利用血管成形术治疗的严重肢体缺血患者局部循环单个核祖细胞预测截肢风险

尽管血管成形术可改善重症肢体缺血患者的血流，但部分患者仍会进展至肢体截肢。与基于传统危险因素和内在血管特征的预后评估相比，局部MPC数量在预测内皮功能障碍和肢体截肢等临床结局方面更具预测价值。局部MPC数量是血管事件（如缺血性心脏病和下肢缺血）预后的潜在指标，在风险分层和预防干预中具有应用前景。

演示实验操作的人员包括 Eduardo Vera-Gomez、Alejandro Hernandez-Patricio、Carolina Aranda-Rodriguez、Juan Ariel Gutierrez-Buendia、Atzin Sua Ruiz-Hernandez、Mario Antonio Tellez-Gonzalez 和 Gabrielle Alexandra Dominguez-Perez。来自实验代谢与组织再生实验室的博士还包括 Gabrielle Hernandez-De Rubin 和 Oscar Antonio Loman-Zuniga。以上人员均来自血管外科部门。

为测定血管成形术前后的血流介导性舒张功能（FMD），使用血管线性探头测量患者肱动脉的直径。随后，将血压计袖带置于前臂测量部位上方，并充气至高于收缩压50毫米汞柱，维持5分钟后放气。在放气后60秒内再次测量肱动脉直径，并利用公式估算FMD。

根据Rutherford分级评估肢体缺血的临床严重程度，在选定的腹股沟部位将18号针插入血管，并在针上置入导引器。将一根柔韧的导丝推进导引器内，并更换为6 French导引器。在荧光透视引导下，注入造影剂以确定动脉走行及血管阻塞部位。

将两根0.014法式导引导丝和两根0.014法式支撑导丝引入血管，并将导丝推进至阻塞部位。接着，先引入一根5法式导管，再引入一根3法式导管，从最靠近血管阻塞处的部位采集10毫升血液。将样本置于冰上，并再次推进导丝。

导丝就位后，引入球囊扩张导管（其末端装有可充气球囊），并将球囊扩张导管推进至病变部位。将球囊抵住血管壁上的阻塞斑块进行扩张，并确认血流恢复。球囊扩张术后30分钟，将导管推进至最靠近血管阻塞的部位，采集10毫升血液。

然后，移除所有导丝，并给予适当的术后护理。血管成形术后两周，根据Rutherford分类评估肢体缺血的临床严重程度、静息痛缓解情况、缺血程度改善情况以及足部功能保留情况，并识别出因预后不良而需要接受大截肢的病例。采集后一小时内，将每份采集的血液样本各6毫升转移至新的15毫升离心管中，并用PBS按1:1比例稀释样本。

向三支试管中各加入2毫升密度梯度介质，然后向每支试管中加入等体积的稀释血液样本，加至不超过试管容量的四分之三。通过密度梯度离心法分离血细胞，并用移液器收集各管中分层界面处的细胞。将各份样本的细胞合并至一个15毫升离心管中，每次用2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，共洗涤六次。

最后一次洗涤后，将含有MPC的沉淀物按每份样品加入一毫升PBS重悬，用于计数，并根据每份样品所需的数量，将每管一乘以十的六次方个细胞加入相应数量的5毫升流式细胞术管中。通过离心使细胞沉淀，然后将每份细胞样品重悬于100微升感兴趣的抗体混合液中，涡旋10秒，随后在4摄氏度避光孵育20分钟。孵育结束后，使用同型匹配的对照抗体设定适当的前向散射和侧向散射门用于分析，并使用含有大量CD45和CD34阳性细胞的管来圈定NPCs门。

为了筛选双阳性免疫表型，创建新的图谱并设门圈定KDR、CD133和CD184阳性，CD34阳性，CD45阳性的细胞，然后设门以鉴定主要的MPC亚群。随后可将MPC的数量与基线FMD值、血管成形术后FMD的变化值以及需要下肢大截肢的患者比例进行相关性分析。在此代表性分析中，下肢血管成形术后30天，基线CD45阳性、CD34阳性、KDR阳性MPC的数量与FMD呈负相关。

然而，血管成形术后CD45阳性、CD34阳性、CD133阳性、CD184阳性的单核祖细胞（MPCs）的变化与FMD改善显著相关。在那些最终发展为肢体截肢的患者中，也观察到基线时CD45阳性、CD34阳性、KDR阳性的MPC亚群数量增加，以及血管成形术后CD45阳性、CD34阳性、CD133阳性、CD184阳性MPC细胞数量的减少。在进行血管介入时，务必从最接近血管阻塞部位的位置采集血液。