颈上神经节（SCGs）。将分离的组织分置于两个35 mm2 培养皿，以方便组织样本的处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SCG 的后期处理
	<ol>
		<li>为分离颈上神经节（SCG），首先使用精细镊子去除解剖组织中附着的多余组织（如脂肪或肌肉），注意避免触碰颈动脉分叉附近的区域。</li>
		<li>去除这些组织后，可观察到两个神经节。结状神经节较小，呈圆形，而颈上神经节呈杏仁形。轻轻牵拉迷走神经，以分离迷走神经与结状神经节和颈动脉之间的连接，然后将颈上神经节从颈动脉分离。</li>
		<li>使用精细镊子去除围绕着星状神经节（SCG）的囊膜。将SCG转移至新的35 mm培养皿中。对所有解剖得到的组织样本重复此操作。</li>
		<li>用无菌棉塞玻璃移液管蘸取解剖液，以防止组织黏附于移液管管壁。用该移液管将解剖液替换为 2 mL 无钙、无镁 HBSS 中的胶原酶 II 型（1 mg/mL）/分散酶 II 型（5 mg/mL），于 37 °C 孵育 50 分钟，以促进组织解离。 
		注意：不同批次的胶原酶/中性蛋白酶的消化时间可能需要优化，通常在40分钟至1小时之间。</li>
		<li>孵育期间，吸去培养板中的DMEM，替换为0.3 mL对照培养基。将培养板置于35.5 °C、5% CO₂条件下保存2 在湿化室中。</li>
		<li>孵育后，将胶原酶/分散酶中的背根神经节（SCGs）转移至无菌的15 mL锥形管中。用解剖培养基冲洗培养板，并将冲洗液转移至该管中。加入足够的解剖培养基，使总体积达到约10 mL。</li>
		<li>以 200 x 离心 g 在室温下以1000 - 1200 rpm离心5分钟，使样品形成沉淀。用移液器小心吸除上清液，注意勿扰动沉淀。用10 mL解离液重新悬浮沉淀。重复离心步骤，弃去上清液。</li>
		<li>更换为 1 - 2 mL 培养基。使用已预涂培养基的窄口弯头无菌巴斯德吸管，轻轻吹打 5 - 6 次，机械解离细胞团块。静置约 1 分钟，使较大的团块沉降。将上清液中的细胞悬液转移至新的 10 mL 离心管中。</li>
		<li>重复此过程3次，每次增加吹打力度，以确保颈上神经节（SCGs）几乎完全解离。每次吹打后，将上清液转移至一个10 mL离心管中，与第一次吹打所得上清液合并。</li>
		<li>加入足够的培养基，使总体积达到 8 - 10 mL。轻轻混匀细胞悬液，并使用血细胞计数板定量细胞密度。</li>
		<li>将细胞悬液按照实验所需的适当细胞密度分配至各孔中。在铺板过程中需持续混匀细胞悬液，以确保细胞均匀分布至各孔。 
		注意：进行形态学分析时，将细胞以每孔约8,000个细胞的密度接种于24孔板中；进行基因组和蛋白质组实验时，每孔接种细胞密度可高达30,000个细胞。</li>
		<li>将培养皿转移至底部装有无菌水的玻璃干燥器中，以形成一个加湿环境。注入足量的 CO2 （约120 mL）以获得5% CO2 在密封前，将培养板置于干燥器内的环境中，随后在35.5 °C下培养。此步骤在实验方案中称为第0天。 
		注意：这些培养板也可在常规的5% CO₂培养箱中保存。上述方法可最大限度减少温度和pH变化，并有助于防止交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 培养的 SCG 神经元的维持与处理
<ol>
	<li>在第1天（铺板后24小时），小心移除一半培养基，并加入含2 µM Ara-C（胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷，一种抗有丝分裂剂）的新鲜培养基。处理细胞48小时。通常，该时长的处理足以清除培养物中的非神经元细胞。</li>
	<li>在第3天，轻柔吸出一半培养基，并更换为对照培养基。</li>
	<li>在第4天，细胞即可用于实验处理。每隔一天用适当的培养基喂养细胞，轻柔地将孔中一半培养基替换为新鲜培养基。</li>
	<li>在无血清培养基中培养的SCG神经元仅延伸轴突。若实验需要树突的存在，可使用10%胎牛血清、75–100 µg/mL基底膜基质提取物或50 ng/mL骨形态发生蛋白-7处理细胞。处理后48小时内可观察到树突生长，一周内可观察到复杂的树突分支结构。</li>
</ol>
6. 对培养的 SCG 神经元进行免疫染色
<ol>
	<li>在通风橱中，将孔板中的细胞培养基逐渐替换为0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中含4%多聚甲醛的溶液。
	<ol>
		<li>移除孔中一半的培养基，并轻柔地加入4%多聚甲醛溶液。然后至少重复该步骤两次，每次移除孔中三分之二的液体，并补充等量的4%多聚甲醛溶液。此过程结束后，孔中液体颜色应由粉红色变为无色。</li>
		<li>当所有培养基完全被4%多聚甲醛替换后，在室温下孵育15–20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照上述类似操作，将4%多聚甲醛溶液逐步替换为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），静置5分钟。随后再用PBS洗涤孔板两次，每次5分钟。
	<ol>
		<li>完全移除4%多聚甲醛后，将培养板转移至实验台进行后续操作。此步骤为合适的暂停点，培养板可在4 °C条件下保存过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除全部PBS，加入足量含0.1% Triton X-100的PBS溶液以覆盖细胞，在室温下作用5分钟，以实现神经元的通透处理。该步骤的时间控制至关重要，需在保证良好染色效果的同时维持细胞结构完整性。</li>
	<li>小心吸除Triton X-100溶液，并用PBS洗涤孔板三次，每次5分钟。随后吸除PBS溶液。</li>
	<li>加入足量含5% BSA的PBS溶液以覆盖细胞，在室温下孵育20分钟，以减少非特异性抗体结合。</li>
	<li>吸除封闭液，替换为用含5% BSA的PBS稀释的小鼠抗MAP-2蛋白单克隆抗体。将一抗在4 °C条件下与细胞共孵育过夜。</li>
	<li>回收一抗并妥善保存以供重复使用。该一抗至少可重复使用两次而不影响检测信号强度。</li>
	<li>用足量PBS洗涤三次，每次覆盖细胞并静置10分钟。</li>
	<li>吸除PBS，替换为用含5% BSA的PBS按1:1000比例稀释的荧光标记山羊抗小鼠IgG二抗。在避光条件下室温孵育2小时。</li>
	<li>吸除二抗，替换为PBS。用PBS洗涤孔板三次，每次10分钟。最后用去离子水洗涤一次，以去除残留盐分。</li>
	<li>将盖玻片取出，置于载玻片上，滴加适用于荧光标记样本的水性封片剂，盖上盖玻片。将载玻片置于4 °C冰箱中的玻片盒内保存，待成像时使用。</li>
</ol>
7. 使用液相色谱-质谱联用技术分析蛋白质组的样品制备
<ol>
	<li>培养神经元的裂解
	<ol>
		<li>轻柔吸去孔板中的全部培养基，替换为冰冷的、无钙无镁的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。迅速移除并再次更换 PBS，静置 5 分钟。此步骤旨在去除培养基中可能存在的蛋白质。</li>
		<li>小心吸去某一处理组所有孔中的 PBS，重复该操作一次。在裂解细胞过程中，始终将孔板置于冰上，以尽量减少神经元损伤和蛋白降解。</li>
		<li>向其中一个孔中加入 100–150 µL 的 50 mM 碳酸氢铵缓冲液（NH4HCO3，pH 7.5），使用无菌细胞刮棒刮取细胞。用微量移液器转移液体，并对同一处理组的所有孔重复刮取操作。刮取后在显微镜下检查各孔，确保大部分细胞已被去除。
		<ol>
			<li>由于神经元数量较少，应使用有限体积的裂解液，以确保蛋白组学分析所需的足够浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将溶液于 -80 °C 冷冻过夜，以促进细胞裂解。此阶段的裂解液可长期保存，直至后续处理。</li>
		<li>解冻后，使用 26 G 或 28 G 针头将样品反复推注，以机械方式裂解细胞。</li>
		<li>将样品置于超声水浴中，每次超声 10 分钟，共两次。向水浴中添加冰块，防止样品过热及蛋白质变性。于 4 °C、12,000 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>测定蛋白浓度。典型的蛋白浓度范围为 0.4–1 µg/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白组分析的样品制备与胰蛋白酶消化
	<ol>
		<li>将最多 60 µL 裂解液或 50 µg 蛋白转移至无 DNase、RNase 和蛋白酶的 1.5 mL 离心管中。若裂解液体积不足 60 µL，可用 50 mM 碳酸氢铵补足体积。</li>
		<li>加入 25 µL 0.2% 酸不稳定表面活性剂，涡旋混匀。将离心管置于金属浴中，80 °C 孵育 15 分钟。于 12,000 x g 离心 30 秒。</li>
		<li>加入 2.5 µL 100 mM 二硫苏糖醇（DTT），涡旋混匀。此步骤有助于暴露蛋白的烷基化和消化位点。将离心管置于金属浴中，60 °C 孵育 30 分钟。冷却至室温后离心。</li>
		<li>向样品中加入 2.5 µL 300 mM 碘乙酰胺，涡旋混匀。此步骤用于烷基化半胱氨酸残基，防止其重新形成二硫键。将离心管避光、室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>按胰蛋白酶与蛋白质量比 1:10 的比例，加入质谱级胰蛋白酶（0.5 µg/µL）。于 37 °C 过夜消化样品。</li>
		<li>加入 10 µL 5% 三氟乙酸（TFA），涡旋混匀。于 37 °C 孵育 90 分钟。此步骤可水解酸不稳定表面活性剂，避免其在质谱分析中产生干扰。</li>
		<li>于 4 °C、12,000 x g 离心 30 分钟，将上清液转移至带有预切聚四氟乙烯/硅胶隔垫的色谱级透明玻璃小瓶中。样品可在 -20 °C 保存，待进行质谱分析。</li>
		<li>将样品小瓶进行液相色谱-高分辨质谱联用分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了从胚胎大鼠颈上神经节分离培养交感神经元的实验方案。采用该模型系统的优势在于可以获得一群同质的神经元，其对生长因子的反应具有一致性；并且由于这些神经元对生长因子的需求已被充分表征，因此可以在体外无血清的确定性培养基中培养这些神经元10。尽管本方案描述的是从E21大鼠胚胎中分离SCG的过程，但该方案同样适用于E17至E21阶段大鼠胚胎以及胚胎期小鼠SCG的解剖分离10,22,23。该解剖方案经过对初始步骤的微小修改后，也可用于出生后大鼠SCG的分离。这些修改包括无需剖宫产操作、使用二氧化碳对出生后动物实施安乐死，以及在转移至解剖培养基前，将安乐死后的大鼠幼崽浸入70%酒精中进行表面消毒10。该神经元培养方案还可结合Campenot培养室或微流控培养室，用于研究轴突导向、轴突运输及突触形成过程24...

源自胚胎颈上神经节（SCG）的交感神经元已被广泛用作一种原代神经元培养系统，用于研究神经元发育的多个方面，包括神经营养因子依赖性、神经元-靶细胞相互作用、神经递质信号传导、轴突生长、树突发育与可塑性、突触形成以及介导神经-靶细胞/神经元-胶质细胞相互作用的信号机制1,2,3,4,5,6,7,8,9。尽管其体积较小（每个神经节约含10000个神经元），但该培养系统得以建立并被广泛使用主要有三个原因：i）作为交感链中第一个神经节，其体积相对较大，因而比其他交感神经节更容易分离10；ii）与中枢神经元不同，SCG神经元具有较高的同质性，所有神经元均起源于神经嵴，具有相似的细胞大小、对神经生长因子的依赖性，并属于去甲肾上腺素能神经元，这使其成为形态学和基因组学研究的宝贵模型10,11；iii）这些神经元可在含神经生长因子的确定无血清培养基中维持超过一个月10,12。围产期SCG神经元已被广泛用于研究树突起始与维持的分子机制2。这主要是因为，尽管SCG神经元在体内具有广泛的树突分支，但在体外无血清条件下并不延伸树突，而可在某些生长因子（如骨形态发生蛋白）存在时被诱导生长树突2,12,13。
本文描述了分离和培养胚胎大鼠颈上神经节（SCG）神经元的实验方案。在过去50年中，SCG的原代神经元培养物主要用于形态学研究，而针对大规模基因组或蛋白质组变化的研究数量有限。这主要是由于组织体积较小，导致提取的DNA或蛋白质量较少，从而难以对这些神经元进行基因组和蛋白质组分析。然而，近年来检测灵敏度的提高使得研究人员能够开发出在树突生长发育过程中研究SCG神经元基因组、miRNome和蛋白质组的方法14,15,16,17。本文还将介绍利用免疫细胞化学对这些神经元进行形态学分析的方法，以及获取神经元蛋白提取物用于质谱分析的实验方案。

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 或 Nunc 平底细胞培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-2200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>胞嘧啶-&amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>D-磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - 低糖 + 谷氨酰胺 + 丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸游离型 BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td>以低糖 DMEM 配制 20 mg/mL 储存液</td></tr><tr><td>精细镊子 Dumont no.4 和 no.5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>解剖用镊子和剪刀</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 - 12 mm</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG Alexa 488 标记抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（无钙、无镁）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-硒-转铁蛋白（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>用于玻璃盖玻片的封片介质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 MAP2 抗体（SMI-52）</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子</td><td>Envigo Bioproducts（原 Harlan Bioproducts）</td><td>BT5017</td><td>以含 0.2% Prionex 的 DMEM 配制 125 &amp;mu;g/mL 储存液</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td><td>10% 溶液，100 mL</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 × 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 高分辨质谱仪</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸 - 测序级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 × 1 mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega 或 NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &amp;mu;g 或 5 × 20 mg</td></tr><tr><td>Waters 全回收小瓶</td><td>Waters Corporation</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

从胚胎颈上神经节培养大鼠交感神经元用于形态学与蛋白质组学分析

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

已采用大鼠胚胎颈上神经节（SCG）的交感神经元作为体外模型系统，用于研究外周神经元的轴突生长、轴突运输、突触形成、树突生长、树突可塑性以及在共培养系统中神经元与靶组织的相互作用。本方案描述了从E21大鼠胚胎颈上神经节中分离并解离神经元的操作步骤，继而进行无血清培养基中纯神经元培养物的制备与维持。由于神经元无法黏附于未包被的塑料表面，因此需将神经元培养于经多聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片或6孔板中。在使用抗有丝分裂试剂（Ara-C，胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷）处理后，本方案可获得健康神经元培养物，其中非神经元细胞比例低于5%，且可在体外维持超过一个月。尽管在体内大鼠胚胎SCG神经元呈多极形态，具有5–8个树突；但在无血清培养条件下，这些神经元在体外仅延伸出单根轴突，并在整个培养期间保持单极形态。然而，在存在基底膜提取物、骨形态发生蛋白（BMPs）或10%胎牛血清的情况下，这些神经元可被诱导出树突。此类均一的神经元培养物可用于免疫细胞化学染色及生物化学研究。本文还介绍了针对这些神经元中微管相关蛋白-2（MAP-2）的免疫细胞化学染色优化方案，以及用于质谱分析的神经元提取物制备方法。

分离和培养胚胎 SCG 神经元的神经元细胞 
将大鼠胚胎 SCG 的离体细胞接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养皿或盖玻片上，并在含有 β-神经生长因子的无血清培养基中进行培养。接种后，含有神经元和胶质细胞混合物的离体细胞呈圆形（图 1A）。接种后 24 小时内，神经元开始延伸出细小的轴突，胶质细胞则变扁平，在相差显微镜下呈现相位较暗的形态（图 1B）。经阿糖胞苷（Ara-C）处理后，99% 的胶质细胞被清除，培养物中主要为神经元细胞，其具有椭圆形的胞体、广泛的轴突生长，且无树突结构（图 1C）。
培养的大鼠胚胎颈上神经节神经元的免疫细胞化学染色 
既往研究表明，体外培养的交感神经元在无血清培养基中仅能延伸轴突，只有在基底膜提取物、10% 血清或 50 ng/mL 骨形态发生蛋白-7（BMP-7）存在时，才会形成复杂的树突分支结构...

本文描述了从大鼠颈上神经节中分离和培养胚胎期交感神经元的方法。同时提供了用于免疫细胞化学染色以及制备神经元提取物以进行质谱分析的详细实验方案。

来自胚胎大鼠颈上神经节（SCG）的交感神经元已被用作外周神经元的体外模型系统，以研究……

在本视频中，我们将演示如何培养胚胎大鼠的颈上神经节，用于形态学和蛋白质组学分析。在开始解剖之前，需准备好对照培养基和解剖用培养基。对照培养基包含F-12和低糖DMEM，添加胰岛素-硒-转铁蛋白混合物、谷氨酰胺、神经生长因子以及BSA。解剖液含有L-15培养基，添加青霉素-链霉素和牛血清白蛋白（BSA）。有关培养基制备的详细方案，请参阅原文。神经元培养用培养板的制备。用无菌蒸馏水将浓度为1毫克/毫升的聚-D-赖氨酸储备液稀释至100微克/毫升。用于蛋白质组学或基因组学分析时，解剖前一至两天，用约2毫升无菌的100微克/毫升聚-D-赖氨酸溶液包被六孔板。此步骤对于确保细胞在孔板上的贴附至关重要。用保鲜膜包裹培养板，并在4°C下过夜保存。在解剖当天、开始解剖前，从孔中移除聚-D-赖氨酸溶液，用无菌蒸馏水清洗孔内5次，随后用低糖DMEM清洗1次。在神经节进行酶消化过程中，大约在接种细胞前1小时，吸去培养板中的DMEM，并替换为0.3毫升的对照培养基。将培养板置于35摄氏度、5% CO2的湿化培养箱中孵育。在生物安全柜中准备以下解剖用物品：四个50毫升无菌锥形管，每管中加入约20毫升解剖培养基。四个无菌的 35 毫米培养皿，每个含有 1.5 毫升解剖液。一个无菌的 50 毫升锥形管，内含 20 毫升解剖液用于离心。一个无菌的 15 毫升锥形管用于离心神经节，一个无菌的 10 毫升试管用于收集解离的细胞。使用干珠灭菌器对一对精细镊子进行灭菌，时间不少于一分钟。涉及动物的所有实验操作均经加州圣玛丽学院机构动物护理与使用委员会批准。加州圣玛丽学院的动物护理与使用指南是根据美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室提供的指南制定的。从怀孕大鼠体内取出 E21 胚胎。注意，如果周围环境已彻底灭菌，可在超净台外进行子宫角的取出。通过吸入 CO2 处死怀孕大鼠。剪除腹部区域的毛发，并用70%酒精擦拭该区域皮肤以进行消毒。使用一套新的无菌剪刀和镊子，切开皮肤，然后切开肌肉，暴露含有胚胎的子宫角。使用一套新的剪刀和镊子取出带有胚胎的子宫角，注意在此过程中避免损伤肠道。将带有胚胎的子宫角转移至150毫米无菌培养皿中，并将其移入超净工作台。使用一套新的镊子和剪刀，从子宫角中取出胚胎，并将胚胎与羊膜和胎盘分离。为处死胚胎，需在右臂下方沿中线剪断胚胎的脊髓。这将减少去除星状神经节时颈动脉的出血。将这些胚胎转移至已准备好的含有分离培养基的50毫升锥形管中。确保胚胎完全浸没在培养基中。每支试管最多可容纳三枚胚胎。从胚胎中分离颈上神经节。将一只幼鼠从解剖液转移至已加入固体基质并半充满的无菌150毫米培养皿中，使其背侧朝向基质。使用三根无菌的23号针头，将果蝇固定在培养皿上，每根前肢下方各用一根针头固定，第三根针头穿过其口器，以小心地过度伸展颈部。使用无菌精细镊子切开颈部区域的皮肤，暴露下方的唾液腺。用精细镊子将这些腺体移除。在锁骨和气管附近分别定位胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌。首先，切断横行的胸锁乳突肌。然后使用精细镊子小心剪断较薄的肩胛舌骨肌。去除这些肌肉后，可在气管两侧观察到颈动脉前端的分叉，颈动脉分叉下方即为颈上神经节（SCG）所在位置。用闭合的镊子轻轻提起颈动脉，以暴露SCG。用两把镊子分别夹住SCG两侧，将颈动脉连同SCG一起取出，并转移至预先准备好的无菌35毫米培养皿中。该组织很可能包含颈上神经节（SCG）和颈动脉、带有结状神经节的迷走神经，以及该区域的其他肌肉或脂肪组织。在另一侧重复解剖过程。在继续进行后续解剖步骤之前，需取出所有胚胎的颈上神经节（SCG）。将分离的组织分配到两个35毫米培养皿中，以方便组织样本的处理。颈上神经节（SCG）的后续处理。为从解剖组织中分离SCG，请先用精细镊子去除任何多余的组织（如肌肉或脂肪），注意避免靠近颈动脉分叉区域。去除这些组织后，可观察到两个神经节。结状神经节较小且呈圆形，而颈上神经节（SCG）呈杏仁状。轻轻牵拉迷走神经，以分离迷走神经与结状神经节和颈动脉之间的连接，然后将颈上神经节从颈动脉上分离。使用精细镊子去除围绕着颈上神经节（SCG）的包膜。将SCG转移至一个新的35毫米培养皿中。对所有已解剖的组织样本重复此操作。使用解剖液包被已灭菌并带有棉塞的玻璃移液管，以防止组织黏附在移液管壁上。用该移液管将解剖液替换为2毫升无钙镁HBSS中的II型胶原酶和II型分散酶，于37°C孵育50分钟，以促进组织解离。请注意，不同批次的胶原酶/分散酶可能需要优化孵育时间，通常在40分钟至1小时之间。孵育结束后，将背根神经节（SCGs）和胶原酶/分散酶转移至一个无菌的15毫升锥形管中。用解剖培养基冲洗培养板，并将冲洗液转移至该管中。加入足够的解剖培养基，使总体积达到约10毫升。在室温下以200 × g、1,000至1,200 rpm离心五分钟，使样品沉淀。用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。用10毫升解剖液重新悬浮沉淀，重复离心步骤，然后弃去上清液。加入一到两毫升培养基。使用细口、弯头的无菌巴斯德吸管，先用培养基预润洗，然后轻轻吹打五到六次，机械解离细胞团块。静置约一分钟，待较大的团块沉降后，将上清液中的细胞悬液转移至新的10毫升离心管中。以逐渐增加的吹打力度重复此过程三次，以确保颈上神经节（SCGs）几乎完全解离。每次吹打后，将上清液转移至10毫升离心管中，与第一次吹打所得上清液合并。加入足够的培养基，使总体积达到8至10毫升。轻轻混匀细胞悬液，并使用血细胞计数板定量细胞密度。将细胞悬液按实验所需的适当细胞密度分配至各孔中。在接种过程中持续混匀细胞悬液，以确保细胞均匀分布到各孔内。进行形态学分析时，将细胞以每孔约 8,000 个细胞的密度接种于 24 孔板中；进行基因组和蛋白质组实验时，每孔接种密度可高达 30,000 个细胞。将培养板置于底部盛有无菌水的玻璃干燥器中，以形成加湿的培养环境。在密封之前，注入足够的 CO2（约 120 毫升），以在干燥器内形成 5% CO2 的环境。将培养板维持在 35.5 摄氏度。在本方案中，此步骤称为第 0 天。这些培养板也可置于常规的5% CO2培养箱中进行培养。上述方法可最大限度减少温度和pH值的变化，同时有助于防止交叉污染。SCG神经元的培养维持与处理。这些图片显示了颈上神经节细胞在第0天、第1天和第5天的分离状态。第0天的图像展示了细胞接种时的情况。第0天接种的细胞包含神经元细胞和非神经元细胞的混合物。第一天，铺板后24小时，小心移除一半培养基，更换为含2 µM阿糖胞苷（Ara-C，cytosine D-arabinofuranoside）的培养基，该物质为一种抗有丝分裂剂。将处理剂作用于细胞48小时。通常此处理时长足以清除培养物中的非神经元细胞。第三天，轻柔吸出一半培养基，并补充等量的对照培养基。第四天，细胞即可进行实验处理。每隔一天使用相应的培养基对细胞进行换液培养。轻轻替换孔中一半的培养基为新鲜培养基。第5天的图片显示有广泛的轴突生长，但未观察到树突生长。为诱导树突生长，可将神经元培养在Matrigel上，或用10%血清或50纳克/毫升骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7）处理。图2显示了E21大鼠颈上神经节（SCG）神经元在BMP-7处理后神经元形态的变化。10倍放大下的代表性相差显微照片显示，对照组神经元（A图）具有圆形的神经元胞体和轴突，而经BMP-7处理的神经元（B图）则出现多个短的树突样突起，箭头所示。经过适当处理的培养SCG神经元可用于形态学分析，也可通过免疫细胞化学染色进行基因组分析，以及蛋白质组学等生物化学研究。有关免疫染色及蛋白质组学分析样品制备的详细方案，请参阅相关论文。图三显示了培养的胚胎大鼠交感神经元中MAP-2蛋白的免疫染色结果。A至D图显示了用对照培养基处理的SCG神经元，E至H图显示了用50纳克/毫升BMP-7处理五天的神经元。C和G图为代表性显微照片，显示了微管相关蛋白-2的免疫细胞化学染色结果；D和H图为细胞核染色结果；B和F图为相差显微图像；A和E图为三个通道的合并图像。在C图中，对照组神经元的细胞体和近端轴突中可见微管相关蛋白-2的免疫细胞化学染色信号。在G图中，经BMP-7处理的神经元中，MAP-2蛋白的染色信号出现在细胞体和树突中。以下为一组用对照培养基处理的颈上交感神经节样本的检测结果，共检测到1,100种蛋白质。使用 Panther 数据库进行基因本体分析发现，大多数蛋白质位于细胞质中。然而，样本中也存在膜结合蛋白以及位于细胞连接处的蛋白质。该分析还显示，样本中检测到了参与多种神经元信号通路的蛋白质。综上所述，观看本视频后，您应能够分离并培养大鼠胚胎颈上神经节神经元，用于形态学和蛋白质组学分析。本研究由加州圣玛丽学院的教师发展基金和暑期科研项目资助。

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培养胚胎高级宫颈神经群中的大鼠交感神经元进行形态学和蛋白质学分析

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